REACTIILE

ANTIGEN-ANTICORP pIII

REACTII ANTIGEN-ANTICORP CU COMPONENTE MARCATE

Marcarea componentelor de reactie:
 s permit detectarea unor cantit i infime de substan  s nu altereze capacitatea de legare a Ac la Ag corespunz toare  se monteaz pe suport solid (lame, pl ci din plastic)

Tehnici serologice cu componente marcate

Marcan ii utiliza i:


Fluorocromi (rodamina, fluoresceina): emit lumin ro u-oranj sau verde-galben la tratarea cu raze UV (Reac ia de Imuno-Fluorescen ) Coons,1942 Enzime (fosfataza alcalin , peroxidaza): capabile s modifice culoarea unui substrat (Reac ia Imuno-enzimatic ) Engwall i Perlman, 1972 Radio-izotopi (125 I sau 3H): emit raze gamma sau beta (Analiza Radio-Imun ) Zalow i Berson, 1960

Reac ia de imunofluorescen (RIF)

Metoda direct (IFD) (seroidentificare)
Se prepar un frotiu din materialul ce con ine Ag (material nativ, cultur pur , biopsie tisular ) Colorare cu ser conjugat Incubare n camer umed 20 min Spalare Examinare la microscopul cu fluorescenta

Metoda direct (IFD)

Reac ia de imunofluorescen (RIF)

Metoda indirect (IFI) (sero-identificare i sero-diagnostic)
Pe frotiul ce con ine Ag se aplic Ac specifici nemarca i Peste 20 min se spal preparatul Colorare cu Ac policlonali anti-Ig marcati fluorescent

Metoda indirect (IFI)

Reac ia de imunofluorescen (RIF)

Coons,1942

Reac ia de imunofluorescen (RIF)

Coons,1942

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Direct-Labeled Antibody

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Direct-Labeled Antigen

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Metoda sandwich (seroidentificare)

Ac cunoscu i sunt fixa i in godeurile placii Se adauga solu ia de Ag necunoscut Incubare1h Sp lare Se adaug Ac marca i cu enzime Incubare de 30 min-1h Spalare Adaugare substrat cromogen

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Metoda indirect ( serodiagnostic)

Antigene cunoscute se fixeaz pe un suport solid (micropl ci din material plastic) Se incubeaz cu dilu ii din serul de testat Se spal Se reincubeaz cu o anti-Ig marcat cu o enzim (fosfataza alcalin , peroxidaza) Se ad uga un substrat cromogen

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Reac ia Imuno-Enzimatic
(RIE, ELISA/Enzyme Linked Immunosorbent Assays)

Tehnica imunoblot (western blot)

(identificarea Ag sau ai Ac dintr-un amestec)
  

I etap electroforeza n gel a probei de Ag II etap transferul electric al Ag pe membrana de nitroceluloz III etap pe membran sunt aplica i succesiv: - Ac dirija i contra Ag - conjugatul marcat cu enzim Sp lare Se adaug substratul cromogen

western blot

western blot

RADIO IMUNO ANALIZA (RIA)

Marker de reactie izotop radioactiv (I125, P32). Detectarea activit ii radioactive contor de scintila ie (sesizeaz emisiile si

RADIO IMUNO ANALIZA (RIA)

Testul cantitativ pentru anticorpi
Suportul solid este standardizat prin legarea unui antigen nemarcat i o concentra ie standard pentru anticorp (marcat cu o substan radioactiv ) Proba (necunoscut ) care con ine anticorpul ce trebuie testat (nemarcat) se adaug la mediul de reac ie Concentra ia anticorpului n proba necunoscut este determinat prin citirea comparativ a valorilor pe o curb standard Curba este func ie de gradul de inhibi ie a leg rii anticorpului marcat combinat cu valorile dilu iilor n serie ale cantit ilor cunocute de anticorp nemarcat

RADIO IMUNO ANALIZA (RIA)

Testul cantitativ pentru antigene

Metoda de lucru este similar Excep ie: cand antigenul marcat este folosit pentru dozarea antigenului liber n prob

RADIO IMUNO ANALIZA (RIA)

Testul RAST (radioallergosorbent test)
Este o variant specializat a RIA utilizat pentru a m sura cantitatea de anticorpi IgE serici care reac ioneaz cu un alergen cunoscut