Sunteți pe pagina 1din 43

HISTOCHIMIE SI HISTOENZIMOLOGIE

METODA FROTIURILOR
 se

realizeaz intinderea celulelor n monostrat pe o lamel de sticl .  Pot fi examinate : 1. celulele sangvine 2. celulele epiteliale descuamate sau exfoliate 3. sedimentele celulare 4. amprente de esuturi sau organe parenchimatoase
2

TIMPII
 recoltare  ntindere:

se folosesc dou lame de

sticl  lama portobiect cea pe care se efectueaz frotiul  lama executoare cu care se ntinde frotiul , prin glisare la un unghi de 45r. 45r  uscare
3

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM




pentru colorarea frotiului sangvin.

May-Grunwald con ine MayEOZINAT DE ALBASTRU DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic i glicerin neutr 2. solutia Giemsa contine EOZINAT DE AZUR DE METILEN solubilizat in amestec de alcool metilic si glicerina neutra
1. solutia
4

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM


Frotiul trebuie sa fie :  sub ire cu un singur strat de celule  ntins uniform  ambele margini pe lama  se termin n franjuri pe lam , ocupnd ocup cca. 2/3 din aceasta  la margine se scrie numele pacientului sau un nr. de ordine
5

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM REZULTATE  nuclei violet  citoplasmele agranulocitelor albastru agra citoplasmele granulocitelor roz  granula ii: ii:  neutrofile ro u- violet  bazofile albastru nchis spre negru negru  eozinofile ro u portocaliu
6

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

METODA PANOPTICA PAPPENHEIM

HISTOCHIMIA
 interpretarea

biochimic a celulelor sau esuturilor n raport cu oranizarea lor celular . PRINCIPIU Se bazeaz pe afinitatea pe care o au unii coloran i pentru anumite grup ri chimice pe care vrem s le localiz m.
10

HISTOCHIMIA
 Substan

ele chimice celulare i tisulare se identific prin reac ii chimice care duc la ob inerea de compu i colora i , insolubili i observabili la M.O. analiz

 HISTOFOTOMETRIA =

cantitativ , n func ie de intensitatea culorii


11

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice




substan a analizat  s se conserve in situ ,  fixarea utilizat trebuie s conserve structura celulei i s mpiedice deteriorarea componentelor celulare  metoda folosit trebuie s fie specific pentru substan a sau grup rile chimice care vor fi examinate.
12

Conditiile minime necesare unei reactii histochimice


 produsul

de reac ie - insolubil previne dispersia sau difuzia produsului de reactie colorat permite examinarea histochimic trebuie s fie
13

 reactivul

specific.

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
 monozaharide

solubile
 oligozaharide  polizaharide

- libere sau combinate

cu proteine

14

HISTOCHIMIA GLUCIDELOR
 METODA PAS

( per-iodic acid per-

Schiff)  METODA CU CARMIN AMONIACAL BEST  BAZOFILIA  METACROMAZIA


15

METODA PAS
 eviden

ierea glicogenului, GAG, glicoproteinelor si glicolipidelor.

 PRINCIPIU

grup ri glicol oxidare cu acid periodic grup ri aldehidice + cu reactivul Schiff precipitat rosu violaceu vizibil la M.O.
16

METODA PAS- GLICOGEN


 specificitatea

metodei depinde de pretratamentul cu enzime glicogenolitice de tipul amilazei salivare. Se consider c structurile con colorate PAS care dispar n urma pretratamentului cu amilaz con in glicogen
17

METODA PAS

18

CARMIN AMONIACAL BEST




eviden iaz glicogenul - polimer cu solubilitate redus n ap . Daca fixarea lui nu este prompt , enzimele hidrolitice l descompun n glucoz care este foarte solubil n ap i difuzeaz . REZULTATE : granule ro ii n citoplasm
19

CARMIN AMONIACAL BEST

20

BAZOFILIA
 proprietatea

substan elor glucidice de a se colora cu coloran i bazici de tipul albastru alcian i albastru de metil. fi utilizat i pentru eviden ierea lipidelor i proteinelor cu caracter acid

 poate

21

ALBASTRU DE METIL

22

METACROMAZIA
 Capacitatea

unui substrat de a se colora ntr-o alt culoare dect cea a ntrdec colorantului.

 PRINCIPIU:

- existen a unor grup ri anionice aflate la o distan foarte mic una de alta form formnd agregate cu propriet i de absorb ie a luminii vizibile diferite de a moleculelor neagregate.

23

METACROMAZIA

24

HISTOCHIMIA LIPIDELOR


PRINCIPIU: colorantul trebuie s fie mai solubil n lipide dect n propriul solvent

SUDANOFILIA  Coloran i Sudan :  III ro u-portocaliu  IV ro u  B negru  BB albastru


25

COLORA II SUDAN

26

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
 detecteaz

structura primar a

proteinelor
 Reac

ii nespecifice proteinele celulare i tisulare sunt identificate pe seama aminoacizilor  Reac ii specifice folosite pentru identificarea heteroproteinelor
27

HISTOCHIMIA PROTEINELOR
Reac ii nespecifice


Tirozina Reac ia MILLON  Arginina Reac ia SAKAGUSHI pentru studiul distributiei proteinelor bazice in nucleu  Triptofan

28

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice




folosite pentru identificarea heteroproteinelor de ex. nucleoproteinele care se eviden iaz pe seama acizilor nucleici.

1. Metoda

FEULGEN 2. Bazofilia 3. Metoda BRANCHET


29

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice


 METODA FEULGEN

Molecula AND hidroliza acida dezoxiriboza + reactiv Schiff precipitat ro u-violaceu u30

METODA FEULGEN

31

HISTOCHIMIA PROTEINELOR Reactii specifice


METODA BRANCHET( verde metil-pironin ) metil cercetarea cercetarea

bazofiliei dat de acidul bazofiliei fosforic din structura acizilor nucleici

 verde

de metil are afinitate pentru ADN- nuclear ADN-ul nuclear pe care l coloreaz n verde  pironina ARN-ul nucleolar si ARNcitoplasmatic, citoplasmatic, pe care l coloreaz n ro u

32

HISTOCHIMIA ENZIMELOR


eviden iaz localizarea i activitatea enzimelor.


PRINCIPIU:

- reac ii chimice care au ca rezultat un compus

colorat i insolubil. In cazul n care produsul rezultat este solubil , se insolubilizeaza printrprintr-o reac ie de CAPTUR .
33

ETAPELE OB INERII UNUI PREPARAT CITOENZIMOLOGIC




recoltarea  fixarea prin congelarea rapid la temparaturi foarte joase  sec ionarea  incubarea ntr-un mediu care ofer ntrenzimei conditii ct mai apropiate de c cele n vivo.  montarea se realizeaza n mediu hidrosolubil glicerina sau sirop Apathy

34

REAC II CITOENZIMOLOGICE
 METODA PEARSEPEARSE-

eviden iaz

dehidrogenazele  METODA GMRY ( captura de ioni metalici)- evidentierea metalici) hidrolazelor

35

METODA PEARSE
 peroxidaze  Succinatdehidrogenaz

APLICA II PRACTICE - SDH enzima marker a mitocondriilor


36

METODA PEARSE

37

METODA GMRY( captura de ioni metalici)


 pentru

evidentierea fosfatazelor

 PRINCIPIU

o reac ie de precipitare a acidului acidului fosforic eliberat de enzim de la nivelul substratului


38

METODA GMRY
Compusul rezultat din ac iunea enzimei reac ioneaz cu: cu:  sulfura de amoniu pentru a produce un precipitat negru  sulfura de cobalt pentru hidrolaza alcalin  sulfura de plumb pentru cea acid

39

METODA GMRY
APLICA II PRACTICE - eviden ierea fosfatazei alcaline enzim cu rol de transport


40

METODA GMRY

41

42

43