Reactia de polimerizare in lant si aplicatiile ei

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Decembrie 2011

Definitie
PCR- sinteza exponentiala in vitro a unui fragment de ADN tinta.

Dr. Kary Mullis a descris tehnica pentru prima data in 1983 si a primit Premiul Nobel in Chimie in 1993.

Primul termen: polimerase

Denumirea de polimerase este datorata enzimei implicata in aceasta reactie: DNA polimerase.

Chain?
Chain- in lant, deoarece produsii primei reactii devin substrat pentru urmatoarea si pasul se repeta.

Componentele Reactiei: Reactiei:

1) ADN tinta - contine fragmentul ADN care trebuie amplificat. 2) Set de primeri- secvente de oligonucleotide, care incadreaza fragmentul care trebuie amplificat. 3) Amestec de dNTP deoxynucleotidetrifosfat. 4) ADN polimeraza termostabila- enzima care catalizeaza reactia. 5) Ioni de Mg++ - cofactor enzimatic 6) Solutie tampon mentine pH si taria ionica a amestecului de reactie astfel incat enzima sa actioneze.

Reactia

Tub PCR

THERMOCYCLER

1. Denaturarea ADN (~95oC)

2. Hibridizare primeri (~56oC)

3. Renaturare ADN (72oC)

2500000

DNA copies vs Cycle number

2000000

1500000

1000000

DNA copies

500000

0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Cycle number

Aplicatii ale reactiei

Clasificarea organismelor Genotipare Mutageneza Detectarea de mutatii Secventiere Detectarea patogenenilor Inginerie genetica Diagnostic prenatal

Aplicatii PCR
Identificare moleculara
Ex.: Clasificarea organismelor Epidemiologie moleculara Genotipare Diagnostic prenatal Mutation screening Detectarea patogenilor

Secventiere
Bioinformatica Clonare moleculara

Inginerie genetica
Mutageneza situs directionata Studii de expresie genica

IDENTIFICARE MOLECULARA:
Secventa ADN este unica pentru fiecare tip de organism Secventa ADN poate fi utilizata pentru identificarea unui organism

Oragismele pot fi identificate prin PCR . PCR permite manipularea relativ usoara a ADN.

METODE DE IDENTIFICARE MOLECULARA: 1. RFLP 2. RAPD 3. AFLP 4. MLPA 5. Detectare patogeni 6. Genotipare 7. Secventiere 8. Clasificarea organismelor

RFLP- Restriction fragment length polymorphism, tehnica care exploreaza diferenta dintre secvente de ADN omoloage.
Etape: PCR- digestie cu enzime de restrictie- gel electroforezainterpretare.

RAPD- Random amplification of polymorphic DNA, tehnica prin care fragmente de ADN sunt amplificate aleator random, rezultand un profil semi-unic al reactiei.

AFLP- Amplified fragment length polymorphism

Etape: restrictie enzimatica pentru digestia ADN genomic - ligarea adaptorilor la capetele coezive ale fragmentelor de digestie. Amplificarea unui subset din fragmentele de restrictie.

MLPA- Multiplex ligation-dependent probe amplification este o varianta a unei reactii PCR multiplex.

Etape ale reactiei MLPA

Detectarea de patogeni
Reactie PCR pozitiva

Prezenta patogenului

O proba ADN care poate contine agenti patogeni

Reactie PCR negativa

Absenta patogenului

Detectare de patogeni

Senzitivitatea reactiei PCR-amplificarea M. tuberculosis DNA.

Genotipare cu markerii STR

Repetitiile scurte in tandem (short tandem repeat) - repetitii de 2 pana la 5pb, ex. (CATG)n intr-o regiune genomica noncodificatoare. Polimorfismele STR (STRP) se produc cand loci omologi difera ca numar de repetii. Prin identificarea repetiilor unei secvente cunoscute intr-un locus specific se poate creea profilul genetic al unui individ.

SECVENTIERE - determinarea ordinii nucleotidelor intr-un fragment ADN.

-metoda dezvoltata de Sanger (1958, 1980) Nucleotide (dNTP) Dideoxynucleotide (ddNTP) Dupa incorporarea unei ddNTP, numai are loc polimerizare!

Fragmente ADN de diferite dimensiuni care difera printr-o nucleotida Nucleotidele pot fi sau

Gel de secventiere clasic

Identificarea de mutatii prin secventiere

Clasificarea organismelor
1) Inrudirea dintre specii * Fosile 2) Similaritati 3) Diferente * Cantitati mici de tesut * Organisme mici Date insuficiente

! ADN !

Pe scurt...
Manipularea fragmentelor ADN amplificate
Digestie enzimatica, Secventiere...

Sursa ADN
sange, chorionic villus, fluid amniotic, par, saliva

Fragmente ADN dorite in cantitate mare 68,719,476,736 copii

Concluzii
PCR este o tehnica rapida, relativ usor de utilizat, caracterizata de senzitivitate si specificitate, care a revolutionat biologia moleculara.

PCR este tehnica cu un spectru larg de utilizare in cercetare si cu aplicabilitate in diagnostic.