O ensaio de microncleo em clulas bucais como uma ferramenta para biomonitoramento de danos ao DNA: A perspectiva do projeto HUMN sobre

o status atual e lacunas de conhecimento

INTRODUO
O projeto ser humano microncleo (HUMN) (http://www.humn.org), criada em 1997, um programa de colaborao internacional que visa estudar a frequncia de microncleos (MN) em populaes humanas, e avaliar os efeitos do protocolo e critrios de pontuao e os valores obtidos O foco inicial do projeto foi a anlise de MN em linfcitos perifricos de indivduos no expostos e expostos.

Os principais objetivos do projeto HUMN so para padronizar metodologias, definir ndices frequncia base MN, caracterizam os efeitos de fatores demogrficos, genticos e metodolgicas sobre estas freqncias, e para determinar se as freqncias MN em diferentes tecidos so preditivos de risco de cncer

Estes objetivos foram atingidos por linfcitos, fornecendo uma descrio detalhada dos critrios de pontuao e pela avaliao de fontes variabilidade para o ensaio MN bloco citocinese atravs de uma esforo de validao realizado por 34 laboratrios de 21 pases

Mais recentemente, os resultados da anlise prospectiva do banco de dados de mais de 6.700 indivduos de 20 laboratrios representando 10 pases, confirmou que uma elevada freqncia MN em linfcitos humanos preditiva de um aumento no risco de cncer

Dano genmico provavelmente o mais importante fundamentais causa da doena de desenvolvimento e degenerativas. A coleta de clulas bucais sem dvida o menos invasivo mtodo disponvel para medir o dano ao DNA em humanos, especialmente em comparao com a obteno de amostras de sangue para linfcitos e ensaios de eritrcitos, ou bipsias de tecidos.

O protocolo do ensaio no foi padronizado de tal forma que os resultados de diferentes laboratrios podem ser facilmente comparados ou combinados. O projeto HUMN um veculo eficaz para o desenvolvimento e implementao de uma validao de colaborao internacional esforo para reunir as diversas bases de dados MN bucal, e identificar e quantificar as principais variveis que afetam este biomarcador.

Fig 1. Aumento do nmero de laboratrios e publicaes que relataram o uso de o ensaio de MN em clulas bucais.

OBJETIVOS
Fornecer uma viso geral do situao atual do ensaio MN em clulas bucais Identificar os mais importantes lacunas de conhecimento na biologia bsica que afetam a expresso do MNI e outras anormalidades nucleares Comparar as foras e as limitaes dos atuais tcnicas para a coleta, colorao, e pontuao de clulas bucais.

2. Medio MN em clulas esfolia das bucal: uma breve histria e a razo

Microncleos se originam a partir de fragmentos do cromossomo ou a totalidade cromossomos que ficam para trs em anfase durante diviso nuclear O ndice de MN em roedores e / ou clulas humanas tornou-se um dos pontos de citogentica padro final e biomarcadores utilizados em toxicologia gentica in vivo ou ex vivo

Nos seres humanos, MNI pode ser facilmente avaliado em eritrcitos, linfcitos e esfoliada epiteliais clulas (por exemplo, oral, urotelial, nasal) para obter uma medida do genoma danos induzidos in vivo. Clulas bucais so a primeira barreira para a inalao ou ingesto rota e so capazes de metabolizar carcingenos a prxima produtos reativos.

Pode-se argumentar que as clulas epiteliais orais representam um stio de destino preferido para o incio eventos genotxicos induzidos por agentes cancergenos que entram no organismo por inalao e ingesto.

Fig. 2. Estrutura e diferenciao do epitlio oral. (A) Fotomicrografia da seco atravs da mucosa oral saudvel mostrando as vrias camadas de clulas do epitlio oral. O epitlio oral um epitlio escamoso estratificado. composto de cinco camadas: (i)queratinizado camada na superfcie, (ii) camada de clulas prickle (ou camada espinhosa), (iii)camada basal (ou basal estrato), (iv) rete pinos, (v) da lmina prpria (tecido conjuntivo). Reproduzido dehttp://www.eastman.ucl.ac.uk/cal/ulcerspath/healthy.htm com a permisso de a Eastman Dental Institute. (B) Esquema de camadas de clulas bucais mucosa e volume de negcios.

Fig. 3. Bucal ensaio MN modelo cytome. Diagrama esquemtico de diferentes tipos de clulas bucais e os possveis

Nos estudos iniciais da dcada de 1980, as clulas MO foram usadas para avaliar os efeitos genotxicos de nozes de btele e quids e de tabaco de mascar . A maioria dos estudos mostrou maior MN freqncias no local dentro da cavidade oral, onde o quid ou mistura de tabaco foi mantida em comparao com o site de controle opostos,.

O ensaio de MN em clulas bucais tambm foi usado para estudar cancerosas e leses pr-cancerosas e controlar os efeitos de uma srie de agentes quimiopreventivos Exposies ambientais e ocupacionais, radioterapia, quimiopreveno, os ensaios de suplementao de vitamina estilo de vida, hbitos, cncer e outras doenas.

BIOMONITORAMENTO
Significativamente freqncias mais elevadas de MN tambm tm sido observados em clulas esfoliada bucais de pessoas expostos a solventes orgnicos, agentes antineoplsicos, derivados de diesel, hidrocarbonetos aromticos policclicos, tintas contendo chumbo e solventes, e beber gua contaminada com arsnico

Estudos recentes tm sugerido tambm genotoxicidade e citotoxicidade Resultados negativos tambm foram obtidos em indivduos expostos ao cromo, xido de etileno, nquel, benzeno e outros produtos qumicos

3.2. MN e radiao
A radiao ionizante tem um papel importante no tratamento de neoplasias muitos, mas tambm produz danos genticos. como um conseqncia, tumores secundrios podem desenvolver anos aps a tratamento do tumor primrio.

O aumento mais marcante em danos citogenticos (150 300 MN/1000 clulas) foi observada em um estudo inicial de trs pacientes expostos a uma dose cumulativa de 3400-4000 cGy Moore et al. aprofundou no estudo no qual um aumento de mais de 16 vezes MN na freqncia foi observada logo aps o incio a radioterapia, seguido pelo retorno aos valores basais 12 semanas e 3 semanas depois cessao do tratamento.

3.3. Freqncias MN em clulas bucais de pacientes com cncer e outras doenas

Vrias publicaes relataram freqncias MN em pacientes com DNA deficincias reparao com resultados variados. Por exemplo, os pacientes com sndrome de LouisBar no tinha elevada frequencia de MN enquanto ambos Ataxia Telangiectasia e sndrome de Bloom exibiu instabilidade genmica aumentada nos pacientes (homozigoto), em comparao a indivduos heterozigotos

3.4. Fatores de estilo de vida e de acolhimento

Uma srie de micronutrientes, incluindo beta-caroteno e outros vitaminas, foram mostrados para diminuir significativamente os nveis de MN (1,4-4 vezes) em usurios de tabaco saudvel, bem como em indivduos com leses pr-cancerosas Um estudo de fumantes pesados no Holanda encontrou uma diminuio estatisticamente significativa na MN freqncia quando N-acetilcistena foi administrada como quimiopreventivo agente

Aspectos metodolgicos que afetam a identificao de MN

Diferenas na coleta de clulas (calendrio e instrumentos utilizados) de fixao, colorao e tcnicas, seleo e nmero de clulas contadas, e os critrios de pontuao para a MNI e outros anomalias nucleares em clulas normais e degenerados.

4.1. Coleta de clulas bucais

Esfoliada clulas da mucosa bucal podem ser coletados usando uma madeira lngua depressor, esptula de metal, ou uma escova cytobrush umedecido com gua ou tampo para cotonete ou raspe a mucosa do interior revestimento de uma ou ambas as faces. Alguns estudos tm utilizado palitos ou escovas de dentes

4.2. Preparao da lmina e colorao

Em muitos estudos MN, esfregaos de clulas bucais foram preparados por espalhar as clulas em uma lmina limpa. Em uma srie de estudos do escova cytobrush usado para coletar clulas bucais foi abalada em um tubo de ensaio contend osoluo salina 0,9% para liberar as clulas, e o tubo ento centrifugado a lavar as clulas em soluo tampo

Fixadores comumente usados incluem 80% de metanol, absoluta etanol, ou metanol-glacial mistura de cido actico.

5.5. critrios de pontuao

necessrio padronizar a pontuao para minimizar diferenas interlaboratorial. Estes critrios devem ser projetados para permitir (a) a classificao fcil e imparciais sobre os vrios tipos celulares, conforme descrito na fig. 3.

Protocolo com isolamento de linfcitos

0hr
CBMN

0hr

48hr 72hr
+ Cit-B

Fenech 2007 - Nature Protocols

MNi

bud

Coleta de sangue Isolamento dos linfcitos

1 CBMN CBMN

ponte

apoptose necros e

CBMN

CBM N

Cultura de linfcitos

CBMN

5.6. Nmero de clulas para ser marcado

Atualmente, a maioria dos relatrios publicados utilizar clulas 1000-3000.

permisso de Fenech et al. [3]. MN frequncia em humanos linfcitos foi avaliada por 51 artilheiros de 34 laboratrios em 21 pases. Clula culturas foram estabelecidos utilizando sangue perifrico de um doador e irradiados com 1 ou 2 Gy de raios gama. Local est se referindo a duas reas separadamente rodada marcou para cada slide. Mtodos de colorao e os critrios de pontuao so descritos em detalhes no Ref. [3]

Fig6. Fatores que afetam a variabilidade de pontuao quando MN em linfcitos humanos. Reproduzido com a