Tehnologia ARN de interferen

Noiembrie 2010

Tehnologia ARN de interferen

Inactivarea genelor dependent de omologie, care implic un ARN dublu catenar direc ionat spre gena vizat sau spre regiuni din promotorul acesteia. Prin aplicarea acestei tehnologii poate fi controlat expresia oric rei gene ntr-o manier foarte specific , f r afectarea expresiei altor gene. ARN dublu catenar poate fi introdus n plante fie temporar, prin inocularea plantelor cu ARN viral, fie stabil, prin integrarea unor transgene care, transcrise, determin producerea lui. n primul caz, pot fi descoperite func iile unor gene. n al doilea caz, poate fi blocat expresia unor gene specifice n vederea cre rii unor noi variet i.

Inducerea silen ierii genelor cu structuri n form de ac de p r

Construc iile ARNi cu structuri sub form de ac de p r sunt f cute prin clonarea genei vizate sau a unor p r i din aceasta n orientarea sens i antisens separate de un intron. Dup transcrip ie se formeaz ARN dublu catenar, care este recunoscut de o endonucleaz specific pentru ARN dublu catenar, care l cliveaz n molecule de ARN interferante mici(ARNim), Aceste monocatene de ARN sunt ncorporate ntr-un complex multiproteic numit RISC (RNA-induced silencing complex), care interac ioneaz cu ARNm pe baza omologiei secven ei int inhibnd expresia genei respective. Are deci rol important n reglarea posttranscrip ional prin silen ierea ARN. ARN interferant mic omolog cu secven e din promotor induce silen ierea transcrip ional (RNA-induced transcriptional gene silencing complex = RITS), rezultnd metilarea secven elor din pomotor i blocarea transcrip iei resulting in the methylation of the promoter sequences.

Tehnologia ARN de interferen

Folosind construc ii sub forma unui ac de p r, ARN dublu catenar poate fi exprimat n plante relativ u or, permi nd ca acest tehnologie s fie aplicat la o gam variat de specii pentru blocarea expresiei att a genelor endogene specifice ct i a genelor patogenilor care le invadeaz . ARN de interferen poate fi folosit pentru modificarea c ilor metabolice n scopul supraprodu iei unor produ i secundari cu beneficii pentru s n tate, produc ie i mediu. Aplicarea silen ierii genelor esut-specific sau inductibil , prin utilizarea promotorilor adecva i i capacitatea de a silen ia mai multe gene simultan ar permite crearea unor noi nsu iri plantelor.

ARNi i ARM mi
ARN de interferen =ARNi (interference RNA=iRNA). Mecanism natural de reglare a expresiei genelor prezent la toate organismele eucariote. Const n silen ierea posttranscrip ional a genelor prin intermediul ARN dublu catenar cu secven specific , care degradeaz ARNm corespunz tor. ARN dublu catenar ce poate fi exogen (n cazul infec iei cu virusuri cu genom ARN) sau endogen (originar din celul ). Are structur , biogenez i mecanism de func ionare similare cu ARNmicro. Principala deosebire const n faptul c ARNmicro se formeaz din transcrip i endogeni care pot forma structuri locale sub forma unui ac de p r, n timp ce ARN de interferen se formeaz din transcrip i ARN dublu catenari lungi, perfect mperechea i, exogeni sau endogeni. ARN micro=ARNmi (micro ARN=miRNA). ARN monocatenar, neinforma ional (care nu codific ), lung de aproximativ 22 de nucleotide, care este generat de enzime ribonucleaze de tip III DICER dintr-un transcript endogen ce con ine o structur local sub forma unui ac de p r. Ac ioneaz ca un regulator negativ al ARNm int .

ARNi i ARM mi
Silen ierea posttranscrip ional care determin clivarea ARNm ARNm endogen este inactivat de ARNmicro care se mperecheaz cu ARNm specific determinnd fie clivarea fie blocarea transla iei Silen ierea transcrip ional a ARN este asociat cu metilarea secven specific a ADN, care blocheaz transcrip ia. ARN de interferen intervine nu numai n fenomenul de silen iere a genelor ci este i un mecanism str vechi de protec ie a gazdei i a genomului acesteia de virusuri i de elemente genetice transpozabile, care utilizeaz n ciclul lor de via ARN dublu catenar.

Utilizarea ARNi pentru modificarea metabolismului plantelor

Caracterul
Brunificarea enzimatic Cre terea acidului stearic (44% fa de 2%) i oleic (77% fa de 15%) Alergie Reducerea cafeinei

Gena
Silen ierea genei pt. polifenil oxidaza Silen ierea a dou enzime cheie n biosinteza acizilor gra i Silen ierea unor proteine din polen Silen ierea unei enzime implicate n biosinteza cafeinei Silen ierea unei gene implicate n dezvoltarea petallelor Silen ierea unei gene implicate n ramificarea amidonului Silen ierea unei gene reglatoare a fotomorfogenezei Silen ierea genei pt. arsenic reductaza

Planta
cartof Rapi a

Beneficiu
Prelungirea duratei p str rii Uleiul se folose te la g tit f r hidrogenare Iarb hipoalergic Cafea decofeinizat

Lolium cafea

Reducerea sau absen a petalelor Calitatea porumbului

rapi a

Ameliorarea fotosintezei

porumb

Cre terea cu 50% a con inutului n amiloz S n tatea consumatorilor

Sporirea con inutului de carotenoizi i flavonoizi Cre terea absorb iei arsenicului

tomate

Arabidopsis

Fitoremedierea solului

Utilizarea ARNi pentru ob inerea plantelor rezistente la virusuri

Virusul
Virusul Y al cartofului

Regiunea vizat
Constr. sens i antisens pentru gena componentei helper a proteinazei Structr ac de p r pt reg. Intragenic necodificatoare Protein asociat replic rii Secven arbitrar

Rezultatul
Imunitate

Planta
Cartof

Genomul viral
ARN

Virusul mozaicului african al casavei Virusul mozaicului tutunului Virusul mozaicului lucernei Virusul tutunului

ns n to irea dup infec ie Inhibarea replic rii ns n to irea dup infec ie Nu au ap rut simptome specifice infec iei virale Blocarea infec iei virale

Vigna mungo

ADN

Tutun Tutun

ARN ARN

Secven

arbitrar

Tutun

ARN

Virusul marmor rii ardeiului

Secven

arbitrar

Tutun

ARN