APOPTOSIS CELULAR Death comes for the Cell

Dra : Elizabeth Parada

Muerte celular programada

MUERTE CELULAR PROGRAMADA ES UN PROCESO INDUCIDO Y ORDENADO EN EL CUAL LA CELULA PARTICIPA DE FORMA ACTIVA PARA CONSUMAR SU MUERTE

Fases de la apoptosis
1. Decisin 2. Ejecucin 3. Fagocitosis 4. Degradacin y presentacin antgenos

Activacin de receptores Desequilibrio entre factores inductores e inhibidores

Temprana: Activacin de proteasas y endonucleasas Intermedia: Intermedia: Fragmentacin DNA Tard Tarda: Emisin de cuerpos apoptticos

Deteccin de fosfatidil serina PS Evita liberacin de componentes intracelulares inflamacin TGF F

Muerte celular programada

La muerte celular es una caracterstica importante del desarrollo de todos los organismos multicelulares. 1-Durante la vida fetal 2.-En la homeostasis de linfocitos despus de su activacin antignica 3.-Eliminacin de timocitos de potencial autorreactivo- seleccin negativa 4-Eliminacin de clulas T incapaces de reconocerlo propio- seleccin positiva

Caspasas
Son cistein proteasas especficas de aspartato (caspase) - Se expresan como proenzimas (zimgenos) - Presentan 3 dominios: Asp Subunidad larga ( contiene centro activo) Asp

MECANISMOS DE ACTIVACIN
1. Activacin por otra caspasa 2. Activacin inducida por proximidad 3. Asociacin con una subunidad

reguladora

VAS DE INDUCCIN DE APOPTOSIS

Va extrnseca o va de los receptores de muerte Va intrnseca o va de la mitocondria

VA EXTRNSECA
- A travs de receptores superficiales: receptores de muerte. Receptores de la familia de TNFR: CD95, TNFR1, TNFR2. Tb DR3, TRAIL... Requiere trimerizacin para la transduccin de la seal. Al receptor activado se le asocia un complejo de protenas: dominio de sealizacin inductor de muerte (DISC, death-induced signalling domain)

VA EXTRNSECA

VA INTRNSECA
- La regulacin de la apoptosis en esta va es debida a la familia de Bcl-2. Bcl-2 fue descubierto como un proto-oncogn en el linfoma folicular de clulas B y es homlogo a ced-9. Existen 19 miembros que se dividen en tres grupos. Cada miembro posee al menos uno de los cuatro motivos conservados denominados dominios de homologa con Bcl-2 (BH): BH1-BH4.

FAMILIA DE Bcl-2
1. Grupo I: - Actividad anti-apopttica - Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w... - 4 motivos BH: BH1-BH4 - Cola hidrofbica en el C-terminal 2. Grupo II: - Actividad pro-apopttica - Bax, Bak, Bok... - Carecen de BH4 3. Grupo III: - Actividad pro-apopttica - Bid, Bik, Bad, Bim... - Slo poseen el dominio BH3 - Pueden o no tener regin transmembrana

Va Mitocondrial

Integracin de las dos Vas

Muerte celular programada

Dependiendo del tipo celular y de induccin de muerte se activaran diferentes seales La muerte real de la clula comprende la activacin de un grupo especializado de proteasas, las caspasas EJ: Regulacin de los Linfocitos T

Muerte de Clulas T
L a muerte mediada por Fas/fasL conduce a la muerte de la clula en dos a cuatro horas La seleccin negativa inducida por TCR conduce a a muerte en ocho a 10 horas

Muerte de Clulas T
La accin final de las caspasas efectoras son: Activacin de endonucleasas Degradacin de la laminita en la matriz nuclear Degradacin de la actina en el citoesqueleto

Funciones ms importantes de la apoptosis

.- Eliminacin de tejidos daados o infectados .- Desarrollo. .- Homeostasis. - Regulacin del sistema inmunitario

Patologas Vinculadas con la Apoptosis

El cncer, malformaciones, trastornos metablicos, neuropatas, lesiones miocrdicas y trastornos del sistema inmunitario, Etc

Enfermedades asociadas a la inhibicin de la Apoptosis

Cncer: linfoma no Hodgkin folicular (Bcl-2 +), carcinoma (p53 +), tumores hormonodependientes Enfermedades autoinmunitarias: lupus eritematoso sistmico, glomerulonefritis autoinmunitaria

Infecciones virales: Herpesvirus, Poxvirus, Adenovirus

Enfermedades asociadas a un Aumento de la Apoptosis

Sida Enfermedades neurodegenerativas: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrfica, retinitis pigmentosa, degeneracin cerebelosa Sndromes mielodisplsicos (MDS): anemia aplsica Dao isqumico: infarto de miocardio, apopleja, dao por reperfusin, dao heptico por alcoholismo .

Regulacin de la apoptosis
Los miembros antiapotosicos se dimerizan con los pro-apoptosicos y bloquean su actividad La segmentacin de Bid: Catalizada por la caspasa 8 generada por la va Fas puede activar la va mitocondrial

Regulacin de la apoptosis
Protena p53 el guardin del genoma Estrs citotxico, radiacin Acta mediante transactivacion de los genes diana Su accin es fundamentalmente regulando la progresin del ciclo celular

APOPTOSIS
- Caractersticas definidas Regulada genticamente

- Conservada en la evolucin - Muy regulada: patologas - Inducida por seales externas e internas

Metodologas de LAB asociadas al estudio de muerte celular

Entre ellas, las ms utilizadas son: El uso de fluorocromos capaces de intercalarse en el ADN que permiten visualizar, gracias a la ayuda del microscopio, la morfologa de la cromatina. Estos colorantes, como el etidio, propidio y hoechst, son utilizados con frecuencia en citometra de flujo

Metodologas de laboratorio La microscopia electrnica que permite la visualizacin en detalle de la cromatina sin necesidad de tincin especfica

Metodologas de laboratorio
La electroforesis en gel de agarosa de ADN aislado de tejidos o de cultivos celulares que, teidos con colorantes como el yoduro de etidio, permiten el anlisis de la integridad del genoma. La tincin TUNEL, basada en la capacidad que presentan los extremos del ADN hidrolizados por la endonucleasa a unirse a una cadena de dioxigenina dUTP.

Metodologa de laboratorio El marcaje de fostatidilserina en el lado extracelular de la membrana citoplasmtica con la protena anexina V.

Cuantificacin de la apoptosis
Anlisis de sub.-G1 : Tomar 1-5105 clulas y centrifugar (se pueden centrifugar slo 2 min., a 2000 g).Lavar con PBS a 4C.Resuspender en 100 l de PBS. Aadir 900 l de etanol al 70% fro mientras se agita en Vortex el tubo. Incubar al menos 5 min. a 4C. (aqu se puede dejar varios das) Centrifugar. Lavar con 2 ml de PBS. Resuspender en 250 l de PBS. Aadir 250 l de solucin de extraccin de DNA: 190 ml Na2HPO4 0,2 M, 8 ml Acido Ctrico 0,1 M, pH 7,8Incubar 10 min a 37C. Centrifugar. Preparar solucin de PI/RNasa para todos los tubos: PBS + 100 g/ml RNasa + yoduro de propidio 40 g/ml Resuspender en 250 l de solucin de PI/RNasa. Incubar 30 min a 37C en oscuridad. Analizar en citmetro en FL2-FL3.

Medidas de despolarizacin mitocondrial

Liberacin de citocromo c: Con esta tcnica se determina la cantidad de Citocromo C liberado de las mitocondrias al citosol. La determinacin se realiza mediante inmunodeteccin (Western Blot)

Avances teraputicos
Frmacos inhibidores de la sntesis de protenas que previene a las clulas frente a determinados estmulos. Frmacos que bloquean los incrementos descontrolados de Ca. Frmacos antioxidantes o en moduladores de la trascripcin.

Avances teraputicos
Enzimas degradadoras, destacando algunos tetrapptidos sintticos inhibidores de caspasas La activacin de los receptores de muerte para inducir apoptosis en clulas cancerosas. Que inician la apoptosis de forma independiente a la protena p53, que se encuentra mutada en ms de la mitad de los cnceres.

What is new new??????

EMAP II: A Cytokine Regulated by Apoptosis

Endothelial monocyte-activating polypeptide II (EMAP II) is a proinflammatory cytokine and a chemoattractant for monocytes. Scientists at the Max Planck Institute for Physiological and Clinical Research (Bad Nauheim, Germany) have demonstrated a regulatory role for apoptosis in the processing of the EMAP II precursor to the biologically active form, implicating EMAP II in the attraction of monocytes to sites of apoptosis.

"Nadie sabe qu es la muerte y, aunque nadie sabe si de que se trata.. , todos le temen como si supieran con certeza que es el ms grande de todos los males el ms grande de los Bienes