1 Estudo Dirigido

Disciplina: Reatores Bioqumicos

Introduo
Pectinases
Enzimas que atuam sobre a pectina polissacardeo constituinte da parede celular dos vegetais. Utilizadas na indstia para a clarificao de vinhos e suco de frutas, alm de tratamento de degoma de fibras de plantas, cura de caf, cacau e tabaco e na extrao de leos essenciais e pigmentos de plantas. Geralmente produzida por fungos filamentosos, pode ser obtida em processo de fermentao slida ou submersa Foco deste trabalho: Fermentao submersa

Reatores

Stirred Tank Reactor:

-Favorece a transferncia de O2 e homogeneizao; -Melhor para lidar com mudanas na reologia do meio; -Promove o cisalhamento do miclio e exige energia para manter o meio homognio

Air lift reactor

-Alternativa de fcil construo que reduz o cisalhamento dos miclios e tem menor gasto energtico; -Seu design tem grande influncia na circulao de ar e lquido e na transferncia de oxignio

Meio de cultura
Pode influenciar fenmenos de induo, represso catablica e na produo de enzima extra-celulares pode influenciar o mecanismo de liberao de protenas.
Apesar de um meio com bom equilbrio entre acares e pectina darem bons resultados na produo de pectinases, a utilizao de farelo de trigo favorece a produo de poligalacturonases no cultivo de Aspergillus oryzae.

Objetivos do trabalho
Avaliar a produo de endo e exo-poligalacturonase em dois reatores de escala de bancada: STR e Air lift. Testar a utilizao de diferentes formulaes de meios de cultura sem slidos suspensos, substituindo o farelo de trigo pelo extrato deste.

Material e mtodos
Micro-organismo: Aspergillus oryzae IPT301 Meio de cultura: Farelo de trigo (40 g/L), pectina ctrica (20 g/L), extrato de levedura (0,05g/L), sulfato de amnia (5g/L), sulfato de magnsio(0,5g/L), fosfato de potssio (2,5g/L), sulfato ferroso, sulfato de zinco e sulfato de manganes (traos); A fim de evitar a presena de slidos suspensos, o farelo de trigo foi substitudo por seu extrato aquoso. Foram utilizados volumes de extrato equivalentes a 20, 40, 60 e 80 g/L. Tambm foram avaliadas diferentes concentraes de glicose (12,17, 22 27 e 32 g/L) e peptona (3, 8, 13, 18 e 23g/L).

Material e mtodos
Condies experimentais
Testes preliminares para definio do meio de cultura foram realizados em frascos Erlenmeyer (500 mL) contendo 100 mL de meio. O meio foi inoculado com uma suspenso contendo 106 esporos por litro. O frasco foi incubado a 28C com agitao de 200 rpm. Amostras foram coletadas a cada 24h, durante 96h. Air lift reactor: Volume total de 4L, com volume de trabalho de 3,2 L. Diferentes valores de Kla foram avaliados pela injeo de diferentes fluxos de ar (Q: 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00)

Material e mtodos
STR:
volume total de 5L, volume de trabalho de 3, 2L. Equipado com turbina flat blade com 6 ps. Durante o cultivo a agitao variou entre 200 e 700 rpm e o fluxo de ar variou entre 0,5 e 2, 5 vvm.

Mtodos analticos:

Determinao de acares redutores

DNS Endo PG: atividade na reduo de viscosidade de soluo padro de pectina ctrica, expresso em unidades por mL (U mL-1) Exo PG: liberao de cido poligalacturnico. Atividade expressa em unidades por mL (U mL-1).

Resultados e discusso
Definio do meio baseado no extrato de farelo de aveia:

-Experimento 12: Melhores resultados para Endo e Exo PG: formulao contendo 22 g/L de glicose, 80g/L de extrato de farelo de aveia e 13g/L de peptona. -Resultou nas seguintes atividades: Endo-PG 43,7 U mL-1 , Exo-PG 24,8 U mL-1

Comparao da transferncia volumtrica de oxignio (Kla) nos reatores STR e Air lift
Para avaliao do Kla nos dois reatores, foram realizados testes com meio no inoculado
- STR: observa-se que a velocidade de agitao tem influncia muito maior do que o fluxo de ar sobre a Kla; - Comparando os dois reatores, observase que variando Q entre 1,25 e 2,0 vvm, mantendo a agitao do STR at 300 rpm, obteve-se valores equivalentes de Kla; -Agitaes entre 400 e 700 rpm aumentaram significativamente a Kla no STR; -Considerando o aumento na viscosidade do meio esperado em cultivos de fungos, fica evidente os problemas de transferncia de massa quando usa-se o Air lift.

Crescimento de A. oryzae e produo poligalacturonase em reatores STR e Air lift

de

Observa-se que valores ligeiramente superiores, tanto no rendimento de enzimas quando na produtividade, foram obtidos quando utilizado o reator STR

Depois de uma fase lag de 5 a 10h, foi observado um intenso crescimento celular em ambos os reatores, com concentrao celular similar obtida prximo a 20h de fermentao. Aps este perodo observa-se uma reduo na taxa de crescimento no reator Airlift. Ao atingirem a fase estacionria, a concentrao celular era de 14,1 g/L no STR e de 10,1 g/L no Airlift. Observa-se tambm que a concentrao de oxignio dissolvido decresce rapidamente depois da fase lag nos dois reatores. Para que o STR mantivesse a concentrao mnima de oxignio foi necessrio aumentar a agitao para 700rpm. A atividade das enzimas avaliadas se mostraram cineticamente no associadas ao crescimento celular. Valores distintos de pH final foram observados, sendo 2,3 para o STR e 3,3 para o airlift.

Crescimento de A. oryzae e produo poligalacturonase em reatores STR e Air lift

de

Aparentemente, o cisalhamento esperado pela turbina do STR no teve efeito muito crtico, uma vez que altos valores de rotao foram necessrios para obter-se a taxa de oxignio necessria para a cultura; No presente trabalho, o autor conclui que a agitao mecnica no o fator que justifica a diferena na produo de biomassa, considerando o fato de que o valor mnimo de oxignio dissolvido foi muito similar nos dois casos analisados; De acordo com a literatura, a agitao aumenta o consumo de acares, o que pode justificar os melhores resultados obtidos no STR; A necessidade de intensa aerao no Airlift- com pico de 2,5 vvm- tambm fator de cisalhamento do misclio, influenciando nos resultados obtidos; Segundo a literatura, valores de pH inferiores a 2,7 favorecem o aumento da atividade pectinoltica das enzimas avaliadas, o que pode justificar os resultados nos reatores STR (pH final = 2,3) e Airlift (pH final = 3,3).

Concluses
Considerando a taxa de transferncia de oxignio, o reator Airlift somente se compara com o STR em rotaes inferiores a 300 rpm; Mesmo assim, possvel garantir o suprimento ideal de oxignio para a cultura utilizada em reator Airlift; Os resultados aproximados das atividades enzimticas sugerem que biorreatores airlift tm potencial para a produo dessas enzimas em operaes com larga escala, com custos mais baixos de instalao e operao quando comparados ao STR.