LPIDOS

Universidad Interamericana de Puerto Rico Escuela de Tecnologia Medica

Lcdo. Javier Navarro MT(ASCP)

QUICK REVIEW
Los lipidos son insolubles en agua y son solubles en solventes organicos.

En la sangre los lpidos son solubles porque estan asociados con las proteinas (lipoproteinas)
El cuerpo mayormente guarda los lipidos en forma de triglicerido en el tejido adiposo La digestion de los lipidos se llevan a cabo en su mayoria por lipasa y sales biliares La sintesis de colesterol se lleva a cabo mayormente en el higado La lipoproteinas que transporta la mayor parte del colesterol es Low Density Liprotein (LDL)

PRUEBAS QUE SE INCLUYEN EN UN LIPID PROFILE

Cholesterol Total

LDL Colesterol
HDL Cholestol Trigliceridos VLDL Cholesterol Importante: Toda persona mayor de 20 aos debe hacerse un lipid profile cada 5 aos.

PREPARACION PARA UN LIPID PROFILE

El pacientre debe estar metabolicamente estable Debe mantener una dieta y un peso usual por 2 semanas antes de la coleccin No puede ejercitarse vigorosamente durante las ltimas 24 horas Debe estar en ayunas y haber permanecido sentado por lo menos 5 minutos La ayuna debe ser de 10 12 horas Los valores del colesterol tienden a aumentar cuando se esta de pie.

QUE TIPO DE MUESTRA SE REQUIERE

Para un Lipid Profile se utiliza suero primordialmente, aunque se puede usar plasma (EDTA) SI SE USA EDTA: El resultado debe ser corregido ya que el EDTA remueve H2O de la RBC por osmosis diluyendo el plasma. Se multiplica por 1.03
Debe ser enfriado a 2-4 C inmediatamente.

CASO 1
Una muestra de una paciente para hacerle un Lipid Profile se recive en el laboratorio. Que resultado, si alguno, puede ser utilizado? Solamente Colesterol y HDL.

Si el colesterol total es de 200 mg/dl o mas y el HDL es menor de 40mg/dL, la pruebas deben ser repetidas en una muestra que sea tomada en ayuna.

COMO PODEMOS SABER SI UNA MUESTRA NO FUE TOMADA EN AYUNA

Lipemia se define como la presencia de grasas o lipidos en la sangre El suero se ve milky o turbio que es indicativo de que una gran cantidad de chylomicrons y/o VLDL, ambos son los contenedores de los TRIG

Si se hace una electroforesis de lipoproteinas se va a observar una banda en el area de los chylomicrons
Si la muestra se deja en nevera durante la noche puede observarse una capa en la parte superior de la muestra

SUERO LIPMICO
La apariencia del suero nos puede dar una idea de el resultado

Una muestra lipmica debe de tener trigliceridos altos.

CHOLESTEROL
El colesterol es uno de los lpidos ms importantes. Una de sus principales funciones es formar parte de la membrana plasmtica de las clulas eucariotas. Tambin es esencial para el crecimiento y viabilidad celular.

Factors
Age

Cholesterol Effects
Increases with Age Varies within Male or Female Peaking Effect (10-25% Variation) Negligible Increases Variable Negligible or Decreases

Effects on Sample
100 mg/dL at birth; doubles during the first days. Stable until age 20, after. 30-35 years: equal 35-55 years: male > female 55-60 years: male while female prior menstruation; peaks at ovulation, after. Less than 3% after a meal. After a stressful episode, cholesterol after several hours. An average of 35 mg/dL is seen between December and January. RBCs have concentrations of cholesterol (10-20%) than serum, some diurnal variations with gross hemolysis.

Sex Menstruation Fasting Stress Time of Specimen Hemolysis

CHOLESTEROL
Para poder circular por la sangre, el colesterol se combina con unas protenas denominadas LDL Podremos identificar, pues, el colesterol que est en sangre por su asociacin a esta protena.

Existen mtodos tanto de tipo qumico como enzimtico.

Los qumicos se utilizaron durante mucho tiempo para determinar el colesterol colorimtricamente, aunque suelen ser poco precisos, presentan interferencias, y resultan difcilmente automatizables.

METODOS QUIMICOS
The classic Liebermann-Burchard method for cholesterol analysis, extracted cholesterol into cold chloroform. After, the cholesterol was treated with acetic anhydride, acetic acid and concentrated with sulfuric acid that formed a green complex.

LIEBERMANN-BURCHARD REACTION
Dehydration Step
Strong Acids (Sulfuric Acid and Acetic Anhydride)

Cholesterol

3,5 Cholestadiene

Oxidation Steps
3,5 Cholestadiene Cholestahexaene-Sulfonic Acid
Absorbs at 410 nm (unstable)

Non-esterified cholesterols are precipitated and the remaining cholesterol measured.

Free cholesterol is calculated: Total Esterified = Free

Infrequently used. This reaction overestimates the concentration of esterified cholesterol.

METODOS QUIMICOS
Another colorimetric method was the Salkowski reaction. Uses iron salts and sulfuric acid to produce a reddish purple color complex that can be measured spectrophotometer at 563 nm. More sensitive than the Liebermann-Burchard reaction. Free and esterified cholesterol give the same color = no need for ester hydrolysis.
Abell Method Cholesterol is extracted with zeolite (adsorbent mineral). The esters are hydrolyzed and the total cholesterol is measured by the Liebermann-Burchard reaction. Laborious. GOLD STANDARD!

METODOS QUIMICOS
p-Toluene-Sulfonic Acid (p-TSA)
Similar to Salkowski.
p-TSA reacts with cholesterol derivate to form a chromophere that absorbs at 550 nm. Rarely used. Free and esterified cholesterols give the same color. of bilirubin causes large positive errors.

METODO ENZIMATICO
Los metodos enzimaticos has sustituido los quimico por que son menos riesgosos y automatizables Son especificos y la muestra NO necesita un tratamiento previo a analizarse Se determinan el colesterol total directamente en el suero en una serie de reacciones en que se hidrolizan los steres de colesterol, se oxida el colesterol y el agua oxigenada resultante se determina enzimticamente.

METODO ENZIMATICO
Cholesteryl esterase

1.

Cholesteryl ester + H2O Cholesterol + Fatty Acid

Cholesterol oxidase

2. Cholesterol + O2 Cholestenone + H2O2 Peroxidase 3. H2O2 + Dye Color

El color que se produce es directamente proporcional a la concentracion de Cholesterol y se mide a 500nm

METODO ENZIMATICO
Las enzimas y los reactivos han mejorados durante el pasar del tiempo y esto hace que los resultado sean mas confiables La Vitamina C y la bilirubina son agentes reductores que pueden interferir en las racciones enzimaticas.
Falsely values with concentrations of:
Uric acid Ascorbic acid (vitamin C) H2O2

CHOLESTEROL
El National Cholesterol Education Projects (NCEP) recomienda que los niveles de cholesterol en los aldultos es: Menos de 200mg/dL Niveles mas altos son un riesgo de un Coronary Heart Disease (CHD) Boderline High es de 200-239mg/dL High es mayor a 240mg/dL

CHD
Otros factores para CHD

Fumar
Hipertension Inactividad fisica Obesidad

Diabetes tipo 2
LDL alto HDL bajo Ser varon Tener historial familiar

TRIGLICERIDOS (TG)
Los triglicridos (TG) se acumulan principalmente en las clulas grasas (adipocitos)

Constituyen un depsito de combustible metablico.

Los TG estan de una molecula de glicerol y tres moleculas de un acido graso TG exogenos son TG que provienen de la dieta. Chylomicrons

TG endogenos son sintetizados en el cuerpo

MUESTRA DE TRIGLICERIDO
Triglyceride Sample
Serum or Plasma
Plasma values are 2-4% lower than serum because of the dilution effect caused by anticoagulant.

Fasting of 10-12 hours minimum. Triglyceride concentrations increases within 2 hours after eating and reaches a maximum in 4 to 6 hours. Triglycerides causes a lipemic sample.

TRIGLICERIDOS
Para su determinacin se utilizan mtodos qumicos y, sobre todo, enzimticos: Mtodos qumicos: Se extraen los TAG y otros lpidos con disolventes orgnicos. Despus se aslan los TAG y finalmente se hidrolizan a glicerol y cidos grasos. El glicerol obtenido es oxidado a formaldehdo, que puede ser determinado por diferentes mtodos. Mtodos enzimticos: Se hidrolizan los triglicridos de la muestra y el glicerol que se obtiene es sometido a una serie de reacciones enzimticos acopladas, en las que se forma un compuesto llamado NADP (nicotinamida adenina di nucletido fosfato), que se puede medir por espectrofotometra.

METODO ENZIMATICO PARA TG

Triglyceride current methods for analysis enzymatic reactions, the most common: 1. 2. 3. 4. Breakdown by lipase (LPS) Triglyceride LPS Glycerol + Free Fatty Acids Phosphorylation of glycerol by glycerol kinase (GK) Glycerol + ATP GK Glycerol-3-phosphate + ADP Oxidation of Glycerol-3-phosphate to dihydroxyacetona phosphate (DHAP) by glycerol phosphate oxidase (GPO). Glycerol-3-phosphate + O2 GPO DHAP + H2O2 Catalysis of H2O2 by peroxidase that produces free O2 that oxidizes a reduced dye to form a colored end product. H2O2 + reduced dye peroxidase oxidized dye + H2O involved coupled

METODO ENZIMATICO PARA TG

An alternative method proposed on step 3 is the use of glycerol3-phosphate deshydrogenase (GPD) plus NAD+, that is reduced to NADH + H+.
Glycerol-3-phosphate + NAD+ GPD DHAP + NADH + H+

NADH is measured at 340 nm.

The problem is that 340 nm is near the wavelength of UV and the absorbance reading depends on the spectrophotometer ability to distinguish between the spectrum.

VALORES DE REFERENCIA PARA TG

TG son un factor independiente de riesgo para CHD

Adult Treatment Panel III (ATP III) hecho por National Cholesterol Education Projects (NCEP) establece:
Normal <150 mg/dL

Borderline High = 150-199mg/dL

High = 200-499mg/dL Very High > 500mg/dL

LIPOPROTEINS (CHOLESTEROL FRACTIONS) DETERMINATION

HDL requires preteatmen to precipitate LDL and VLDL
Chemical precipitation with salts and organic solutions.
Simple but there is interference between fractions.

Ultracentrifugation (GOLD STANDARD)

Requires high-speed technologist time. centrifuges, long speed times and

Lipoproteins electrophoresis (LPE) is another procedure for separating and measurement of lipoproteins that has been adapted to specific assays for HDL and LDL.
Newer methods uses high resolution gel electrophoresis that gives greater reliability in the determination of lipoproteins fractions.

ULTRACENTRIFUGACION
Esta tcnica permite separar las diferentes familias de lipoprotenas en base a sus densidades. Est basada en dos propiedades, una es la baja densidad que tienen las lipoprotenas respecto a otras macromolculas plasmticas y otra es que cada tipo de lipoprotena tiene una densidad diferente; as las lipoprotenas pueden ser separadas de otras protenas plasmticas y a su vez ser separadas entre ellas.

PRECIPITACION
Las protenas precipitan en presencia de poli aniones como el sulfato de heparina o en presencia de cationes divalentes como el Ca +2, Mg +2, y Mn +2.
LDL, IDL and VLDL se van arriba del suero donde pueden ser aspirados El resto de la muesta solo contiene HDL.
HDL can be measured by the total cholesterol methodology that uses the cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase.

Niveles excesivos de cationes pueden interferir Cuando hay niveles excesivos de TG pueden no ser serparado completamente y quedarse en la parte de abajo

HDL CHOLESTEROL
Newer methodologies uses immunoprecipitation with antibodies for apo B, which is not present in HDL but present in LDL, VDL and chylomicrons. Modified enzymatic assays uses cholesterol esterase and oxidase with polyethylene glycol.
Under specific concentrations of cations and dextran, they will only react with HDL eliminating the need of pretreatment.

This methodologies agrees with later methods but are more susceptible to interferences.

HDL REFERENCE VALUES

They vary between age and gender.
Females tend to have lower levels of HDL than males. Desirable levels of HDL are > 40 mg/dL. Lower levels means more risk of coronary artery disease.

LDL CHOLESTEROL

LDL
Al LDL se le reconoce como el causante mayor de CHD

Las placas arteroscleroticas estan formadad por LDL

ATP III establece: Nivel optimo <100mg/dL Borderline High 130130-159mg/dL

High 160-189 mg/dL

Very High >190mg/dL

COMO SE DETERMINA EL LDL?

Puede ser calculado por la formula de Friedewald

LDL = Cholesterol Total HDL (TG/5)

TG dividido entre 5 es el estimado de VLDL LDL = Cholesterol Total HDL VLDL La formula no es valida si los trigliceridos son mayores de 400mg/dL

La desventaja de calcular el LDL es que depende de la tener un calculo confiable de 3 determinaciones

Ya se estan empleando nuevos metodos para la determinacion directa de LDL

EJERCICIO
Calcula el LDL y determina si el paciente esta a riesgo de un Coronay Artery Disease (CAD) si el cholesterol total es de 240 mg/dL, HDL es de 64mg/dL y los TG son 310 mg/dL LDL= chol-hdl-(tg/5) =240-64-(310/5) =114mg/dL Ambos el Chol y el LDL estan sobre el nivel deseado y el HDL esta en el nivel deseado. Hay que estar pendiente de los otros factores como los son la edad, sexo, historial familiar, fumador, HBP, diabletes Es importante saber si el especimen fue en ayuna o no. Por que los niveles altos de TG pueden ser causado a que la muestra no fuera en ayunas.

LDL CHOLESTEROL
Newer method uses immunoprecipitation that directly measures LDL.
Uses antibodies to apo A and apo E that removes HDL and VLDL. LDL is then assay by the cholesterol esterase oxidase method.

Other methods of precipitation uses buffers of heparin.

HDL and VLDL are measured and subtracted from the total cholesterol.

Less susceptible to high triglycerides.

APOLIPOPROTEINS
Apo A-I is associated with HDL not LDL.
Also associated with VLDL and chylomicrons. Fasting specimens contains trace amounts of VLDL and chylomicrons but, it may provides reasonable approximation of HDL levels.

Apo B is found primarily in VLDL and LDL.

Presents an alternative to calculated LDL.

Apo A-I and apo B, used together may indicate active relationship between HDL and LDL levels.

APOLIPROTEINS
Apo A-I
Females: 1.20 1.52 g/L Males: 1.12 1.38 g/L

Apo B
Females: 0.92 1.38 g/L Males: 0.99 1.36 g/L

A-I and B tend to between the ages of 20 to 59 in both genders.

After 60, apo B until age 70, then . Apo A-I remains steady until 70, then it declines also.

CASO 2
Un especimen para un LP tiene un triglicerido elevado y un Cholesterol normal. Cual es la cuasa mas probable Una muestra non-fasting Ingesta reciente de comida grasosa te eleva los trigliceridos pero no el cholesterol total. La prueba debe repetirse en ayuna

it is also called the good cholesterol

HDL
LDL HDL Chylomicrons Chylomicrons TG Fatty Acids Cholesterol

It is also called the bad cholesterol. It is considered as the lipoprotein with the highest density The lipid that stays at the point of origin in electrophoresis. It causes lipemia of serum.

The food sources of this lipid is meat fat.

It is the simplest form of lipid. is the basic nucleus of most steroid hormones