PURIFICACIN DE PROTENAS

1. 2. 3.

Las protenas se purifican para hacer (principalmente): cristalografa de rayos X cintica enzimtica estructura primaria, cuando no se conoce el gen La purificacin de protenas es una tarea frecuente en los laboratorios de bioqumica. Para purificar una protena es fundamental disponer de un ensayo especfico: enzimtico, fsico (geles), biolgico, inmunolgico, etc.

La fuente puede ser un tejido animal o vegetal, o un microorganismo. En el primer caso se rompe el tejido con una juguera o un Potter. Luego las clulas (bacterias tambin) se abren por sonicacin, lisis (lisozima), mortero, prensa, etc. Todos los pasos que siguen se hacen (casi siempre) a 4 C, con tampones, con o sin inhibidores de proteasas.

sonicador

Potter

Centrifugacin diferencial para clulas eucariticas. Es opcional.

Rotores de ngulo fijo

Rotores swinging bucket para ultracentrfuga

Si la protena es soluble se puede concentrar por insolubilizacin preferencial: a) con sales (AmSO4). Al principio, imperceptible en la figura, salting in, ya que los grupos cargados de las protenas se estabilizan, pero a conc. mayores empieza el salting out, donde los iones de la sal se solvatan y retiran agua disponible a la protena, adems de interferir con las interacciones electrostticas de sta;

b) Otra opcin es con solventes orgnicos como acetona y etanol, los que bajan la cte. dielctrica del solvente. Las protenas reaccionan de distinta forma, tal como ocurre cuando se agrega AmSO4;

c) Tambin se puede precipitar a la protena con pH: las protenas tienen su mnima solubilidad en el pI, sea cual sea la concentracin de sal.

d) Por ltimo, en lugar de precipitarla, la protena se puede concentrar por ultrafiltracin, con membranas de distinto tamao de poro, o por dilisis contra un polmero inerte que mantenga la presin osmtica (polietilenglicol).

En los casos en que la protena se haya precipitado (a, b y c anteriores), se centrifuga y el pellet se solubiliza en buffer adecuado . Luego se dializa para eliminar la sal o solvente orgnico para poder llevar a cabo las cromatografas que convengan

Cromatografa de intercambio inico: catinico si resina es negativa y aninico si es positiva. Se eluyen con gradientes salinas en preparadas en buffer.

Colector de fracciones

Filtracin en gel (gel permeation)

Matriz puede ser: - dextrano (Sephadex) - poliacrilamida (Biogel) - agarosa (Sepharose) Tpicamente, se monitorea la elucin por A280

La columna se calibra con protenas de peso molecular conocido

El volumen de exclusin (V0) de determina con un polmero de alto PM que no penetra el gel

Cromatografa de afinidad

Elucin puede ser por batch o con gradiente

Smil de la diferencia entre actividad y actividad especfica

Criterios de pureza: a) electroforesis en condiciones denaturantes (SDS-PAGE) b) isoelectroenfoque (IEF) c) electroforesis bidimensional: IEF y luego SDS-PAGE.

SDS-PAGE de fracciones obtenidas durante un proceso de purificacin

Tincin con Azul de Coomassie o con AgNO3

Normalmente se hace un stacking gel al 4% PA para concentrar las protenas antes que entren al gel de resolucin (tpicamente 10 a 15% PA)

Este detergente cubre al polipptido desnaturndolo y confirindole una densidad de carga uniforme en su longitud. Las cargas propias de la protena se vuelven despreciables.

En SDS-PAGE las molculas ms chicas migran ms rpido. En este caso, al revs de lo que ocurre en filtracin en gel, todas las molculas estn obligadas a migrar dentro de la malla del gel.

Como las cargas propias de la protena no influyen en su migracin, SDS-PAGE es la tcnica rutinaria para medir el PM de una protena. Para ello se utilizan estndares de PM conocidos.

Geles de poliacrilamida en condiciones nativas (sin SDS y sin calentar la muestra)

Se hacen en fro, tpicamente en geles cilndricos. Migracin depende del PM y de la carga. Un gel se puede teir con Coomassie para ver el nmero de bandas y un gel paralelo se corta en tajadas delgadas, las que se suspenden en buffer para medir actividad. Luego se ve si la actividad coincide con alguna banda, idealmente con la banda nica. Tambin se puede hacer un zimograma.

Isoelectroenfoque: electroforesis en una gradiente de pH

Los anfolitos tienen la funcin de estabilizar la gradiente de pH, ya que cubren un amplio espectro de pIs. Recordar lo rpido que migran los H+ en solucin.

Electroforesis bidimensional

Comnmente se hacen anlisis comparativos. Por ej, para detectar protenas mutadas, para estudiar expresin gnica, para ver el avance de una enfermedad, etc. Los geles se escanean y son posteriormente analizados mediante softwares

Otro ejemplo: diferencias en la expresin de protenas en dos tejidos diferentes

Las marcadas artificialmente con rojo son comunes en ambos tejidos, aunque de todos modos se aprecian diferencias cuantitativas

Western blot
No es criterio de pureza, pero sirve para detectar protenas usando anticuerpos especficos.

o leche en polvo

Recordar Southern blotting y Northern blotting. El trmino blotting hace referencia a la transferencia de macromolculas biolgicas desde un gel hasta una membrana y su posterior deteccin en la superficie de la misma. Empleo de Western en nuestra actual investigacin.

Determinacin de la estructura primaria de una protena purificada.

Ahora se deducen muchas secuencias a partir del DNA, pero este mtodo no nos dice nada sobre puentes S-S, RNA editing y modificaciones post-traduccionales.
Si se dispone de la protena, se siguen los siguientes pasos:

- Separacin de las cadenas si hay estructura cuaternaria, usando cromatografas descritas

- Ruptura de puentes disulfuro: con mercaptoetanol (HS-CH2-CH2-OH) o con ditiotreitol o DTT (HS-CH2- CHOH-CHOH-CH2-SH). Los SH resultantes se pueden oxidar con iodoacetato para evitar reoxidacin:

R-SH + ICH2-COO- ------> R-S-CH2-COO- + HI

Composicin aminoacdica: siempre es deseable tenerla antes de secuenciar. 6N HCl, 110 C, 10-100 horas, en tubo sellado. Precaucin, porque en estas condiciones se destruye el trp y algo la ser, treo y tir, mientras que asn y glm se hidrolizan a asp y glu. La hidrlisis alcalina es an ms destructiva y la enzimtica no es prctica dada la especificidad de las proteasas, aunque venden mezclas (pronasa) que suelen usarse, con el inconveniente que su propia autodigestin contamina la muestra. El anlisis de aa puede hacerse por HPLC, derivatizndolos a algo fluorescente (por ej).

Deteccin por HPLC de aa derivatizados fluorescentes

(o-phtaldehido o cloruro de dansilo)

La HPLC (high performance (pressure) liquid chromatography) es rpida, eficiente y sensible. Es reversa porque la fase estacionaria es apolar y se eluye aumentando la apolaridad de la fase mvil. Tpicamente, tienen un detector UV-visible y/o de fluorescencia. Bien calibrada es tambin cuantitativa.

FPLC o fast protein liquid chromatography es como un HPLC preparativo que se lleva a cabo en columnas de intercambio inico, de filtracin, de afinidad, de interacciones hidrofbicas, etc., todas ellas disponibles en el mercado. Se usa para separar protenas.

Normalmente se trabaja en fro

Identificacin del aa N-terminal: se hace rutinariamente, en parte por curiosidad y tambin para estar seguros de que aparece un solo aa. Reactivos: (reaccionan tambin con aa individuales)

Se hidroliza la protena y se identifica por cromatografa (papel, HPLC, etc). Los compuestos son coloreados o fluorescentes.

Uso del cloruro de dansilo para identificar el aa N-terminal

No confundir las reacciones anteriores con la de la ninhidrina, la que detecta aminas pero no permite identificar los aa.

Para C-terminal no hay criterio equivalente. Solo se pueden usar exo-carboxipeptidasas, aunque no atacan con la misma eficiencia todos los aa, por lo que puede dar datos equvocos, ya que al seguir metindose en la cadena pueden aparecer rpidamente otros aa.

Molar equivalents of aminoacids released

Molar equivalents of aminoacids released

time time

Aqu est claro que tir es el C-term

Aqu no sabemos cual es el C-term

Por eso, lo mejor para determinar el C-term es la hidrazinolisis a 90 C, la que destruye todos los enlaces peptdicos derivatizando todos los aa, salvo el C-term.

Ruptura de pptidos para secuenciar.

Puede ser con peptidasas

El bromuro de ciangeno, ltimo agente en la tabla anterior, rompe especficamente en el extremo C-term de una metionina interna

Separacin de los fragmentos: por cromatografas ya vistas, incluyendo HPLC y papel (fig).

Ejemplo: separacin de distintos colorantes solos o en mezclas

La fase mvil es agua y solvente orgnico. La primera humedece el papel por capilaridad y el segundo acta como fase mvil, por lo que los aa menos polares se mueven ms rpido.

Secuenciacin: se usa reactivo de Edman o PITC, que tiene la gracia de no requerir hidrlisis. Funciona en tres etapas (OH-, trifluoracetato y H+), en ciclos automatizados. El aparato se llama sequenator y da hasta 50 ciclos. Por eso es necesario fragmentar la protena. Se requieren entre 0.1 y 1.0 mg de protena.

Comparacin del reactivo de Edman con el 1-F-2,4-DNB

Para obtener la secuencia completa, se repite con otra proteasa, etc., y se hacen las sobreposiciones

Recapitulacin del procedimiento ya visto

Localizacin de puentes disulfuro: si es que los hay. Se rompe protena completa con una enzima, antes y despus de reducir los S-S y se hace cromatografa o por fingerprinting se ve cuales pptidos desaparecen. Este ltimo consiste en una cromatografa en papel en una dimensin y electroforesis en el mismo papel en otra dimensin. Una idea de este procedimiento se tiene en la figura, en la que mediante fingerprinting se detecta donde hay una mutacin puntual en la hemoglobina.

Determinacin del PM de las protenas por espectrometra de masas

Cuando iones en fase gaseosa son introducidos en un campo elctrico o en un campo magntico, sus desplazamientos son proporcionales a las razones masa/carga (m/z). Este es el principio que hace posible la tcnica llamada espectrometra de masas (MS). La MS permite medir PM de molculas. La imposibilidad de pasar protenas a fase gaseosa impidi por muchos aos la aplicacin de esta tcnica para medir sus PMs. En 1987, Karas y Hillenkamp describieron el matrix assisted laser desorption/ ionization mass spectrometry, o MALDI MS Sobre una placa metlica se mezcla la protena con una molcula orgnica disuelta en una mezcla de agua y solvente orgnico (matriz). Al hacer incidir un rayo laser, la matriz se sublima arrastrando a la protena. Esta queda libre en fase gaseosa, asociada a protones que le ha cedido la matriz, la que se ioniza por efecto del laser. Luego las molculas de protena cargada entran al espectrmetro de masas para su anlisis.

Las protenas ionizadas entran a un campo magntico donde su desplazamiento (time of flight) es dependiente de su relacin m/z. (MALDI-TOF)

Esquema simple

Esquema ms detallado

Una variante de la tcnica anterior consiste en hacer pasar una solucin lquida de la protena a travs de una aguja sometida a un alto potencial elctrico. La solucin se dispersa en minsculas gotas cargadas, se evapora espontneamente el solvente cedindole protones a la protena. La protena cargada con los protones queda en fase gaseosa: ESI MS (electrospray ionization mass spectrometry)

En ambos casos se forma un espectro de especies con diferente m/z. El espectrmetro registra peaks que tienen una diferencia de carga de 1 y tambin una diferencia de masa de 1 (un protn).

Basta el anlisis de dos peaks vecinos para tener el PM (en cada caso se conoce el m/z pero no la masa ni la carga de cada peak, por eso se hace un sistema de dos ecuaciones con dos incgnitas). Pero la integracin de todos los peaks da una masa de la protena no cargada mucho ms exacta (inserto).

La aplicacin de MS en tandem (MS/MS) permite deducir la secuencia de una protena. Esta se digiere primero con una proteasa. Se somete la mezcla de pptidos a ESI y stos son separados en un primer espectrmetro. Luego, cada pptido ionizado, incluyendo todas sus subespecies que difieren en carga, entra a una cmara al vaco donde es fragmentado por un gas noble sometido a alta energa. Tpicamente cada pptido se fragmenta una vez en el enlace peptdico, que como no adiciona agua genera un radical carboxilo. A continuacin, el segundo espectrmetro mide m/z de todos los nuevos pptidos que tienen carga, dando un conjunto de peaks que difieren en un aminocido. La diferencia de masa entre dos peaks vecinos revela el aminocido que falta. Un integrador da la secuencia.

Espectro de un decapptido

Tpico protocolo de protemica actual