Caractrisation et purification des protines

Pr Eric Chabriere Eric.chabriere@afmb.univ-mrs.fr

Le dosage des protines

1- mesure de l'absorption UV

A log(

Les acides amins aromatiques absorbent la lumire dans l'UV. Le maximum d'absorption lieu 280 nm (W). En mesurant la D.O (densit optique). On peut revenir la concentration de protine. :coefficient d'extinction molaire (mol/cm)

It ) .C.l Io

C : concentration (Mol)
l : longueur de la cuve (en gnrale 1 cm)

Loi de Beer-Lambert

il faut connatre le coefficient d'extinction molaire. Il faut que la solution soit homogne. Le coefficient d'extinction molaire est dduit exprimentalement ou connu; On peut aussi facilement avoir une valeur approximative partir la squence de la protine. 1mg protine/ml a une absorbance 280 nm d'environ 0.5-2.

Avantage: Bonne sensibilit (50-100 mg) Facile mette en place Non destructif Dsavantage: Peu adapt au mlanges Sensible au contamination (ex ADN 260nM, tampon). L'absorption du tryptophane est module par l'environnement (pH, force ionique)

Trs bonne mthode pour les protines pures. Trs intressant pour comparer des concentrations entre des chantillons mesurs dans les mmes conditions

2-dosage du bleu de Coomassie (Bradford) Le colorant bleu de Coomassie G250 s'adsorbe sur les protines (acides amins aromatiques) en milieu acide. Le colorant passe du rouge au bleu (absorbance 595 )

Inconvnient. Il a une ractivit diffrente selon les protines. Par exemple il s'adsorbe beaucoup sur l'albumine. De plus la gamme de linarit est trs troite (2mg-120mg) On l'utilise plutt pour visualiser les protines sur les gels

3-Dosage par la mthode de Biuret Le cuivre se complexe avec les azotes de la chaine principale pH alcalin. Le cuivre ainsi coordonn absorbe 540nM (violet). Dfaut mthode peu sensible (1 mg).

4-Dosage l'acide bicinchoninique (amlioration de la methode de Lowry) On couple le dosage par la mthode du Biuret avec l'acide bicinchoninique. Cu 2+ est rduit grce certains acides amins (et par les liaisons peptidique haute temprature,>37c). Ensuite 2 molcules de BCA chlate spcifiquement Cu+1 et le complexe absorbe 562nm (pourpre).

Cette mthode est trs sensible jusqu' 2mg/ml. Trs bonne linarit et peu sensible aux dtergents

Mthode exprimentale. On a une protine de rfrence. En gnrale la BSA (Bovine serum albumin). On fait une gamme de dilution de 20mg/ml 2mg/ml (gamme talon). On met l'chantillon et la gamme talon au contact des ractif (BCA). On laisse incuber 30 min 37C ( cette temprature la rduction du cuivre est proportionnelle au nombre de liaisons peptidiques) On mesure l'absorbation 562nm. On utilise comme cuve de rfrence un tube sans protine pour faire le blanc. La mesure de la DO report sur la courbe talon indique la concentration en protines de l'chantillon.

5-dosage par la mesure d'activit Si on travaille avec une enzyme, on peut estimer sa concentration partir de la mesure de l'activit de l'chantillons (U.I ou Katal). U: 1 unit 1 mmole de substrat hydrolys par min Kat: Katal 1 mol de substrat hydrolys par s Pour cela il faut connatre l'activit spcifique de l'enzyme. U/mg ou Kat/mg Attention Il faut faire l'exprience dans des conditions prcises (T, pH, force ionique, ) car ces paramtres influencent l'activit d'une enzyme. Il existe de trs nombreux substrats qui changent leurs absorbations U.V-visible ou leurs fluorescences lorsqu'il sont hydrolyss. (C'est trs facile de mesur l'activit)

Absorbe 410 nm

Avantage: On peut mesurer la concentration de l'enzyme mme dans un mlange complexe. C'est un dosage trs utilis en mdecine (ex phosphatase alcaline)

Inconvnient: Applicable seulement aux enzymes Il faut une mthode (simple) de mesure de l'activit (substrat chromophorique).

Il faut le faire dans de conditions prcises.

La mesure sera perturbe si plusieurs enzymes dans la solution catalyse la mme raction

6-dosage avec des anticorps Des anticorps polyclonaux ou monoclonaux peuvent tre obtenus pour reconnatre avec une grande affinit et spcificit une protine particulire. Partie lourde constante

Les anticorps possdent une partie constante sur la chaine lourde qui peut tre reconnue par d'autres anticorps (anticorps anti-souris, anti-lapin, anti chvre,). Ces anticorps sont coupl chimiquement des enzymes qui serviront de marqueurs. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).

Enzyme

Ces enzymes peuvent tre la phosphatase alcaline ou la peroxydase

La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse du para-nitrophnolphosphate :

Hydrolys, ce substrat devient jaune et absorbe 405 nM.

La peroxydase Cette raction met des photons. Dtection par film photos ou camera CCD C'est une mthode trs sensible

Mthode.

protine
On fixe la solution d'intrt sur la plaque On sature la plaque avec des protines (lait) pour viter une fixation aspcifique On incube avec l'anticorps spcifique qui se fixe sur l'antigne. On incube avec L'anticorps anti-anticorps qui fixe sur le premier anticorps. On mesure la raction (absorption ou la lumire mise) et peut obtenir la concentration grce un talonnage Avantages: Trs prcis Trs sensible en particulier avec la peroxydase automatisable On a pas besoin de purifier la protine pour la doser Inconvnients. Ncessite des anticorps spcifiques Un peu lourd mettre en place

On peut faire des doubles sandwich pour amliorer la sensibilit

Electrophorse

Plusieurs techniques de l'lectrophorse. PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)

-PAGE native (linaire, gradient, gel retard) -SDS page -IEF PAGE -2D PAGE -Western blot

Le gel de polyacrylamide (PAGE)

l'acrylamide peut polymriser pour former un gel

Si on rajoute le bisacrylamide, agent pontant On obtient un gel rticul

La raction de polymrisation se fait grce l'ajout de persulfate (gnrateur de radicaux libres et de TEMED (stabilisateurs des espces radicalaires)

En gnral, le rapport acrylamide/bisacrylamide est de 19/1.

Commercialement on trouve le polyacrylamide (acrylamide/bisacrylamide) 30%(M/V)

Plus la concentration de polyacrylamide est importante, plus les pores seront petits et plus il sera difficile aux proteines de grande taille de se mouvoir. En gnral on fait des gels de 5 15% de polyacrylamide

PAGE -natif Si le pH est en dehors du points isolectrique, une protine est charge. Ngatif si pH > PI Positif si PH< PI Ainsi si on place une protine dans un gel de polyacrylamide et dans un champs lectrique, elle va migrer. Il y a une force proportionnelle la charge et une force (frottement) proportionnelle la taille de la protine Force de coulomb Felec= Z. E
Charge de la protine Champs lectrique Coefficient de viscosit

Ffrot Felec

gnrateur

Force de frottement Ffrot= -aR.V

Rayon de giration de la protine

vitesse

Comme tout frottement, la vitesse va s'quilibrer lorsque les frottement seront gaux la force de coulomb. ZE Z.E=aR.V; Vitesse de migration =

aR

Vitesse de migration =

ZE aR

Dans une lectrophorse native-PAGE on spare les protines selon le rapport charge/rayon Pour visualiser les protines, on peut colorer le gel avec le bleu de Coomassie.

On peut aussi rvler les protines la raction forme un produit color

Avantages. -On spare les diffrentes protines -Les tats d'oligomerisations sont conserves -on peut faire migrer les protines dans des condition non dnaturante -Rvlation par l'activit

Inconvnients -Les bandes de protines sont larges ( cause du dpt) -On ne peut pas dterminer la masse molculaire des protines -Rflchir sur la polarit de l'lectrophorse (en fonction du pH)

PAGE-natif en gradient
On coule un gel de polyacrylamide avec un gradient de 4 20%

4%

Les protines migrent, la concentration de polyacrylamide est de plus en plus forte. Elle finissent par stopper en fonction de leurs tailles.

En calibrant avec des protine de rfrences dont les masse molculaire sont connues. On peut dterminer la masse molculaire.

20% Avantages -bandes mieux focalises -dtermination de la masse molculaire -dtermination des formes oligomriques (non dnaturant)

Gel retard
Cette technique permet de dtecter l'interaction d'une protine avec une autre protine, de l'ADN ou de l'ARN. On fait migrer dans un gel natif sur une piste la protine seule, puis sur une autre le mlange protine-ADN (ou ARN ou autres protines). Etant donn que la migration s'effectue en fonction du rapport charge/masse, toute interaction changera ce rapport.

protine associe avec l'ADN

Protine seule

En faisant vari la concentration d'ADN, on peut dterminer la constante d'association

Avantage -met en vidence les interactions. -Permet de dterminer les conditions d'association (plusieurs partenaires, cofacteurs,) - On peut dterminer approximativement la constante d'association

SDS-PAGE (conditions dnaturantes)

-dodcyl sulfate de sodium (SDS) CH3(CH2)10CH2O-SO3- Na+

Mercaptoethanol
Rduit les ponts disulfure intra ou intermolculaire

On mlange les protines avec le SDS (et le mercaptoethanol). On chauffe 5 min 90. Les protines sont dnatures Les protines fixent de grandes quantits de dtergent (1,4 g de SDS par gramme de protine). Cela masque compltement la charge naturelle de la protine et lui donne une charge ngative constante par unit de masse. La mobilit lectrophortique dpend alors principalement de la taille.

Les gels SDS-PAGE sont constitu de 2 parties

tampon:Tris/Hcl pH 8.8 et glycine

1 gel de concentration tampon Tris/HCl pH 6.5 Polyacrylamide 4% 1 gel de migration tampon Tris/HCl pH 8.8 Polyacrylamide de 6 15% (selon la taille des protines)

Lorsqu'on a applique le courant, les espces ngatives vont migrer vers l'anode le PI de la glycine 6.5: Peu charge dans le gel de concentration (pH 6.5) Trs charge dans le gel de migration (pH 8.8)

Dans le gel de concentration (Stacking), Dans le gel de concentration (pH 6.5, acrylamide 4%) , les espce ngatives sont: -les ions chlorure (trs mobile) -les protines (mobile, charges par le SDS) - La glycine faiblement charg (peu mobile) Les ion chlorure avance trs rapidement. Derrire eux, on trouve une zone sans transporteur de charge. S' il y a peu charge, il y augmentation du potentiel lectrique U=RI. Ce fort courant lectrique force la migration de la glycine et des protines qui vont stacker au front de migration des ions chlorure. On obtient ainsi de trs fines bandes de protines

-----------------gly prot Cl-

------------------

Dans le staking

gly prot Cl++++++++++++

++++++++++++

Dans le gel de migration

Lorsqu'on arrive dans le gel de migration (pH 8.8 polyacrylamide 6-15%) les espces ngatives qui vont migrer sont: -les ions chlorure (trs mobile) -les protines (chargs par le SDS) sont ralentie (% acrylamide plus important) - La glycine est charg (trs mobile) Les protines, plus grosses, sont maintenant les espces les plus lentes. La glycine passe devant les protines -----------------Les protines arrivent en mmes temps dans la gel de migration et restent sous formes de fine bandes. La migration se fait principalement en fonction de leurs masse molculaire

MW +

prot gly Cl++++++++++++

Estimation de la masse molculaire (SDS-PAGE)

En utilisant des marqueurs de tailles calibres on peut estimer la masse des protines.

Si on reprsente la masse de la protine en fonction du log de la distance de migration (a partir de la discontinuit) on a une relation linaire

Souvent les marqueurs ne sont pas parfaitement purs, c'est pourquoi on utilise 2 kit de marqueurs diffrents pour identifier les protines qui sont communes.

On adapte le % de polyacrylamide en fonction de la taille que l'on dsire mesurer

8% 10% 12% 15%

45-400 kDa 22-300 kDa 13-200 kDa 2.5-100kDa

Il existe de kit de haut poids molculaires (HMW), de bas poids molculaire (LMW), et couvrant une grande gamme de masse. Des marqueurs colors qui permettent de suivre la migration en temps rel

Gel en gradient de pH (Isoelectrique Focusing, IEF) Dans un gel d'agarose ou de polyacrylamide 4%(pores larges), on place de nombreuses ampholytes qui possdent des points isoelectriques diffrents. Les ampholytes sont des espces qui se comporte la fois comme un acide et une base. Par consquent, a un certains pH (PI), elles sont neutres. gnrateur gnrateur

+
acide Gel + ampholytes + -

base

+
acide

base

pH

A pH acide, les ampholytes sont charges positivent et vont vers la cathode A pH basique, les ampholytes sont charges ngativement et vont vers l'anode. Lorsque le pH est au point isolectrique, l'ampholyte arrte sa migration Les diffrentes ampholytes s'organisent selon leur PI et forment un gradient de pH

Selon les ampholytes choisies, on peut avoir un gradient plus ou moins resserrs. Il existe aussi des gels de gradient de pH avec des ampholytes immobilises prt l'usage

Les protines sont aussi des amphotres.

+
6

gnrateur

On dpose la protine, n'importe o sur le gel. Elle va migrer et stopper au point isolectrectique.

PI pH

le gradient de pH est connu, par consquent en reprant la migration de la protine, on peut dterminer avec prcision son point isolectrique.

L'IEF permet: -De dterminer exprimentalement le point isolectrique d'une protine -De sparer les protines en fonctions du points isolectrique -De mettre en vidence certains variant de la protines mutations (charge) -modification post-traductionnelle (phosphorylation, glycosylation,)

Gels bidimensionnelles On peut coupler un gel IEF avec un gel SDS dans l'autre dimension. Les protines sont spares dans une dimension selon leurs points isolectriques puis par leurs masses molculaires dans l'autre dimension.

C'est un outil puissant pour la proteomique. Il permet de sparer jusqu' plusieurs milliers de protines. Pour identifier les protines, on peut utiliser: -des anticorps -dcouper les spots et squencer (Edman, MS/MS) - Dcouper les spots, digrer la trypsine et identifier les protines grce la spectromtrie de masse

Monocyte 2D gel

Les techniques de rvlation des PAGE

-Rvlation au bleu de coomassie -rvlation par l'activit (natif-PAGE) -rvlation au nitrate d'argent -rvlation avec des anticorps (western-blot)

Rvlation au nitrate d'argent (1000x plus sensible que le bleu de coomassie) Les groupe sulfhydrile et carboxylique des chaines latrales des protines peuvent rduire l'ion argent. L'ion argent rduit est sensible la lumire (principe du film photographique). La raction est stoppe en milieu acide

Attention les colorations au nitrate d'argent sont sensibles, mais dpendent de la composition en acide amins et ne sont pas linaires. On ne peut pas utiliser cette mthode pour comparer des concentrations de protines. D'autre part, si on veut faire par la suite de la spectromtrie de masse, il faut utiliser des protocoles sans glutaraldehyde. Le cross linking pose des problmes pour l'extraction de la protine du gel et pour la digestion peptidique.

45kDa 39kDa

HPON1 HPBP

Western Blot

Les anticorps ne vont diffuser librement dans le gel. Par consquent on fait sortir les proteines du gel et on les fixe sur une feuille de nitrocellulose ou de polyVinyldene Fluoride (PVDF).

cathode
Papier imbibe de tampon PAGE PVDF ou nitrocellulose

---proteines

Papier imbibe de tampon anode

++++

Si les protines sont en SDS, elle sont charges ngativement, elles vont migrer vers l'anode et se fixer sur la membrane de nitrocellulose ou de PVDF. Si gel natif, on travaille pH basique, (protines charges ngativement)

rvlation des western blot (similaire ELISA) 1) On sature la membrane avec des protines (lait en poudre). Pour viter que les anticorps se fixe aspcifiquement sur la membrane. 2) On incube la membrane avec les anticorps spcifique 3) On incube la membrane avec les anticorps anti anticorps (anticorps secondaires) qui sont coupls avec une enzyme (alcaline phosphatase ou peroxidase) 4) on rvle la membrane pour localiser les protines reconnues par l'anticorps Attention, il faut que l'anticorps reconnaisse la protine sous une forme dnature (SDS) protine membrane

Il y a beaucoup de protines dans le plasma

Dtection de HPBP dans le plasma de souris Le western blot permet de dtecter, de doser et de caractriser facilement une protine, parmi des milliers d'autres