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Sntesis y procesamiento de RNA mesanjero

Dra. Claudia Tovar Palacio 2011

Sntesis y procesamiento de RNA mensajero


Cuando las clulas eucariotas se incuban por un corto periodo (30 min) en [3H] uridina o [32P] fosfato y de inmediato se cosechan, la mayor parte de la radioactividad se incorpora en un gran nmero de molculas de RNA que tienen las siguientes propiedades:

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a) Muestran pesos moleculares altos (hasta 80S o 50 000 nucletidos) b) Se representan como un grupo por RNA diversos (heterogneos) con distintas secuencias nucleotdicas c) Se encuentran slo en el ncleo

Sntesis y procesamiento de RNA mensajero


Debido a estas propiedades estos RNA se conocen como RNA nucleares heterogneos (hnRNA).

Cuando las clulas incubadas en [3H] uridina o [32P] fosfato mediante un pulso breve se colocan en un medio sin marca radioactiva, y se vigilan por varias horas antes de cosecharlas y extraer el RNA, la cantidad de radioactividad en los RNA nucleares grandes decrece de modo notorio.

Sntesis y procesamiento de RNA mensajero


En su lugar aparece un RNA mucho ms pequeo en el citoplasma. Experimentos iniciados por James Darnell Jr., Klaus Scherrer y colaboradores, sugirieron que los hnRNA grandes y marcados con rapidez eran principalmente precursores del mRNA citoplamticos ms pequeos.

Sntesis y procesamiento de RNA mensajero


Los rRNA y tRNA tienen vida media que se mide en das o semanas, la vida media de los hnRNA es muy corta. Cierta acumulacin de radioactividad en los rRNA maduros 28S y 18S pueden detectarse despus de tres horas del pulso.

Sntesis y procesamiento de RNA mensajero


La vida media de los mRNA varan segn sean las especies:
los lmites oscilan entre unos 15 min y un periodo de das

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Todos los mRNA eucariotas precursores se sintetizan por la accin de una polimerasa de RNA II. Es una enzima compuesta de 12 subunidades diferentes muy conservadas, desde la levadura hasta los mamferos.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


El inicio de la transcripcin por medio de la polimerasa de RNA II se realiza con la cooperacin diferentes FACTORES TRANSCRIPCIONALES GENERALES (GTF). Estas protenas se conocen como factores de transcripcin generales porque se requieren para asegurar la transcripcin de diferentes ordenamientos de genes en una amplia variedad de organismos distintos.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Los promotores de la polimerasa de RNA II se sitan en el extremo 5 de cada unidad de transcripcin, pese a que la enzima establece contacto inicial en ambos lados del sitio de inicio de la transcripcin.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


En la gran mayora de los genes estudiados, una porcin crtica del promotor se localiza entre 24 y 32 bases corriente arriba del sitio donde se inicia la transcripcin.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Esta regin contiene a menudo una secuencia de conscenso que es idntica o muy similar al oligonucletido:
5-TATAAA-3

Esta secuencia se conoce como caja TATA La caja TATA del DNA es el punto donde se ensambla el complejo de presicin que contiene el GTF y la polimerasa.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


El complejo de presicin debe ensamblarse antes de comenzar la transcripcin del gen.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


El primer paso en el ensamble del complejo de presicin es la unin de una protena, conocida como PROTENA DE UNIN A LA CAJA TATA (TBP). Esta protena reconoce a la caja TATA de los promotores eucariotas.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La TBP est presente como una subuniad de un complejo proteico mucho ms grande llamado TFIID (transcription factor for polymerase II, fraction D). La TBP se inserta por s misma dentro del surco menor de la doble hlice de DNA y dobla a la molcula ms de 80o en el sitio de interaccin del DNA con la protena.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La unin de TFIID da lugar a la etapa para el ensamble del complejo de preinicio completo, que tal vez ocurre paso a paso como se muestra en la figura:

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La interaccin de las tres GTF (TBP de TFIID, TFIIA y TFIIB) con el DNA:

La maquinaria para la transcripcin del mRNA

La presencia de estos tres GTF unidos al promotor provee una base para la unin posterior de la gran multisubunidad de la polimerasa de RNA con su TFIIF unido.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Una vez que la polimerasa de RNA-TFIIF se encuentra en posicin, otro par de protenas GTF (TFIIE y TFIIH) se unen al complejo y convierte la polimerasa en la forma activa de la maquinaria de transcripcin.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


El TFIIH es el nico GTF conocido que posee actividad enzimtica. Una de las subunidades del TFIIH funciona como una cinasa de protena para fosforilar a la cinasa de RNA, aunque las otras dos subunidades de esta protena funcionan como enzimas de desenrrollan al DNA (helicasa)

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La actividad de helicasa de DNA es necesaria para separar las cadenas de DNA del promotor, lo que hace posible el acceso de la polimerasa a la cadena molde.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Una vez que la transcripcin comienza, algunos de los GTF (incluido el TFIID pueden abandonarse al lado del promotor, mientras que otros se liberan del complejo.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Cuanto ms permanezca el TFIID unido al promotor, ms molculas de polimerasa de RNA pueden unirse al sitio promotor e iniciar nuevos procesos de transcripcin sin retraso.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La regin carboxilo terminal de la subunidad ms grande de la polimerasa RNA II tiene una estructura poco comn, que consiste en una secuencia de siete aminocidos que se repiten una y otra vez (Tir-Ser-Pro-Tre-SerPro-Ser).

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


En mamferos la CTD tiene 54 repeticiones de este heptapptido. De los siete aminocidos, las serinas 2 y 5 son las primeras candiadatas para la fosforiclacin por la cinasa de protena.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La polimerasa de RNA que se ensambla en el complejo de preinicio no se fosforila, en tanto que la misma enzima que se compromete con la transcripcin est muy fosforilada, todos los grupo fosfato, que se unen se hallan en la CTD.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La fosforilacin de la CTD puede realizarla al menos cuatro cinasas diferentes, incluido el TFIIH.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


La fosforilacin de la polimerasa puede actuar como activador que desacopla la enzima del GTF o el DNA promotor, lo que posibilita a la enzima escapar del complejo de preinicio y moverse corriente abajo en el DNA molde.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


Una polimerasa de RNA comprometida con la elongacin puede relacionarse con diferentes protenas accesorias grandes.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


De acuerdo con algunas estimaciones, una polimerasa de RNA en elongacin es parte de un gran complejo constituido por ms de 50 componentes y una masa molecular total de tres millones de daltones.

La maquinaria para la transcripcin del mRNA


En conjunto, la polimerasa de RNA II y sus GTF son suficientes para promoner un nivel basal bajo de transcripcin de la mayora de los promotores in vitro.

Estructura de los mRNA


Los RNA mensajeros muestran ciertas propiedades:
1. Contienen secuencias contnuas de nucletidos que codifican un polipptido especfico. 2. Se encuentran en el citoplasma 3. Se vinculan con los ribosomas cuando se traducen 4. La mayora de los mRNA contienen un segmento importante que no codifica, esto es, una porcin que no codifica al ensamble de los aminocidos.

Estructura de los mRNA


Ejemplo:
Cerca del 25% de la cadena de RNA mensajero de globina consiste en regiones no codificantes ni traducidas. Las regiones no codificantes se encuentran en ambos extremos terminales 5y 3del mRNA y contiene secuencias que ejercen funciones reguladoras de importancia

Estructura de los mRNA


Los RNA mensajeros muestran ciertas propiedades (cont.):
5. El mRNA eucariota tiene modificaciones especiales en sus extremos 5y 3terminales que no se encuentran ni en los mensajeros procariotas ni en los RNA de transferenci o ribosomales. El extremo 3 terminal del RNA mensajero de casi todos los organismos eucariotas posee:

una secuencia de 50 a 250 residuos de adenosina que forman una cola de poli (A), el extremo 5tiene una tapa o capa de guanosina metilada.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Tan pronto se descubrieron los hnRNA, se propuso que este grupo de RNA nucleares marcados con rapidez era el precursor de los RNA citoplamticos.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


El punto ms importante fue la diferencia en el tamao entre las dos poblaciones de RNA:
los hn RNA fueron varias veces ms grandes que los RNA mensajeros.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Por que deberan las clulas sintetizar grandes molculas precursoras de las versiones ms pequeas?

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Estudios iniciales sobre el procesamiento del RNA ribosomal haban mostrado que los RNA maduros procedan de grandes precursores.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Hay que recordar que se removieron grandes segmentos a partir de los extremos 5y 3de diferentes rRNA intermediarios para generar al final un rRNA maduro.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Anterior se pensaba que la clula segua una va similar para el procesamiento de hnRNA para formar los RNA mensajeros.

Sin embargo, los RNA mensajeros constituyen poblaciones mucho ms diversas que dificultan seguir sus pasos durante el procesamiento de una sola especie de RNA mensajero, como se haba ensayado para los rRNA.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


El problema lo resolvi un descubrimiento inesperado. Hasta el ao de 1977 los bilogos moleculares asuman que una secuencia lineal y contnua de nucletidos en un RNA mensajero era complementario de una secuencia contnua de nucletidos en una cadena del DNA de un gen.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


En 1977 varios investigadores encontraron que los mRNA estudiados se transcribian a partir de segmentos de DNA separados unos de otros a lo largo de la cadena molde.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Las primeras obervaciones en veradad relevantes se hicieron durante el anlisis de transcripcin del genoma de adenovirus. El adenovirus es un patgeno capaz de infectar a gran nmero de clulas de mamferos.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Se encontr que en un nmero de RNA mensajeros de diferentes adenovirus tenian el mismo extremo 5terminal de 150 a 200 nucletidos. Era de esperar que tal secuencia lder representara un segmento repetido de nucletidos localizado cerca de la regin promotora de cada uno de los genes que codifican este RNA mensajero

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Sin embargo, anlisis posteriores revelaron que la secuencia lder 5no se complementaria de una secuencia repetida y, an ms, ni siquiera es complementaria de un tramo contnuo de nucletidos en el DNA molde.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


En el lugar de ello, la secuencia principal se transcribe a partir de tres segmentos de DNA distintos y separados. Las regiones del DNA situadas entre estos segmentos, conocidas como secuencias interpuestas, estn ausentes por alguna razn en el RNA mensajero correspondiente.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Se pudiera deducir que la secuencia de secuencias interpuestas es una peculiaridad de los genomas virales, pero esta observacin bsica pronto se ampli a los propios gese celulares.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


En 1977 Jeffreys y Flavell en los paises bajos y Chambon en Francia notificaron por primera vez la presencia de secuencias interpuestas en genomas celulares no virales. Jeffreys y Flavell descubrieron una secuencia interpuesta de unas 600 bases situadas directamente dentro de una parte del gen de la globina que condifica a la secuencia aminoacdica del polipptido globina.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


A los genes con estas secuencias interpuestas, llamadas genes de procesamiento de corte y empalme que contribuyen a la maduracin del producto de RNA se conocen como exones, en tanto que las secuencias interpuestas se denominan intrones.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Los genes de corte y empalme se distribuyen con amplitud en los eucariotas. Los intrones de los eucariotas ms simples casi siempre muestran un nmero y tamao menores respecto de los ms complejos de plantas y animales.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Lo intrones se encuentran en todos los tipos de genes, incluidos los que codifican a:
RNA de transferenci RNA ribosomales RNA mensajeros

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


El descubrimiento de genes con intrones dio paso inmediato a preguntarse de que forma stos genes eran capaces de producir los RNA mensajeros sin estas consecuencias.

Una posibilidad era que las clulas generaran una transcripcin primaria correspondiente a toda la unidad de transcripcin primaria correspondiente y que las porciones de RNA correspondientes a los intrones de DNA se eliminarn de alguna manera.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


En la transcripcin primaria deberan estr presentes los segmentos correspondientes de los intrones. Tal razonamiento deba tambin explicar el tamao mucho mayor de las molculas de los hnRNA en comparacin con las molculas del RNA mensajero que al final generan.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


La investigacin enfocada en el RNA nuclear a continuado en los ltimos aos a tal grado que han determinado las dimensiones de unos cuantos RNA mensajeros (pre-mRNA).

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Por ejemplo:
Se observ que la secuencia de la globina est presente en una molcula de RNA nuclear que se sedimenta a 15S a diferencia del RNA mensajero de la globina final cuyo coeficiente de sedimentacin es de 10 S.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Para ello se utiliz una tcnica ingeniosa (conocida como formacin del asa R) que emplearon los investigadores Tilgham, Leder y colaboradores para determinar la relacin fsica entre los RNA de globina 15S y 10s y generar informacin sobre la transcripcin de los genes procesado.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Hay que recordar la evidencia segn la cual las cadenas simples de DNA complementario pueden unirse de manera especfic entre s. Tambin pueden enlazarse entre s el DNA de cadena nica y las molculas de RNA, siempre que tengan secuencias complementarias de nucletidos.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Tilghman y colaboradores recurrieron a la microscopa electrnica para examiar los fragmentos de DNA del gen de la globina hibridado con el RNA de la globina 15S. Se advirti que el hbrido posea una doble cadena contnua del complejo DNA-RNA.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


En cambio cundo el mismo fragmento de DNA se incub con el RNA mensajero de la globina madura 10S, un largo segmento de DNA en el centro de la regin codificante se reconoci como una protuberancia que formaba una asa de doble cadena.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


El asa resultante estaba formada por un gran intrn en el DNA que no fue complementario en ninguna regin del RNA mensajero pequeo de la globina.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Fue evidente que el RNA 15S contea los segmentos correspondientes a los intrones de los genes que se remueven durante la formacin del RNA mensajero 10S.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Se efectu un experimento similar de hibridacin entre el DNA que codifica a la ovoalbmina, una protena que se encuentra en los huevos de la gallina, y su correspondiente RNA mensajero.

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


El DNA de ovoalbmina y el RNA mensajero hbrido contienen siete asas distintas que corresponden a siete intrones. En conjunto los intrones representan cerca de tres veces el DNA presente en las ocho porciones codificantes combinadas (exones).

Procesamiento de genes: un hallazgo inesperado


Estudios posteriores han revelado que los exones individuales promedian alrededor de 150 nucletios. En cambio los intrones individuales tienen cerca de 3500 nucletidos, lo cual explica porque las molculas de hnRNA son mucho ms largas que los mRNA

El procesamiento de los mRNA eucariotas


La polimerasa RNA II genera una transcripcin primaria complementaria del DNA de toda la unidad de transcripcin.

El examen mediante microscopa electrnica de genes capaces de transcribir indica que las transcripciones de RNA se vinculan con diferentes protenas y numerosas partculas distintas, mientras aun se encuentran en proceso de sntesis.

El procesamiento de los mRNA eucariotas


Estas partculas que consisten en protenas y ribonucleoprotenas incluyen los agentes encargados de convertir la transcripcin primaria en un RNA mensajero maduro.

El procesamiento de los mRNA eucariotas


Este proceso de conversin requiere la adicin de la estructura cap (casquete) en el extremo 5y una cola de poli (A) en los extremos 3de la transcripcin, adems de la eliminacin de cualquier secuencia de intrn.

El procesamiento de los mRNA eucariotas


Una vez completo el procesamiento, el mRNP, que consta de RNA y protenas relacionadas, est listo para exportarse del ncleo.

Extremos 5y colas poli(A)


Los extremos 5de todos los RNA poseen de manera primaria un trifosfato derivado del primer trifosfato de nuclesido incorporado al sitio de inicio de la sntesis de RNA.

Extremos 5y colas poli(A)


Una vez que el 5 terminal de un precursor de RNA mensajero se sintetiza, diferentes actividades enzimticas actan en este extremo de la molcula.

Extremos 5y colas poli(A)


En un primer paso, el ltimo de los tres fosfatos se remueve y convierte el extremo 5 terminal en un difosfato.

Extremos 5y colas poli(A)


Entonces se adiciona un GMP en orientacin invertida de tal modo que el extremo 5 terminal de la guanosina se halla frente al extremo 5de la cadena de RNA (paso 2)

Extremos 5y colas poli(A)


El extremo 5del RNA contiene entonces un capuchn de metilguanosina. Estas modificaciones enzimticas del extremo 5de la transcripcin primaria ocurren con gran rapidez, mientras que la molcula de RNA contina en su estado temprano de sntesis.

Extremos 5y colas poli(A)


De hecho, la regin carboxilo terminal de la polimerasa recluta a las enzimas que realizan el capping.

Extremos 5y colas poli(A)


El capuchn de metilguanosina en el extremo 5de un mRNA tiene diferentes funciones:
Previene que las exonucleasas digieran el extremo 5del mRNA Favorece el transporte del mRNA fuera del ncleo Tiene un papel importante en el inicio de la traduccin del mRNA.

Extremos 5y colas poli(A)


El extremo 3de un RNA mensajero contiene una cadena de residuos de adenosina que forman una cola poli (A). La cola poli (A) comienza invariablemente unos 20 nucletidos corriente debajo de la secuencia AAUAAA.

Extremos 5y colas poli(A)


En la transcripcin primaria esta secuencia sirve como sitio de reconocimiento para el ensamble de un complejo de protenas que realizan mecanismos de procesamiento en el extremo 3del RNA mensajero.

Extremos 5y colas poli(A)


El complejo de procesamiento del ensamblado de poli (A) tambin se relaciona de manera fsica con la polimerasa de RNA cuando sta sintetiza la transcripcin primaria.

Extremos 5y colas poli(A)


Dentro de las protenas del complejo de procesamiento se encuentra una endonucleasa, que corta a la molcula de pre-mRNA corriente abajo respecto del sitio de reconocimiento. Luego del corte por la nucleasa, una enzima conocida como polimerasa de poli (A) agrega 250 o ms adenosinas sin la necesidad de un molde.

Extremos 5y colas poli(A)


La cola de poli (A) junto con una protena adjunta protegen al mRNA de la degradacin prematura por exonucleasas.

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Los pasos clave en el procesamiento del premRNA se muestra en la siguiente figura:

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Adems de la formacinde Casquete 5 Cola de poli (A) Splicing del RNA

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Para procesar un RNA deben efectuarse cortes en la cadena de ese RNA en los extremos 5y 3( o sitios de splincing) de cada intrn y los exones situados a cada lado de los sitios de splicing, deben unirse de nueva cuenta de manera covalente (ligados).

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Es importante que el procesamiento ocurra con exactitud, debido a que la adicin o prdida de un solo nucletido en cualesquiera de las uniones de splicing podra causar que el mRNA resultante se tradujera de modo equvoco.

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA

De que manera la maquinaria bsica de splicing reconoce las uniones exn-intrn en miles de diferentes pre-mRNA?

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


El anlisis de cientos de uniones entre los exones e intrones en eucariotas, revela la presencia de los sitios de splicing de una secuencia nucleotdica conservada y originada en la evolucin ancestral.

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Se muestra la secuencia identificada ms a menudo en los bordes de la unin exn-intrn de las molculas de pre-mRNA de mamferos.

El G/GU en el sitio 5 terminal del intrn (sitio de splicing 5), el AG/G en el extremo 3del intrn (sitio de splicing 3) y la secuencia de polipirimidinas cercana al sitio de splicing 3estn presentes en la gran mayora de la molculas de pre-mRNA eucariotas.

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Adems, las regiones adyacentes del intrn contienen nucletidos preferidos, los cuales poseen una funcin relevante en el reconocimiento del sitio de splicing, pero no son suficientes.

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Por lo general, los intrones se presentan en la forma de miles de nucletidos y a menudo contienen segmentos internos que semejan la secuencia consenso mostrada en la figura

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Si bien las clulas no los reconocen como seales de splicing y por consecuencia los ignoran Las adiciones de seales que permiten a la maquinaria de splicing distingur entre exones e intrones se debe quiz a secuencias especficas (llamadas aumentadoras del splicing exnico o ESE) situadas dentro de los exones.

Procesamiento del RNA: remocin de intrones de un pre-mRNA


Los cambios en la secuencia de DNA dentro del sitio de splicing o en un ESE pueden llevar a la inclusin de un intn o la exclusin de un exn. Se estima que ms del 15% de las enfermedades humanas hereditarias se debe a mutaciones que alteran el splicing del premRNA