Generalidades del proceso de fijacin

Microscopia electrnica Alumna: Miriam Elena Diego Jacinto

Propsitos
Preservar la estructura del tejido vivo sin alguna alteracin de este estado. (Un fijado ideal debe detener el potencial del proceso autoltico destructivo al mismo tiempo que fija) Protege al tejido contra la disrupcin durante el embebido, seccionado y subsecuente exposicin al haz de electrones.

 Se selecciona un protocolo particular de fijacin dependiendo de la habilidad del mtodo para preservar una ultraestructura sobre otra.

 Tetraxido de osmio fue el primer fijador (sumergidos en o expuestos a vapores). Claude , 1948. Tetraxido de osmio / buffer fisiolgico. Palade, 1952. Permanganato de potasio. Luft, 1956. Glutaraldehido- tetraxido de osmio. 1963 Fijacin primaria con glutaraldehido seguida por una segunda exposicin a tetraxido de osmio. Los protocolos desarrollados subsecuentemente son modificaciones de estos dos pasos bsicos.(Protocolos para clulas o tejidos particulares)

Historicamente

 Uno de los logros sobresalientes es el empleo del uso del sistema vascular intacto del animal para introducir el fijador en los tejidos , permite la rpida exposicin del fijador a los elementos del tejido.

Fijacin qumica
Glutaraldehido.

Los grupos aldehido reaccionan con los grupos amino de la lisina en protenas adyacentes llevndose a cabo el cross-linking

 Tetraxido de osmio. Es un fijador secundario que reacciona principalmente con estructuras lipdicas. Oxida enlaces insaturados (doble o triples) de los cidos grasos , as mismo se reduce, esto es lo que da contraste y densidad al tejido biolgico. Actua tambin como mordente (mejora de la tincin)

Seleccin del fijador y el buffer

Al seleccionar el fijador es importante conocer con que se trabaj en el pasado para el tejido en consideracin, teniendo en cuenta las condiciones particulares a ser empleadas. Adems hay que determinar las caractersticas del tejido a ser enfatizadas en el estudio.

Buffers
Si durante la fijacin primaria no se usa un sistema amortiguador el pH del tejido tiende a disminuir drsticamente durante el proceso de fijacin Se pueden producir artefactos. El sistema amortiguador mantiene el tejido en un pH fisiolgico 7.2 a 7.4 en mamferos , 6.8 en bacterias. Tambin es importante considerar la osmolaridad.

Inmersin y fijacin por perfusin.

Podemos sumergir al tejido dentro del fijador o podemos utilizar el sistema vascular para fijar el tejido. Durante la perfusin el fijador es distribuido a los tejidos a traves de los vasos sanguneos (no aplica para organismos pequeos)

Inmersin
Es importante tener en cuenta la penetracin lenta del glutaraldehido. Por lo general una cuchilla afilada, una navaja limpia se utilizan para cortar el tejido en pequeos cubitos , que son sumergidos en glutaraldehido en un vial pequeo (volumen de 5 a 10 veces mayor). Tiempo mnimo 1 hora Tambin existe la inmersin por centrifugacin

Fijacin por perfusin

 Es necesario conocer el sistema circulatorio de la especie. Por lo general el plan de perfusin vascular consiste en introducir el fijador en el sistema arterial para permitir su salida por un corte en el sistema venal. Primeramente se introduce solucin fisiolgica algunas veces con anticoagulante. Perfusin de 20 a 45 minutos 1 hora o 2 en un vial con glutaraldehido.

Condiciones de la fijacin
Existen necesidades especiales para cada tejido para obtener una fijacin ptima. La fijacin primaria y primaria con tetra xido de osmio se lleva a cabo a 4C (minimiza la autolisis y cambios estructurales en el tejido). Durante la fijacin primaria el tejido puede agitarse ligera y peridicamente. Vehculo del tetra xido de osmio agua o buffer

Preparacin de la muestra asistido por micro-ondas

Con el uso de hornos de micro ondas hay un decremento en el tiempo de fijacin, hay una mejora de la preservacin estructural, mejor retencin de lpidos y protenas solubles, mejor preservacin de la reactividad antignica, menor tiempo de polimerizacin, etc.

 Exposicin por no ms de 30 a 60 segundos Mantener la temperatura por debajo de 50 a 55 C Se mantiene la muestra en su envase. Incluye un contenedor de agua que absorba el exceso de energia .

Mtodo de congelacin para preparacin de la muestra

El congelado ultra rpido provee una preservacin ultraestructural superior, se congelan las molculas en un solo lugar conservando su forma natural. Solo se utiliza en condiciones especiales.

Otros protocolos de fijacin

Fijacin de karnovsky Con osmio reducido con Ferrocianida Con permanganato de potasio.