CITOMETRIA DE FLUJO

Citometra de Flujo

PARMETROS CELULARES MEDIDOS

El tamao celular relativo La complejidad interna o granularidad relativa

Intensidades relativas de emisin de fluorescencia

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El tamao celular relativo LUZ DIFRACTADA

- SE RELACIONA CON LA SUPERFICIE Y AREA CELULARES -SE DETECTA EN EL EJE DE INCIDENCIA DEL LASER

La complejidad interna o granularidad relativa LUZ REFLEJADA Y REFRACTADA

-SE RELACIONA CON LA COMPLEJIDAD INTERNA DE LA CELULA Y SU GRANULARIDAD

Intensidades relativas de emisin de fluorescencia

-SE DETECTA EN UN ANGULO DE 90 GRADOS CON EL HAZ DEL LASER

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MARCACION DE CELULAS CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES Se utilizan, generalmente, inmunoglobulinas monoclonales contra antgenos de la supercicie de las celulas, marcadas con colorantes fluorescentes. Control negativo: Anticuerpo del mismo isotipo marcado con el mismo fluorocromo pero que no reconoce ninguna de las molculas de la superficie. Control negativo: clulas que no fueron marcadas para determinar autofluorescencia. Control positivo: clulas normales, clulas de lneas celulares.

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Fluorocromos utilizados

FL1

FL2

FL4 FL3

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ANALISIS DE DATOS Los datos colectados por el citometro los podemos Los datos colectados se analizar de 2 maneras: pueden observar de 2 1) Histograma: Muestra cuantas celulas estan maneras: marcadas con cierto color, y las distintas intensidades de fluorescencia de cada una. 1) Histograma
Eventos medidos

2) Dot-plot: Muestra 2 valores a la vez, y cada punto representa una celula individual. Se dividen en general en los 4 cuadrantes.

FLUORESCENCIA

HISTOGRAMA

En este grafico vemos el pico del control de isotipo (gris), que me marca lo que se considera que no hay marca. Y despues veo 2 poblaciones con distinta intensidad de fluorescencia.

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Intensidad de fluorescencia y sitios de unin

FITC
FITC Nmero de eventos FITC FITC FITC

FITC FITC
FITC FITC FITC

Intensidad de fluorescencia FITC

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Los datos colectados se pueden observar de 2 maneras: 2) Dot-plot

1)Dot-plot: Muestra 2 valores a la vez, y cada punto representa una celula individual. Se dividen en general en los 4 cuadrantes.

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Analisis de datos

Granulocitos

Monocitos Linfocitos

Aca vemos un resultado real. Vemos una muestra de sangre periferica, donde podemos reconocer las 3 subpoblaciones de leucocitos. Los GR y plaq son mas chicos. Las 3 poblaciones de leucocitos las reconozco mediante dot-plot de forward-scatter. Ademas esas celulas las marque con antiCD3 y anti CD4, y veo los histogramas de CD3 y CD4.

Elijo un gate: Ej. linfocitos

CD3- CD4 en sangre total

CD3 CD4 en gate de linfocitos

Aca vemos marca de CD3 y CD4. Queremos saber el porcentaje de CD3 y CD4 en sangre entera (ver porcentajes en cuadrantes) y en el gate de linfocitos.

Expresin de Resultados
Datos porcentuales Datos absolutos : Partculas de cuantificacin Datos estadsticos
Qua drant Sta ti sti cs Fi l e: No rma l0 1.05 Sa mp le ID: Tu be: CD3/CD8 Acqui si tio n Date: 1 5-Jun -9 5 Gated E ven ts: 23 83 X Parame te r: FL1-H CD3 (Lo g) Qua d Locatio n: 1 7, 1 7 Lo g Data Uni ts: L in ear Val ues Pa ti ent ID: Pa nel : IMK-Lymp hocyte Gate: G1 To tal Eve nts: 6000 Y Parame te r: FL2-H CD8 (Lo g)

Qua d Events % Gated % Total X Mean X Geo Mea n Y Mean Y Geo Mea n UL 12 6 5.29 2.10 4.51 4.12 32 4.82 17 1.35 UR 50 8 21 .3 2 8.47 26 8.00 24 9.17 24 72.09 16 24.51 LL 42 0 17 .6 2 7.00 3.92 3.50 3.13 2.53 LR 13 29 55 .7 7 22 .1 5 30 6.66 28 9.43 1.50 1.28

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 EL programa tambien nos provee datos de: -Porcentaje de celulas en el gate que yo elegi o en cada cuadrante -El promedio de fluorescencia de ese gate para la FL de X y para la de Y

Separacin de clulas usando citometra de flujo (Cell sorting)

-El citmetro permite separar fsicamente, poblaciones de clulas -Se puede realizar en condiciones de esterilidad.

La separacion de las celulas de interes se realiza por aplicacin de una carga electrica a las gotas. El equipo mira la celula y si esa gota tiene una celula de interes le agrega una carga. Esa gota cargada es deflectada por electrodos hacia el tubo de coleccin. Luego uno lo que hace es volver a pasar la muestra por el citometro, para determinar la pureza de la poblacion y su fluorescencia.
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Basal

Despus del cultivo

CFSE

Fluorescencia / clula
X X/2 X/4

M1

Se observan los picos que representan las distintas generaciones de celulasprovenientes de la proliferacion de las celulas parentales.

Cytometric bead arrays (CBA)

Varios analitos

Ac. unidos a beads, emitiendo a distintas intesidades de FL3

Ac conjugados con PE (emitiendo en FL2), proporcionales a la conc del analito.

Tonos de un color

Multiplex ensayo por CF

Citoquinas Determinacin de citoquinas secretadas por citometra

CBA para citoquinas inflamatorias

IL-6 IL-10 MCP-1 IFN-g TNF-a IL-12

PBS

CBE

FL-2

FL-2

FL-2: Da cuenta de la concentracin de la citoquina. FL-3: Da cuenta de las diferentes citoquinas.

Citoquinas Determinacin de citoquinas secretadas por citometra

Medida de fluorescencia en clulas individuales por citometra de flujo Propiedades

Es especfica de color
Es cuantitativa con un amplio rango de medida Alta velocidad

Ventajas
Permite estudio multiparamtrico simultneo
Altsima sensibilidad
1974(3000mol/cel) 2003 (300mol/cel)

Mide en cantidades elevadas de clulas Obtener conclusiones estadsticamente fidedignas objetivas y reproducibles