Sunteți pe pagina 1din 93

ENZIME

ENZIMOLOGIA
medicin biologia molecular industria farmaceutic ingineria genetic industria textil microbiologia analize chimice biotehnologia

Enzime
Bariere energetice; Cataliz; Reacii termodinamic posibile; Cinetica; Ea; Cataliz Biocataliz; Rol: - anabolic (biosintetic); - catabolic (degradativ); - amfibolic (biosintetic i degradativ).

PROPRIETATI ENZIME
enzimele catalizeaz doar reactiile posibile din punct de vedere termodinamic

n general reactii reversibile accelereaza atingerea acestor echilibre, cataliznd, n mod egal att reactia direct, ct si cea invers)

PROPRIETATI ENZIME
mresc viteza reactiilor enzimatice fr s se consume cantitati mici de enzim catalizeaz transformarea unor cantitti mari de substrat, fr a modifica echilibrul i propriettile termodinamice ale sistemului cu care interactioneaz

Denumire
trivial (nesugestiv); sufixul aza; sistematic EC: clasa; subclasa; sub-subclasa poziia enzimei n sub-subclas.

Creatinkinaza E.C.2.7.3.2
denumirea tiinific - ATP

creatinfosfotransferaza
2. denumirea clasei (transferaze) 7. denumirea subclasei (fosfotransferaze) 3. denumirea sub-subclasei (fosfotransferaze cu grupare acceptoare) 2. poziia enzimei n sub-subclas.

1. Oxidoreductaze;
2. Transferaze; 3. Hidrolaze; 4. Liaze;

5. Izomeraze;
6. Ligaze.

PROPRIETATI ENZIME
1. oxidoreductaze - catalizaz reaciile de oxido-reducere (transfer de hidrogen sau electroni) ce au loc n organismele vii Sred + S'ox Sox + S'red 2. transferaze - catalizeaz reacia de transferare a unor grupri de atomi de pe un substrat pe altul, fr ca aceste grupri s existe libere n timpul procesului S-R + A S + A-R

3. hidrolaze - catalizeaz scindarea diferitelor legturi covalente din molecula substratului, cu participarea moleculelor de ap in vivo S-R + H2O S-OH + R-H

PROPRIETATI ENZIME
4. liaze - catalizeaz reactii de degradare, n care intervin procese de hidroliz sau procese redox 5. izomeraze - catalizeaz reactii de izomerizare ale substratului 6. ligaze (sintetaze) - catalizeaz formarea de noi legturi chimice (reactii de sintez), n majoritatea cazurilor utilizndu-se energia stocat n legturile macroergice ale moleculelor de ATP

PROPRIETATI ENZIME
- enzime monomere - sunt formate dintr-un singur lan polipeptidic

- enzime oligomere - sunt formate din dou sau mai multe lanuri polipeptidice asociate ntr-o macromolecul compact (structur cuaternar)

Izoenzime
- forme moleculare multiple ale unei enzime - catalizeaz aceeasi reactie chimic (prezint fenomenul de polimorfism). - Au originea n aceeasi celul, tesut sau lichid biologic dintr-un organism.

- specificitate fat de acelasi substrat - activitate catalitic identic

Izoenzime
lactat dehidrogenazele (LDH) - 5 izoenzime creatinkinaza (CK) - dimer

Izoenzime
au configuratii diferite unele proprieti fizico-chimice diferite: - mobilitate electroforetic, - cinetic de reacie, - mod de inhibare, - pH optim de aciune, - actiunea asupra substraturilor secundare - specificitate; - stabilitate; - antigenitate

Specificul izoenzimelor:
asamblarea mai multor tipuri de catene; gene distincte - gen ancestral; specializri fiziologice ale izoenzimelor; enzime i precursori (zimogeni); izoenzimele se pot asocia: peptide, cofactori, nucleotide.

LDH

proteina de tip M (muchi scheletici) + proteina de tip H (inim

LDH
Pentru specia om, genele care codific lanurile M i H aparin unor cromozomi diferii. n esuturile cu metabolism oxidativ (creier, inim, rinichi) predomin izoenzima LDH1, n esuturile cu metabolism glicolitic (anaerob) accentuat (muchi scheletici) predomin izoenzimele LDH4 i LDH5.

Sisteme (complexe) multienzimatice


- asocierea enzimelor prin legturi necovalente, n vederea participrii la reacii enzimatice succesive sau cuplate, -

unde E1, E2,..., En - enzime; A, B, C,,M - intermediari

Specificitatea reaciei enzimatice


- este determinat de interaciile necovalente (van der Waals, electrostatice, legturi de hidrogen, fore hidrofobe) ntre enzim i substrat, pentru formarea produsului de reacie

Complementaritatea geometric i electronic - dat de structura unei regiuni sau zone din moleculele acesteia (aminoacizi ai catenei peptidice apropiai spaial) i gruprile funcionale prezentate pe substraturi.

Specificitatea reaciei enzimatice

nalt grad de specificitate - complementaritate; Substrat; Interacii slabe E - S; Produi de reacie; Centru catalitic (situs catalitic); Aciune: asupra unui substrat (absolut): geometric; stereospecific; asupra unui grup de substraturi (relativ, de grup).

Enzime alosterice: situs alosteric; efector alosteric; cofactor - exogen; coenzima faciliteaz: schimb de protoni; schimb de electroni; transfer grupri funcionale; torsionarea unor legturi. Holoenzim; Apoenzim;

Legarea cofactorului la centrul alosteric al enzimei

Cofactorul
Organizeaz spaial molecula enzimei centrul activ acioneaza specific substratului. asupra

Complexul catalitic enzim-cofactor se numete holoenzim. Cofactorii pot sa fie de natur anorganic sau organic (coenzime = factori de cretere) Dac din holoenzim se ndeprteaz cofactorul, protreina rmas este inactiv din punct de vedere catalitic = apoenzim

Proprietate

Apoenzime

Cofactori

natur chimic

organic
(proteine)

Anorganic
organic
(coenzime)

mas molecular
comportare la dializ comportare la modificri de temperatur

mare
nedializabile termolabile

mic
dializabili termostabili

Enzime alosterice
Proprietile caracteristice enzimelor alosterice: - posed structur cuaternar; - posed o comportare nemichaelian; - sufer modificri conformaionale (modulare); - posed funcii reglatoare n metabolism. Efecte de reglare n care intervin situsuri: - heterotropice (situsuri diferite) - homotropice (situsuri identice).

Proteoliza limitat (zimogeni)

Enzimele n plasma sanguin: - specifice - active n plasm (colinesteraza, LPL); - enzime eliminate din celule ca rezultat al unui turnover celular normal - nu au funcii n plasm (CK, LD, GOT, GPT); - secretate de anumite esuturi i transportate prin snge la alte esuturi (PAL).

Prezena plasmatic a unor enzime de origine celular n concentraii mari: - permeabilitate membranar din afeciuni patologice; - citoliz - deversare n snge a enzimelor din esutul afectat (lezat); - difuzie - simpl suferin celular; - o simpl modificare metabolic; - creterea sintezei unei enzime: - de natur fizic (colestaz); - de natur biochimic (inflamaia).

Semnificaia clinic a unor enzime n organismul uman

Evoluia n timp a [E] n infarctul miocardic: Enzima Debut (h) Maxim (h) Revenire (h) CK (CPK) 6 TGO (AST) 12 LDH (LD) 20 20 36 72 96 144 192

Energia de activare
Ea - reprezint cantitatea minim de energie necesar unui sistem reactant de a se transforma n produi finali.

Diagrama energetic a procesului 1. necatalizat 2. n prezena unui catalizator chimic 3. n prezena enzimei specifice

Viteza de reactie

E+ S
d[S] v dt

k1 k-1

ES

k2

E+ P

dP v dt

Ecuaia Michaelis-Menten
E+ S
k1 k-1

ES

k2

E+ P

v 0 v max

[S] [S] K M

k 2 E v max
KM k 1 k 2 k1

Ecuatia Lineweaver-Burk
1 KM 1 1 v v max [S] v max

Ecuaia Hanes-Woolf
KM [S] 1 [S] v v max v max

Ecuaia Eadie-Hofstee
v v K M v max [S]

Caracteristicile reactiei
Constanta Michaelis-Menten Viteza maxima a procesului enzimatic
Vm = k2 [E]

k2 = Contanta vitezei catalitice = activitate


molecular = turnover - prin numrul de molecule de substrat care sunt convertite de o singur molecul de catalizator, n unitatea de timp

Caracteristicile reactiei
1/k2 = ciclu catalitic

Constanta de viteza k2 este coeficientul cinetic esenial i reprezint puterea catalitic intrinsec a proteinenzimei = numrul de molecule de substrat care sunt convertite de o singur molecul de catalizator, n unitatea de timp. Constanta k2 desemneaz etapa limitant a unui proces complex i prezint o valoare foarte mic n raport cu k-1, care este constanta de ordinul I a disocierii complexului ES.

Raportul k2/Km reprezint constanta de vitez aparent a reaciei dintre substrat i enzima liber.

Activitatea enzimatic
Unitatea de activitate enzimatic (U) reprezint cantitatea de enzim care poate cataliza, n condiii experimentale definite, transformarea unui mmol de substrat, ntr-un minut i un litru. Activitatea enzimatic specific este definit prin numrul unitilor enzimatice, raportate la 1mg de enzim (U/mg).

Activitatea enzimatic
Activitatea enzimatic molar (molecular) este indicat de numrul de molecule de substrat transformate n produi, ntr-un minut, sub influena unui mol de enzim.
Katalul (Kat) reprezint cantitatea de enzim care transform 1 mol de substrat ntr-o secund.

Unitatea de activitate enzimatic (U): cantitatea E care catalizeaz 1 M S / minut L; Activitatea enzimatic specific: Nr. U / 1mg protein-enzim (U/mg); Activitatea enzimatic molecular: Nr. mol S transformate de 1 mol E / minut.

Katal-ul: AE care transform 1 mol S / s. Dac [E] se raporteaz / L: 1U = 60 Katal.

Factorii care influeeaz viteza de reacie (activitatea enzimatic)


1. Concentraia enzimei
2. Natura i concentraia substratului
3. Temperatura 4. pH-ul 5. Influena efectorilor
5.1. Activarea 5.2. Inhibiia a) ireversibil (otrvirea)

b) reversibil -competitiv si necompetitivia

6. Ali factori: ionii din mediu, detergenii, potenialul redox al mediului, presiunea, radiaiile UV, X, b

1. Concentraia enzimei
[ P] v0 k [ E] t

analizele medicale (mai ales ale sngelui), deoarece variaiile sunt corelate cu diferite stri patologice

2. Natura i concentraia substratului

Constanta KM este independent de concentraia enzimei, fiind caracteristic cuplului enzim-substrat studiat.
Teoria Michaelis-Menten - zona (a): pentru [S]<<KM se obine dependen liniar indic o reacie de ordinul nti. - zona (b): arc de hiperbol echilater, ceea ce corespunde unei reacii de ordin fracionar - zona (c): pentru [S] >> KM se obine un palier si ordin de reactie zero

3. Temperatura
Determinarea AE se recomanda la 250C, cnd gradul de denaturare este aproape nul, iar viteza de reacie, dei este mic, este proporional cu timpul. ntre 00C i 400C activitatea celor mai multe enzime se dubleaz cnd temperatura crete cu 100C. Temp. 0-40C = temperaturi de conservare pentru majoritatea enzimelor.

k = A e-Ea/RT

4. pH-ul

pepsina din sucul gastric pH=1,54,0; arginaza la un pH>10, enzimele de origine animal au n general ca pH al aciunii maxime intervalul de pH fiziologic

Enzima Ureaza Pepsina Ribonucleaza Tripsina Fosfataza alcalin Fosfataza acid Arginaza

Interval optim de pH 6 6,6 2 2,5 7-8 8-9 8,5 - 9 4,5 5,5 10 - 11

5. Influena efectorilor
Efectorii enzimatici sunt substane chimice care prin prezena lor n mediul de reacie modific activitatea catalitic a enzimei (scznd-o sau mrind-o). Acetia pot fi deci inhibitori sau activatori enzimatici. Se remarc dublul rol al efectorilor: - rol biologic - prin reglarea metabolismului - rol biochimic - prin furnizarea unor date preioase n legtur cu mecanismul de participare al enzimelor la reaciile chimice

Activarea
Activatorii pot fi de natur anorganic i organic. Dintre cei de natur anorganic, se cunoate aciunea ionilor cu numere atomice ntre 1 i 35, a unor lantanide i a unor anioni (Cl-, Br-, NO3-, ClO3- - asupra amilazei salivare). Un alt tip de activare este cea prin antiinhibiie care const n nlturarea unei substane inhibitoare care mpiedic desfurarea reaciei enzimatice (cianurile alcaline activeaz ureaza inhibat de srurile de Cu2+).

Inhibiia
Inhibitorii sunt acele substane care prin prezena lor diminueaz sau anihileaz activitatea catalitic a enzimei. Aplicatii utilizarea lor poate oferi informaii cu privire la natura gruprilor funcionale din centrul catalitic al enzimei, precum i a aminoacizilor implicai n meninerea conformaiei speciale a enzimei ofer informaii despre specificitatea de substrat a enzimei inhibiia unor enzime cu componeni celulari specifici constituie un element n controlul reaciilor enzimatice utilizarea unor medicamente n terapie se bazeaz pe inhibarea specific a unor enzime.

a) Inhibiia ireversibil (otrvirea)


Inhibitorul ireversibil se poate lega de enzim prin legturi covalente sau necovalente foarte puternice disocierea inhibitorului este foarte lent sau imposibil.

Este dat de sistemele nebiologice. metalele grele (Hg, Cu, Ag), agenii alchilani, agenii oxidani complexe denaturante (CO, H2S, NH3, HCN).

a) Inhibiia ireversibil (otrvirea)


Inhibitorul (I) acioneaz lent, fiind necesar un timp de contact ntre enzim i inhibitor pentru ca inhibiia s fie evideniat. Inhibitorul ireversibil nu este specific pentru o anumit enzim, ci, n general, unui grup de enzime. Un exemplu l constituie cazul pesticidelor organofosforice si carbamice care reacioneaz cu hidroxilul serinic din centrul activ al serinproteazelor (colinesteraza, chimotripsina)

a) Inhibiia ireversibil (otrvirea)


inhibiie specific ireversibil este allopurinolul, care acioneaz ca inhibitor al xantinoxidazei (XAO) i se utilizeaz n tratarea gutei.

b) Inhibiia reversibil
Inhibiia competitiv (de asociere exclusiv) Inhibitorul competitiv diminueaz activitatea enzimatic datorit interaciei n genere, cu aceleai grupri funcionale din centrul catalitic la care se fixeaz i substratul n cursul reaciei enzimatice. Inhibiia competitiv poate fi remediat prin creterea concentraiei substratului. Inhibitorii competitivi reduc numrul de molecule de enzim care pot s fixeze substratul.

b) Inhibiia reversibil
Inhibiia competitiv (de asociere exclusiv) In mediul de reacie apar dou tipuri de complexe binare, ES i EP
E+ S
k1 k-1

ES

k2

E+ P

E +I

k3 k -3

EI

Inhibiia competitiv (de asociere exclusiv)

Ecuaia Michaelis-Menten

V max = ct

(a) neinhibat [I]=0 (b), (c) inhibat [I]1 < [I]2

Inhibiia competitiv

Inhibiia competitiv (de asociere exclusiv)


CH2 - OH CH2 - OH etilenglicol NAD
+

NADH + H

O C H COO
-

Ca

2+

alcool dehidrogenaza

CH2 - OH

COO

oxalat de calciu

Etanolul se administreaz i n cazul otrvirii cu metanol, manifestndu-se inhibiia competitiv Exercitarea efectului bacteriostatic al sulfamidelor are al baz similitudinea structurii acestora cu a acidului paminobenzoic, determinnd biosinteza unui acid folic modificat, care acioneaz ca inhibitor competitiv reversibil

Inhibiia necompetitiv (de asociaie neexclusiv)


Inhibitorii necompetitivi nu au structuri asemntoare substratului i nu concureaz cu acesta pentru aceleai grupe funcionale din centrul activ enzimatic. Inhibitorul necompetitiv se fixeaz la alt situs al enzimei, ceea ce duce la modificarea conformaional a centrului catalitic, afectnd legarea substratului i, n ultim instan, viteza reaciei enzimatice.

Substratul i inhibitorul se pot lega simultan la molecula enzimei, dovedind c locurile de legare nu se suprapun

Inhibiia necompetitiv (de asociaie neexclusiv)

Inhibiia necompetitiv (de asociaie neexclusiv)

KM = ct

viteza reaciei inhibate necompetitiv scade comparativ cu cea n cazul reaciei neinhibate (vmax).

Inhibiia necompetitiv

Inhibiia incompetitiv (anticompetitiv, blocaj al complexului intermediar ES)

Inhibitorul incompetitiv nu se fixeaz pe enzima liber, ci interacioneaz cu complexul E S, modificnd valorile ambilor parametri cinetici KM i vmax

Inhibitor competitiv

Inhibitor necompetitiv

Inhibitorul prezint o structur Inhibitorul nu prezint analogie asemntoare substratului cu substratul Apare o competiie cu substratul Acioneaz asupra enzimei la legarea de centrul catalitic al ntr-o zon diferit de centrul enzimei catalitic sau asupra complexului ES, cu formarea unui sistem inactiv

(KM)Inhibitor competitiv > (KM)n absena


inhibitorului

Nu influeneaz KM
(Vmax)Inhibitor necompetitiv < (Vmax)n
absena inhibitorului

Nu se modific Vmax

Ex. sulfamide (medicamente cu Ex. ionii metalelor grele inhib aciune bacteriostatic) enzimele ce conin grupri tiolice

6. Ali factori
ionii din mediu, detergenii, potenialul redox al mediului, presiunea,

radiaiile UV, X, b

Mecanisme catalitice
Dup modul de aciune al enzimei asupra substratului se cunosc mai multe ipoteze.
Ipoteza tiparului rigid cheie-broasca

Mecanisme catalitice
Ipoteza formrii complexului enzimsubstrat n prezena unei coenzime, necesit prezena unui cofactor (CoE) care faciliteaz constituirea unui complex ES, dup realizarea unor modificri conformaionale n zona centrului activ enzimatic

Mecanisme catalitice
Ipoteza formrii complexului enzim-substrat n prezena unei coenzime,

Mecanisme catalitice
Ipoteza modificrilor conformaionale
enzimatice n timpul formrii complexului enzim-substrat, se materializeaz prin orientri spaiale prin intermediul gruprilor funcionale polarizate

Mecanisme catalitice
Ipoteza modificrilor conformaionale

Dup natura interaciilor care se dezvolt n complexul enzim-substrat, mecanismele catalitice enzimatice pot fi: n cataliz acido-bazic; n cataliz covalent; n cataliz prin intermediul ionilor metalici; n cataliz electrostatic; n cataliz prin efecte de orientare i apropiere; n cataliz prin legarea preferenial a strii de tranziie

Mecanisme catalitice
Numeroase reacii biochimice se produc n cataliz acido-bazic:

Hidroliza proteinelor i a esterilor, tautomeria, adiia la funcia carbonil. Viteza reaciilor n cataliza acido-bazic depinde de tria acidului sau bazei implicate.

Mecanisme catalitice
cataliz acido-bazic

Mecanisme catalitice
n mecanismul prin cataliz covalent, starea de tranziie rezult n urma interaciei de tip legtur covalent, ntre enzim i substrat.

Decarboxilarea acetoacetatului aminelor, cu formarea acetonei

prezena

Mecanisme catalitice
n cataliza prin intermediul ionilor metalici, enzimele necesit pentru activare ioni pozitivi metalici. Din aceast clas de enzime se disting metalo-enzimele i enzimele metal activate.

Metaloenzimele conin ioni ai metalelor tranziionale legai


puternic de enzim (Fe2+; Fe3+; Zn2+; Ca2+; Co3+; Mn2+).

Enzimele metal activate leag slab ionii metalelor alcaline sau


alcalino-teroase (Na+; K+; Ca2+; Mg2+). Ionii metalelor particip la procesele catalitice prin medierea reaciilor de oxidare-reducere

modificndu-i reversibil strile de oxidare sau prin stabilizarea


electrostatic i ecranarea sarcinilor negative.

Enzimele multisubstrat au capacitatea de a cataliza transformarea simultan a unuia sau mai multor substraturi n unul sau mai muli produi de reacie. oxidoreductazele; transferazele, hidrolazele, izomerazele.

n cataliza cu enzime multisubstrat pot exista dou mecanisme distincte: secveniale - cnd produii de reacie sunt eliberai dup ce enzima a acionat asupra tuturor substraturilor (Fig. 10-63a;b); ping-pong - cnd produii de reacie apar n timp, dup aciunea enzimei asupra fiecrui substrat n parte, aprnd produsul corespunztor de reacie (Fig. 10-63c).

Enzimele multifuncionale (proteine plurienzimatice, complexe multienzimatice) se constituie prin asocierea fizic a mai multor enzime sau sunt acele specii proteice capabile s catalizeze dou reacii complet diferite datorit prezenei simultane a mai multor situsuri catalitice distincte.

Enzimele multisubstrat
au capacitatea de a cataliza transformarea simultan a unuia sau mai multor substraturi n unul sau mai muli produi de reacie. cofactorul poate fi considerat un alt substrat al reaciei enzimatice deoarece la sfritul procesului catalitic are o structur chimic modificat. Exemple: oxidoreductazele; transferazele, hidrolazele, izomerazele.

Reglarea activitii enzimatice


este factorul motrice n desfurarea reaciilor biochimice, aceasta putndu-se realiza la nivelul funcionrii i al concentraiei locale a enzimelor. Reglarea concentraiei locale a enzimelor

transcrierea i traducerea informaiei genetice n procesul de biosintez proteic, transportul enzimelor de la locul biosintezei pn la locul de aciune al acestora rapiditatea cu care enzimele sunt degradate de sistemele specializate celulare.

Reglarea activitii enzimatice


Reaciile enzimatice = reacii de echilibru,

Concentraiile speciilor reactante au rol determinant n deplasarea echilibrului n sensul formrii produilor de reacie. Temperatura pH Transformarea pro-enzimelor (zimogenilor) n enzime active prin eliminarea unor zone din macromolecule n urma hidrolizei pariale la nivelul uneia sau mai multor legturi covalente (colagenaza, carboxipeptidazele, fosfolipazele, pepsina, tripsina, chimotripsina).