BIOTECNOLOGIA ENZIMATICA

AMILASAS MICROBIANA : UNA PERSPECTIVA BIOTECNOLOGICA

INTRODUCCIN amilasas son enzimas que hidrolizan molculas de almidn dando como productos dextrinas y progresivamente polmeros pequeos compuestos por unidades de glucosa. En 1811 kirchoff descubre la primera enzima . son de gran importancia en la industria de alimentos , textil papel y en fermentaciones.

Se pueden obtener de : plantas , animales y microorganismos.

1930 Ohsson sugiri la clasificacin de enzimas digestivas de almidn en malta como - y amilasas .

- amilasa (1,4- D- glucan-4 glucanohidrolasa) Estn divididas en 2 categoras : endoamilasas y exoamilasas.

2. DISTRIBUCIN DE LA ALFA AMILASA EN LOS M.O

Se puede ser producida por diversos m.o , plantas y animales. La ventaja de usar m.o para producir la enzima su elaboracin es econmica y los microorganismos son fciles de manipular para obtener enzimas con sus caractersticas deseadas. Las enzimas de mayor importancia en la industrial son las de hongos y bacterias.

Enzima

Fuente

Aplicacin industrial

Industria

Amilasa

Hongos Bacterias Hongos Bacterias Hongos Bacterias Bacterias

Pan Revestimientos amilceos Fabricacin de jarabe y glucosa Almidonado en fro de la ropa Ayuda digestiva Eliminacin de revestimientos Eliminacin de manchas; detergentes

Panadera Papelera Alimentaria Almidn Farmacutica Textil Lavandera

3. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE ALFA

AMILASA
Son generalmente evaluados usando almidn soluble o almidn modificado como substrato. Cataliza la hidrlisis de -1,4 glicosidico enlazado por almidn para producir glucosa, dextrina y dextrina limites. Estos mtodos estn basados en la disminucin de intensidad del color yodo-almidn ,incremento de azucares reductores , degradacin de color complejo substrato y disminucin de la viscosidad del almidn en suspensin.

3.1 DISMINUCIN DE INTENSIDAD DE COLOR YODO-SUSTRATO

El almidn forma un profundo complejo azul con yodo y con la hidrlisis progresiva del almidn, este cambia a rojo. Este mtodo determina la actividad de dextrinizacion de -amilasa en cuanto a disminucin de la reaccin color yodo.

3.1.1 DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE

DEXTRINIZACIN La actividad de dextrinizacion de la alfa amilasa emplea almidn como substrato y una vez que termine la reaccin con HCL ,se le aade una solucin yodo. La disminucin en absorbancia a 620 nm es entonces medida contra un substrato control. Un porcentaje de disminucin en absorbancia es considerada como una unidad de enzimas.

3.1.2 MTODO DE SKB

Es uno de los mtodos ampliamente utilizados para la determinacin de alfa amilasa usada en la industria de pan.

3.1.3 MTODO DE

PI

Es usado para calcular la actividad de la alfa amilasa en cuanto a los gramos de almidn digeridos para obtener una enzima. Este procedimiento implica la incubacin de la preparacin de la enzima . Las soluciones son entonces tratadas con solucin yodo. El tubo que no presente cualquier color azul, es entonces usado para calcular la actividad de la alfa .amilasa. Es usualmente empleado para la estimacin de la actividad de la - amilasa en cereales.

3.2 MTODO DE DNSA

Determina el aumento en azucares reductores como resultado de la accin de la amilasa en el almidn. El principal defecto de este ensayo es un perdida lenta del color producido y destruccin de la glucosa por demandantes del reactivo DNSA. 0.05% de sulfato de sodio fue aadido para prevenir la oxidacin del reactiv.

3.4 DISMINUCIN EN VISCOSIDAD DE EL

ALMIDN SUSPENDIDO

Estos mtodos son generalmente usados en la industria de pan para evaluar la calidad de la harina y no para estimacin de la actividad de la amilasa , la cual esta basada en la determinacin de las propiedades reologicas de las masa. Los que entran en esta categora son: mtodo FN, test amilografo o farinografo.

3.4.1 MTODO DE FN (NUMERO DE CADAS)

Estandarizado internacionalmente , es aceptado para evaluar la actividad diastasica de la amilasa de los cereales sobre la preparacin de la enzima de harina a 100C. Ambas amilasas de hongo y cereal son usadas para mejorar la fermentacin de harina deficiente en actividad de amilasa.

3.4.2 TEST DE AMILOGRAFO/ FARINOGRAFO

La industria de molienda y panificacin generalmente utiliza este mtodo para evaluar la actividad diastasica de harinas por medio de un amilografo .

4. FISIOLOGA DE LA PRODUCCIN DE ALFA

AMILASA

La produccin de la enzima por fermentacin sumergida (SmF) y fermentacin en estado solido(SSF) ha sido investigada y es afectada por varios factores fisicoqumicos. Entre los mas notables se encuentran la composicin del medio, el pH del medio, la concentracin de fosfato, la edad del inoculo , temperatura , aireacin, fuentes de carbono y nitrgeno.

4.1 PARMETROS FISICOQUMICOS

El papel de varios parmetros fisicoqumicos incluyen fuentes de carbono y nitrgeno, fosfatos, metales inicos, temperatura, pH y agitacin han sido estudiadas.

4.1.1 FUENTES DE SUSTRATO: INDUCCIN DE ALFA AMILASAS

El sistema de regulacin donde se produce la alfa amilasa es inducible. En oryzae reportan que la actividad enzimtica aumenta cuando se utiliza maltosa

4.1.3 EL ROL DE FOSFATO

Juega un papel importante regulatorio en la produccin de metabolitos primarios y secundarios. En contraste altas concentraciones de fosfato fueron inhibitorias para la produccin de enzima por B.amyloliquefaciens.

4.1.4 ROL DE OTROS IONES

K, NA , Fe no tienen efecto inhibitorio como el Mg en la produccin de a.lfa amilasa por A.oryzae

el mg juega un papel importante y la produccin fue reducida a un 50% cuando mg se omite del medio. Na y Mg muestran una coordinada estimulacin de la produccin de enzima por bacillus sp.

4.1.5 PH
El pH de el medio de crecimiento juega un papel importante mediante la induccin de cambios morfolgicos de los m.o y en la secrecin de enzimas. El cambio de pH durante el crecimiento del m.o afecta la estabilidad del producto en el medio. Muchas de las cepas de bacillus usadas comercialmente para la produccin de amilasa bacterial por SmF tienen un pH optimo de 6-7 para crecimiento y produccin de enzimas. Sirve como un indicador de el inicio y final de la sntesis de la enzima.

4.1.6 TEMPERATURA
Optimos rendimientos de amilasa fueron alcanzados a 30-37 C para a.oryzae . Para los hongos termofilicos thermomonospora fusca se ha reportado a una temp de 55 Y 50 c para T-lanuginosus. En los hongos se han hecho estudios con hongos mesofilos dentro del rango de temperatura 25-37.

4.1.7 AGITACIN Normalmente se emplea 300 rpm para la produccin de amilasas de diferentes m.o.