Sunteți pe pagina 1din 18

TEHNICA EXECUTRII FROTIULUI

Termenul de frotiu este utilizat pentru desemnarea lamei cu material microbian etalat pe suprafaa ei. Frotiul este un preparat expeditiv, efectuat din diferite organe sau lichide patologice, precum i din culturi bacteriene, care permite punerea in eviden a formaiunilor celulare i cercetarea nsuirilor lor morfologice si tinctoriale.
Frotiurile sunt preparate uscate, fixate i colorate.

n vederea examinrii,

bacteriile sunt depuse pe o lam.


Pregtirea lamei se face controlnd

ca lama sa fie perfect curat, apoi se face degresarea acesteia prin pstrare n alcool sau treceri consecutive prin flacra becului de gaz de cca. 60 de ori, n aa fel nct ambele fee s fie flambate la fiecare trecere pe toat suprafaa lor.

Tehnica efectuarii frotiurilor difer n funcie de materialul din care se face i de natura germenilor in cauz. Tehnica executrii frotiurilor presupune respectarea urmtoarelor etape: Etalarea Uscarea Fixarea Colorarea

Etalarea- reprezint operaia de depunere i

ntindere a unei cantiti reduse dintr-o prob pe suprafaa lamei de sticl, n strat subire i uniform. Etalarea se execut diferit n funcie de natura i consistena materialului. Indiferent de metoda prin care se execut etalarea, lamele trebuie s fie curate, uscate, degresate, iar nainte de utilizare se flambeaz.

Pentru frotiurile din organe, etalarea se poate realiza


prin: tergere, amprent, strivire, cu pipeta Pasteur sau ansa de nsmnare.
Etalarea prin tergere: const n trecerea unei lame de

microscop, pe suprafaa unei seciuni, din organul din care se execut frotiul.

Etalarea prin amprent- const n aplicarea unei lame

(fr tergere) pe suprafaa de seciune a unui fragment de organ de examinat, in acest fel ramnnd o impresiune corespunzatoare formei suprafetei atinse (metoda amprenta). Este bine ca pe aceeasi lam sa se practice mai multe amprente, pentru a se putea examina frotiurile mai subtiri ( ultimile amprente sunt intotdeauna mai fine).
Etalarea prin strivire ntre dou lame - se execut atunci

cnd leziunile din esut sunt de tip nodular (TBC bacilul tuberculozei). Se secioneaz un fragment din nodul, ct un bob de orez i se strivete ntre dou lame de sticl.

Pentru frotiurile din culturi bacteriene, se

procedeaz astfel: n cazul culturilor din medii lichide, etalarea presupune folosirea ansei de nsmnare sau a pipetei Pasteur. Dup omogenizarea culturii se recolteaz n mod steril, o pictur care se depune pe o lam de sticl i se ntinde prin micri concentrice, astfel nct frotiul s fie subire i uniform, i sa aib o intindere mai redus dect marginile lamei de microscop; n cazul culturilor de pe medii solide, pe lama de sticl se depune o pictur de ap distilat sau ap de robinet, apoi cu ansa se recolteaz o mic cantitate de cultur, care se suspensioneaz n pictura de ap i se ntinde prin micri concentrice pe o suprafa ct mai mare. Indiferent de metoda de etalare, niciodat nu se va atinge cu materialul infecios marginea lamei.

Uscarea - se execut pentru a permite aderarea materialului etalat


pe lama de microscop i se realizeaz prin meninerea preparatului la temperatura laboratorului.

Fixarea - se realizeaz n scopul distrugerii viabilitii

microorganismelor din materialul etalat i pentru o mai puternic adeziune a acestuia la suprafaa lamei. Se poate realiza: prin cldur (Fixarea termica): frotiul uscat se trece de 3-4 ori prin flacra unui bec de gaz sau a unei lampi cu alcool, cu faa opus celei pe care se afl preparatul, iar viteza de trecere este moderata (cu viteza cu care se taie pinea cu un cuit); Fixarea termica se poate face si prin flambare, punnd pe frotiu citeva picaturi de alcool etilic, metilic sau alcool-acetona (din bateria de colorare Gram) si se aprinde imediat dupa scurgerea excesului de alcool. prin alcool (Fixarea chimica): frotiul se acoper cu alcool etilic sau metilic i se las s se evapore. Unii colorani au capacitatea, de a fixa frotiurile, realiznd concomitent fixarea i colorarea materialului (soluia Giemsa).

Colorarea - este o operaie complex, care se execut

diferit n funcie de afinitatea tinctorial a bacteriei sau de particularitile morfologice pe care dorim s le evideniem. Colorarea este un proces fizico-chimic, care se realizeaz prin schimb ionic ntre substana colorant i componentele celulare. Clasificarea metodelor de colorare: 1. Dup felul colorrii: - directe - indirecte - vitale i postvitale; 2. Dup metoda de colorare: - difuze - selective 3. Dup timpul aferent colorrii: - progresive - regresive 4. Dup numrul de colorani folosii: - simple - complexe 5. Dup frecvena i scopul utilizrii: - uzuale - speciale

Prin colorare se pot stabili unele particularii morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, afinitati tinctoriale) ca si relaiile cu esuturile n care se afla, facilitindu-se in acest fel precizarea diagnosticului. Coloraiile simple - folosesc un singur agent colorant (ex. coloraia cu albastru de metilen). Coloraiiie complexe - folosesc mai muli colorani simultan sau succesiv, fiecare acionnd selectiv asupra componentului celular pentru care au afinitate (ex. coloraia Gram, coloraia Ziehl-Neelsen). Prin aceast metod se pun n eviden att caracterele morfologice, ct i afinitatea tinctorial a diferitelor specii de microorganisme. Coloraiile uzuale se utilizeaz frecvent (ex. coloraia Gram), pe cnd cele speciale se folosesc pentru a evidenia anumite particulariti morfologice ale bacteriilor (spori verde de malachit, capsul- Giemsa, cili - Casares Gill) sau pentru studiul unor bacterii particulare (Fontana Tribondeau - leptospire, Stamp - rickettsii).

Coloraia cu ALBASTRU DE METILEN (Lffler) - se

foloseste pentru punerea in evidenta a germenilor intr-un material patologic, fara a-i diferentia sub raportul afinitatii lor tinctoriale. Tehnica colorrii:
Frotiul fixat se acoper cu soluia de albastru de metilen 3% i,

dupa 25 minute, se spala cu apa. Se usuc i se examineaz la microscop cu obiectivul de imersie. Rezultatul colorrii - germenii apar colorai n albastru nchis, uniform.
Metoda permite si observarea unor particularitati

morfologice cum ar fi prezenta capsulei si sporului. Capsula se coloreaza in roz-pal, iar sporul apare sub forma unei vacuole.

Coloraia Gram - difereniaz bacteriile Gram pozitive

(colorate n albastru-violet) de cele negative (colorate n rou) din frotiurile efectuate din diferite tesuturi sau din culturi microbiene. Este o metoda de baza in practica bacteriologica.
Soluii necesare:
Soluia de violet de geniana- colorant I Soluia Lugol- mordant (fixator) Soluia de alcool-aceton- decolorant Soluia de fuxin diluat 1/10- colorant II

Tehnica colorrii:

Frotiul uscat i fixat se acoper cu soluie de violet de geniana 1%, se las 1 minut, dup care se ndeprteaz (se vars colorantul de pe lama). n cazul frotiurilor groase sau a celor din organe, dup ndeprtarea violetului de geniana frotiul se spal cu ap. Frotiul se acoper cu soluie Lugol, timp de 1 - 2 minute, dup care se ndeprteaz, (soluia Lugol are rol de mordant). Decolorarea cu soluie alcool-aceton (timpul aplicrii difer n funcie de grosimea frotiuluitimpul este de ordinul secundelor), pn cnd amestecul ce se scurge de pe lama nu mai este colorat. Splare cu ap de robinet. Frotiul se recoloreaz cu soluia de fuxin diluat 1/10, timp de 1 minut, dup care se ndeprteaz. Se spal bine cu ap de robinet. Se usuc i se examineaz la microscop cu obiectivul de imersie.

Interpretarea rezultatelor: Unele bacterii se coloreaz n violet sau albastru-violet i se numesc Gram pozitive, iar altele se coloreaz n rou i se numesc Gram negative. Capacitatea de a reine sau nu violetul de geniana, dup decolorarea cu alcool aceton se datoreaz compoziiei chimice diferite a peretelui celular. Aceasta diferenta de colorare rezulta din faptul ca germenii Gram pozitivi fixeaza violetul de Gentiana in asa fel incit prin tratarea cu solutia de alcool-acetona nu se decoloreaza, in timp ce cei Gram negativi se decoloreaza si apar ca urmare colorari in rosu cu cel de al doi-lea colorant (fucsina diluata). Sporii bacterieni apar sub forma de vacuole. Exist i unele bacterii, care se decoloreaz uor sub aciunea alcool acetonei i se numesc Gram labile.

Se urmrete - afinitatea tinctorial a bacteriilor

Interpretare - bacteriile Gram-pozitive: violet

bacteriile Gram-negative: rou

Frotiu efectuat din produs patologic sau din cultura bacterian

Etapa

Colorant

Timp colorare

Bacterii Gram+

Bacterii Gram-

Etapa 1

colorare cu violet de genian

1-2 minute

toate bacteriile i elementele de pe frotiu se coloreaz n violet


Etapa 2 mordantare cu lugol 1-2 minute

lugolul fixeaz colorantul (violet de genian) n peretele bacteriilor Gram+

Etapa 3

splare cu ap de robinet

Etapa 4

decolorare cu alcool 96

1 minut

alcoolul este capabil s extrag colorantul din toate structurile de pe frotiu, cu excepia bacteriilor Gram+ Etapa 5 splare cu ap de robinet

Etapa 6

recolorare cu fuxin

1-2 minute

fuxina recoloreaz structurile decolorate anterior Etapa 7 splare cu ap de robinet

Etapa 8

uscare

Coloraia ZiehlNeelsen - se foloseste pentru punerea in

evidenta a germenilor acidorezistenti, care nu se coloreaza prin metodele obisnuite (mai ales micobacteriile): Coloratia Koster - se foloseste pentru colorarea brucelelor Metoda Koslovski - se foloseste pentru colorarea brucelelor; Metoda TribondeauFontana - se foloseste pentru colorarea leptospirelor ; Pentru colorarea capsulei bacteriene coloraia Giemsa, metoda de colorare negativa a capsulei cu tus de China, etc.; Pentru colorarea sporilor: Metoda Moller, Metoda Pooman, Metoda cu verde de malahit Pentru colorarea cililor - Metoda CasaresGill