ANALIZE FIZICO - CHIMICE ELECTROFOREZA

Electroforeza = metoda ce se bazeaza pe migrarea componentilor dintr-o proba, supusa unei diferente de potential, intr-o solutie sau printr-un suport solid poros (hartie cromatografica, gel), separarea explicandu-se prin vitezele de migrare diferite ale componentilor incarcati electric pozitiv sau negativ, care sunt atrasi de polii opusi ai campului electric, proportional cu natura, marimea si sarcina lor.

Mobilitatea electroforetica
= viteza cu care se deplaseaza particulele purtatoare de sarcini electrice, in camp electric in conditiile experimentale date
d 0 tE

In care: d = distanta de migrare parcursa in timpul t (m); E = gradientul de potential (V/m); 0 = mobilitatea electroforetica (m2/V/s).
3

Mobilitatea electroforetica vatriaza functie de : Factori ce depind de particula: marimea natura forma sarcina gradul de hidratare si disociere coeficientul de frecare

Mobilitatea electroforetica vatriaza functie de : Factori ce depind de solutia de electrolit: natura concentratia forta ionica pH-ul vascozitatea temperatura

Tipuri de electroforeza
Electroforeza de frontiera Utilizata in principal sau pe suport Electroforeza zonala pentru unele studii fundamentale privitoare la natura si puritatea proteinelor Principui: migrarea proteinelor intr-o solutie tampon de electroliti, intr-un aparat cu o celula in forma de U din stical transparenta astfel incat sa se poata observa migrarea proteinelor cu un spectrometru/ spetrofotometru

Solutie de electrolit A
Solutie de proteine A+B+C C A+B B+C

A+B+C

Electroforeza zonala
Migrarea analitilor este stabilizata de faptul ca lichidul in care se produce, se gaseste intr-un suport sau mediu poros (acetat de celuloza sub forma de folii, hartie de filtru speciala, gel)
Avantaj: pe aceste suporturi se pot identifica mai usor zonele de migrare sau zonele de concentartie

Electroforeza orizontala pe suport

Elecrtozi Banda suport
-

Bacuri cu electroliti

Placi de sticla pentru fixarea benzii

Factori care influenteaza electroforeza

Natura moleculelor separate Marimea moleculelor Mobilitatea Natura Sarcina Aparatura suportul

10

Factori care influenteaza electroforeza

Curentul electric Deplasarea electroforetica este proportionala cu Mobilitatea Campul electric Timpul de trecere a campului electric

d U0 E t
d = distanta parcursa de particula U0 = mobilitatea particulei (V/cm) E = tensiunea (V) t = timpul de trecere al curentului

11

Factori care influenteaza electroforeza pH - ul In cazul acizilor si bazelor tari (electroliti tari) pH-ul nu influenteaza migrarea Natura solutiei natura sarurilor natura acizilor natura bazelor influenteaza natura altor substante mobilitatea existente in solutie
12

Electroforeza pe gel

13

Electroforeza capilara
Cea mai noua si mai utilizata tehnica electroforetica utilizata pentru separarea speciilor incarcate cu sarcini electrice Pentru efectuarea separarilor se efectueaza un montaj automatizat ale carui elemente principale sunt:

tub capilar sistem de introducere a probei sistem de detectie electrozi de platina sursa de alimentare cu curent

14

Electroforeza capilara

15

Avantajele electroforezei capilare: timpi de analiza relativ scurti; volume mici de proba; cantitati mici de solventi (tampon); posibilitatea automatizarii intregului ciclu de analiza; poate opera atat in medii apoase cat si in medii neapoase; detectia se face in capilar (UV); sensibilitate inalta.
16

Fluxul electroosmotic
La pH > 3 peretele capilarului se incarca negativ acumularea de sarcini pozitive la suprafata fluxului de lichid de electroliti, in contact cu peretele capilarei = fluxul electroosmotic fluxul electroosmotic se deplaseaza in directia catodica

17

Peretetle capilarului

Stratul Stratul rigid de difuzie

18

Fluxul electroosmotic este influentat de: Compozitia solutiei de electroliti pH forta ionica vascozitatea forta dielectrica Temperatura Introducerea unor aditivi

19

 Analitii purtatori de sarcini sau ionizati sufera doua deplasari care se insumeaza sau se exercita in sens contrar: o deplasare datorita mobilitatii lor electroforetice o deplasare datorita mobilitatii fluxului electroosotic OBS: analitii neincarcati cu sarcina se deplaseaza doar sub actiunea fluxului electroosmotic
20

Miscarea unui analit incarcat pozitiv

+
+

Uep= mobilitatea electroforetica UR = mobilitatea rezultanta Ueo = mobilitatea electroosmotica

Miscarea unui analit neutru + -

Miscarea unui analit incarcat negativ

+
-

21

Separarea unui amestec de cationi, anioni si compusi neutrii

+

+
cationi anioni
Raspunsul detectorului neutrii

22

Timpul de migrare

Capilarul
Este din silice si este acoperit la exterior cu un strat de poliimida pentru a-i oferi rezistenta si flexibilitate Stratul de poliimida este intrerupt in dreptul detectorului Lungimea sa poate varia intre 10 si 100 cm Diametrul interior intre 25 si 100 m Pentru realizarea de separari reproductibile capilarul este fixat intr-o incinta termostatata
23

Mediul de migrare
Este o solutie apoasa de electroliti-tampon sau un gel impregnat cu o astfel de solutie Pentru optimizarea separarii sau a detectiei se poate varia pH-ul sau forta ionica, sau se pot adauga diversi compusi solutiei de electroliti: solventi organici agenti tensioactivi anionici / cationici ciclodextrine agenti chelanti / sechestranti compusi ionici continand cromofori si fluorofori sau grupari electroactive care sa faca posibila detectia
24

Sistemul de introducere a probei

Cantitatile de proba injectate sunt de ordinul a cativa nL Introducerea probei se poate face: Manual Hidrodinamic Electromigrare

25

Sursa de alimentare cu curent

Curentul este furnizat de un generator de curent continuu si poate atinge 30 kV Utilizarea unor tensiuni inalte este posibila datorita: diminuarii efectului Joule din cauza rezistentei mari a capilarei din silice dispersarea buna, eficienta a caldurii intre suprafata mare a peretilor capilarei si volumul mic de solutie de electrolit care umple capilara
26

Sistemul de detectie
Se utilizeaza detectori: spectofotometrici Cele mai utilizate spectrofluorimetrici electrochimici de conductivitate SM Mai putin utilizate

27

APLICATII

28

Separarea unui amestec de cationi

29

Separaea unui amestec de vopsele

30

Separarea unui amestec de compusi aromatici

31

Separarea unui amestec de medicamente anti-SIDA

32