Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor

1. Metode de difracie
Aplicarea metodelor optice n studiul structurilor biologice reprezint unul
dintre cele mai fericite i perene exemple de cooperare din istoria tiinei, n
care progresele dintr-un domeniu fundamental fizica sunt transferate
constructiv i ajung s ordoneze haosul i dilemele n care s-au zbtut mii
de ani cei ce au ndrznit s ptrund n domeniul de o infinit complexitate i
varietate al tiinelor vieii. ndelungatele cercetri ale cror rezultate s-au
acumulat pe durata a trei secole ne-au oferit extraordinarul privilegiu de a fi
contemporanii unei revoluii n biologie i medicin, n care structura detaliat
a compuilor macromoleculari din fiinele vii (peptide de semnalizare, acizi
nucleici, factori reglatori, enzime, receptori, transportori i biosenzori) este
rnd pe rnd descifrat la nivel de rezoluie atomic, ceea ce permite n
continuare elaborarea de modele dinamice i experimente sofisticate, ducnd
la explicarea, la un nivel de detaliu inimaginabil cu doar cteva decenii n
urm, a mecanismelor celor mai intime i subtile ce asigur functionarea
acestor conglomerate moleculare. Celebrul fizician Richard P. Feynman, unul
dintre fundatorii electrodinamicii cuantice i autorul unor remarcabile manuale
de fizic, insera ntr-una din crile sale, Lectures on Physics, publicat n
1967, o aseriune vizionar:
Certainly no subject or field is making more progress on so many fronts at
the present moment than biology, and if we were to name the most powerful
assumption of all, which leads one on and on in an attempt to understand life,
it is that all things are made of atoms [italics in original], and that everything
that living things do can be understood in terms of the jigglings and wigglings
of atoms. [italics added] (citat de Karplus & McCammon, 2002).
Istoria teoriilor fizice din domeniul opticii consemneaz dou abordri
alternative: corpuscular i ondulatorie. Meritul formulrii primei teorii i revine
lui Sir Isaac Newton, care ncearc s extind principiile fundamentale ale
mecanicii i teoria interaciunilor, expuse pe larg n Principiile matematice ale
filosofiei naturale, n descrierea propagrii razelor de lumin i interaciunii cu
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
materia. n domeniul opticii experimentale, de care s-a ocupat n ultimele
decenii ale vieii, Newton este recunoscut pentru demonstrarea
descompunerii unei raze de lumin alb n culorile spectrului vizibil la trecerea
printr-o prism. Fenomenul este interpretat ca fiind datorat existenei unor
particule de mici dimensiuni i extrem de rapide, ale cror viteze diferite de
propagare prin prism duc la alegerea unor traiectorii diferite, conform
principiului drumului optic minim, ce explic traiectoria rectilinie a razelor de
lumin n medii omogene i izotrope i st la baza opticii geometrice.
Procesele ce au loc la parcurgerea interfeei ntre dou medii transparente de
densiti diferite sunt aprofundate de Snellius i sintetizate n binecunoscuta
lege a refraciei, care permite i stabilirea condiiilor n care are loc reflexia
total. Pentru a demonstra teoria descompunerii n culori a luminii albe,
Newton imagineaz un alt dispozitiv experimental: un disc pe a crui
suprafa sunt imprimate sectoare circulare n diferitele culori ale spectrului.
Dac n repaus culorile individuale sunt distincte, la o anumit turaie discul
pare alb (acest experiment are i o component de neurofiziologie,
evideniind latena percepiei la nivelul analizatorului vizual). Un alt experiment
optic este cel care poart numele de inelele lui Newton franjele de
interferen ce apar n anumite condiii de iluminare n zona de contact ntre
un menisc convex i o suprafa plan. Acesta marcheaz i eecul teoriei
corpusculare, fiind mult mai uor i logic de explicat printr-o teorie ondulatorie.
Christian Huygens este cel ce fundamenteaz matematic teoria ondulatorie,
descriind razele de lumin ca oscilaii ale mediului optic ce se propag cu o
anumit vitez n toate direciile. El definete conceptul de front de und ca
suprafa pe care toate punctele oscileaz n faz la un moment dat. Aceste
oscilaii pot fi privite ca surse secundare, din care propagarea se face tot
omogen i izotrop: astfel amplitudinea i faza oscilaiei ntr-un punct rezult
din compunerea tuturor oscilaiilor emise de sursele secundare de pe
suprafaa unui front de und la un moment anterior. Aceste principii sunt
necesare i suficiente pentru a explica n detaliu fenomenul de difracie: la
interpunerea unor obstacole n calea de propagare a unei unde, frontul de
und este segmentat ntr-un numr de surse secundare, ale cror oscilaii,
prin recompunere, duc la variaii de amplitudine pe o suprafa situat distal
fa de obstacole. Aceste variaii sunt rezultatul interferenei constructive sau
2
Metode de difracie
destructive a undelor generate de aceste array-uri de oscilatori secundari, n
funcie de diferena de drum optic. Prima confirmare experimental a
conceptelor opticii ondulatorii este realizat de Thomas Young, folosind surse
de lumin necoerente i un dispozitiv de interferen simplu reprezentat de
dou fante punctiforme (pinhole guri de ac) ntr-un paravan opac amplasat
la o anumit distan fa de un ecran de proiecie. Ulterior, n Frana, Fresnel
construiete reele de difracie prin gravarea, cu dispozitive speciale, a unor
anuri paralele foarte apropiate pe suprafee transparente, i dispozitive de
interferen prin secionarea sagital a unor lentile convergente i
ndeprtarea celor dou jumti. Fenomenul de polarizare a luminii, i
activitatea optic a unor compui organici, precum acidul tartric, evideniat
de Louis Pasteur, sugereaz c oscilaiile undelor luminoase trebuie s aib
loc ntr-un plan perpendicular pe axa de deplasare, ceea ce le difereniaz de
undele sonore i presupune existena unui mediu rigid de propagare, faimosul
eter universal cutat de Michelson i Moreley. Independent, printr-o
3
Figura 1. Teoria ondulatorie a propagrii luminii, formulat de Christian
Huygens. A. Fiecare punct de pe suprafaa unui front de und devine o surs
secundar. B. Frontul de und la un moment ulterior poate fi obinut din
nfurtoarea fronturilor de und ale surselor secundare.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
abordare matematic riguroas a rezultatelor din electricitate i magnetism,
James Clerk Maxwell deduce existena undelor electromagnetice, prezise de
simetria celor patru ecuaii ale cmpului electromagnetic n vid. Astfel, undele
radio (descoperite ulterior), infraroii, vizibile, ultraviolete, razele X i
reprezint toate unde electromagnetice care difer doar prin frecvena sau
lungimea de und a oscilaiilor. Aspectul corpuscular al radiaiei
electromagnetice este i el pus n eviden ntr-o serie de experimente, cel
mai cunoscut fiind efectul fotoelectric. Interpretarea acestuia duce la definirea
fotonului de ctre Max Planck i Albert Einstein ca particul elementar a
interaciunii electromagnetice, cu un caracter dual de corpuscul-und.
Surprinztor, n 1920 Victor de Broglie demonstreaz c orbitele electronilor
n jurul nucleelor atomice i nivelurile energetice discrete deduse din
interpretarea datelor spectroscopice pot fi explicate ca unde staionare.
Aceast nou teorie este matematizat de Erwin Schrdinger i Werner
Heisenberg, avnd ca rezultat apariia mecanicii cuantice.

Dup descoperirea razelor X de ctre Wilhelm Roentgen n 1895, primele
studii de difracie ale unor fascicule de raze X necoerente pe pulberi
policristaline depuse pe o platform n rotaie sunt ntreprinse de W.L. Bragg.
4
Figura 2. Condiia de difracie stabilit de Bragg pentru difracia pe o reea
cristalin. Interferena constructiv se obine atunci cnd diferena de drum
optic (PD) ntre undele difractate pe dou planuri adiacente reprezint un
multiplu ntreg al lungimii de und.
Metode de difracie
nregistrarea pe pelicula fotografic a unor maxime de amplitudine este
interpretat ca interferen constructiv. n 1912 Bragg stabilete condiia de
maxim la difracia unui fascicul de raze X cu lungimea de und pe o latice
de atomi ai unei reele cristaline situai n planuri paralele separate de distana
d: diferena de drum optic ntre razele difractate pe dou planuri nvecinate
trebuie s fie un multiplu al lungimii de und. Considernd unghiul de
inciden egal cu unghiul de difracie fa de plan, , condiia devine:
Astfel, prin msurarea unghiului Bragg se pot determina dimensiunile celulei
de cristalizare, n cazul prezenei unui singur atom pe axa normal la planul
de difracie.
n 1913, Max von Laue generalizeaz condiia descris de Bragg, pornind de
la observaia, corect, c difracia nu este un proces de reflexie, deci unghiul
de inciden nu este obligatoriu egal cu unghiul de difracie. Considernd
radiaia incident perpendicular pe un ir de oscilatori, unghiul de emergen
al radiaiei difractate fa de planul oscilatorilor, , trebuie s ndeplineasc
urmtoarea condiie pentru interferena constructiv:
Astfel, pentru o radiaie incident perpendicular pe un ir de oscilatori,
maximele de difracie vor fi plasate pe suprafeele unor conuri, a cror
intersecie cu planul filmului fotografic determin forma imaginilor de difracie.
Pentru cazul general al unei reele cristaline cu celule ortorombice, ale cror
dimensiuni pe cele trei axe cristalografice principale, a, b, i c, sunt a, b, i c,
aceste condiii devin:
unde
0
,
0
i
0
sunt unghiurile de inciden fa de aceste axe cristalografice.
Folosind notaia simplificatoare cos = i urmtoarele relaii valabile pentru
o reea ortorombic:
5
d
n
sin 2
cos c l
( )
( )
( )
0
0
0
cos cos
cos cos
cos cos






b k
a h
c l
1
1
2
0
2
0
2
0
2 2 2
+ +
+ +


Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
obinem, prin ridicarea la ptrat a condiiilor von Laue:
Notnd unghiul dintre direcia razei incidente i a celei difractate 2, i
folosind relaia:
deducem, prin sumare:
2
0 0
2
2
2 2
2
0 0
2
2
2 2
2
0 0
2
2
2 2
2
2
2

+
+
+
c
l
b
k
a
h
6
Figura 3. Interpretarea lui von Laue a condiiilor de difracie. Unda incident este
considerat perpendicular pe irul de oscilatori atomici, ceea ce face ca unda
difractat s devieze cu un unghi dublu fa de cel definit de Bragg prin analogie cu
reflexia.
0 0
0
2 cos + +
Metode de difracie
de unde rezult ecuaia von Laue:
n aceast ecuaie numerele ntregi h, k, i l, care poart numele de indici
Miller, definesc diferenele n numere de lungimi de und care duc la apariia
reflexiilor pe un cristal tridimensional. Astfel, pentru un set dat de indici Miller,
7

2
0 0
0
2
2
2
2
2
2
2
sin 4 ) 2 cos 1 ( 2 1 ) ( 2 1 + + +

,
_

+ +
c
l
b
k
a
h
sin 2
2 / 1
2
2
2
2
2
2

,
_

+ +
c
l
b
k
a
h
d
n
c
l
b
k
a
h

,
_

+ +

sin 2
2 / 1
2
2
2
2
2
2
Figura 4. Conurile de reflexie rezultate din interaciunea unei unde incidente
perpendiculare pe un ir de oscilatori, i nregistrarea pe o suprafa plan a
maximelor de difracie corespunztoare.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
condiia Bragg i ecuaia von Laue devin echivalente:
Dac am nregistra conurile de difracie ale unui monocristal folosind o plac
fotografic plan, imaginea de difracie ar rezulta din compunerea
interseciilor conurilor de difracie cu acest plan, respectiv din serii de arcuri
numite linii de strat, numerotate dup valoarea indicilor Miller. Fiecare set
de
conuri genereaz propriul set de linii de strat, ns reflexiile sunt localizate la
punctele de intersecie ale acestor seturi de conuri, proiecia lor pe o
8
Figura 5. Compunerea maximelor de reflexie pentru cazul unui cristal
tridimensional, proiectate pe o suprafa plan (a), cilindric (b), sau sferic (c).
Reflexiile rezult din intersecia conurilor de reflexie ale axelor cristalografice. n
cazul suprafeei sferice sunt corectate distorsiunile de liniaritate.
Metode de difracie
suprafa sferic reprezentnd sfera reflexiilor. Ea poate fi nregistrat cu
ajutorul metodei numite fotografie de precesie, n care att cristalul ct i
placa fotografic sunt rotite astfel nct s rezulte o imagine nedistorsionat a
reflexiilor. Observm c, datorit principiilor de simetrie, dac difracia la
unghiul 2 fa de direcia fasciculului incident produce o reflexie, difracia la
un unghi -2 va produce la rndul ei o reflexie, ntruct sin 2 = sin (-2).
Acest principiu, formulat de Friedel, explic simetria fotografiei de precesie, i
faptul c din spaierea reflexiilor pe cele trei axe de simetrie ale imaginii
putem deduce dimensiunile unitii de cristalizare pe cele trei axe
cristalografice principale. Astfel, reflexiile cu indici Miller h, k, l, i -h, -k, -l
formeaz o pereche Friedel. Astfel, dac lum n considerare axa principal a
valorilor h pentru care k = l = 0 (numit axa h 0 0), orice reflexie h va avea
poziia i intensitatea identic cu reflexia -h.
9
Figura 6. Fotografia de precesie a unui cristal de lizozim cu simetrie tetragonal
(fotografie nregistrat de-a lungul axei de simetrie). Dou seturi de axe de
simetrie pot fi pot fi utilizate pentru numerotarea reflexiilor.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
Nu este obligatoriu ca toate reflexiile de pe o ax principal de simetrie s
aib aceeai intensitate. Acest fapt poate fi exemplificat prin cazul unui cristal
cu simetrie helicoidal de tip 2
1
pe axa c a unitii cristalografice. n acest caz
putem considera c dimensiunea unitii de cristalizare pe direcia respectiv
este c/2, ceea ce duce la observarea doar a maximelor de ordin par, l (l = 2n),
n timp ce maximele de ordin impar (l = 2n + 1) se anuleaz, ele purtnd
numele de absene sistematice din imaginea de difracie.
Dac unitatea cristalografic ar conine un singur atom, determinarea
geometriei ei ar fi echivalent cu determinarea structurii cristalului, deoarece
n acest caz planurile de reflexie Bragg ar fi formate din atomi individuali.
Pentru structuri moleculare complexe, aa cum sunt biomoleculele, fiecruia
dintre atomii componeni i se atribuie un set de coordonate (x, y, z) n unitatea
cristalografic. Este comod ca aceste coordonate s fie exprimate ca valori
relative n intervalul de la 0 la 1, astfel nct poziia unui atom n sistemul
standard de coordonate poate fi reprezentat sub forma (xa, yb, zc).
Pentru latici cristalografice cu simetrie ortorombic sau de ordin superior,
10
Figura 7. Adugarea unui element suplimentar de simetrie (2
1
) de-a lungul axei c
duce la apariia de absene sistematice.
Metode de difracie
reflexiile au loc pentru anumite valori ale mrimilor h/a, k/b, l/c. Rescriind
aceste valori ca ha
*
, kb
*
, i lc
*
, unde a
*
= 1/a, b
*
= 1/b, i c
*
= 1/c, putem defini
noiunea de spaiu reciproc, n care axele unitii cristalografice sunt a
*
, b
*
, i
c
*
, cu dimensiunile a
*
, b
*
, i c
*
exprimate n 1/nm. Relaiile ntre dimensiunile n
spaiul real i cele din spaiul reciproc pentru latici ortorombice, monoclinice i
triclinice sunt redate n Tabelul 1.1.
Tabelul 1.1. Relaiile ntre parametrii unitii cristalografice n spaiul real i n
spaiul reciproc
Tipul de latice Spaiul
real
Spaiul reciproc
Ortorombic
i cu simetrie
superioar
a
a
*
=
b
b
*
=
c
c
*
=
= 90
*
= 90
= 90
*
= 90
= 90
*
= 90
V
V
*
== a
*
b
*
c
*
Monoclinic a
a
*
=
b
b
*
=
c
c
*
=
= 90
*
= 90
= 90
*
= 180-
= 90
*
= 90
V
V
*
== a
*
b
*
c
*

sin
*
Triclinic
a
a
*
=
a
1
b
1
c
1
V
1
sin
1
a
b
1
sin
1
c
V
1
V
bc sin
11
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
b
b
*
=
c
c
*
=
= 90
cos
*
=
= 90
cos
*
=
= 90
cos
*
=
V
V
*
== a
*
b
*
c
*
V
ac sin
V
ab sin


sin sin
cos cos cos


sin sin
cos cos cos


sin sin
cos cos cos
V
1
* cos * cos * cos 2 * cos * cos * cos 1
2 2 2
+
12
Figura 8. Sfera reflexiilor n spaiul reciproc i determinarea poziiei vectorilor de
reflexie din intersecia nodurilor laticei cristalografice cu suprafaa sferei, pentru o
anumit orientare a undei incidente.
Metode de difracie
n spaiul reciproc, ecuaia von Laue devine:
valabil pentru toate tipurile de simetrie a unui cristal. Putem asocia fiecrei
reflexii un vector S definit ca:
S = ha
*
+ kb
*
+ lc
*
= (ha
*
, kb
*
, lc
*
)
Intersecia vectorilor S cu o sfer de raz 1/n este numit sfera Ewald sau
sfera reflexiilor n spaiul reciproc. Pe msur ce n crete, volumul sferei
crete i cuprinde reflexiile care intersecteaz suprafeele sferelor Ewald
pentru valori inferioare ale lui n.
n difracia de raze X, intensitatea fiecrei reflexii este dat de intensitatea
unui singur vector de reflexie I(S). ntreaga informaie despre structura
moleculei este coninut n I(S), iar descompunerea acestei informaii este
esenial pentru rezolvarea structurii cristalului.
Dac molecula ar conine un singur element de mprtiere n originea unitii
cristalografice (adic, n fiecare punct al laticei), structura ar fi rezolvat.
Totui, o macromolecul conine muli atomi aflai la distane r
j
= |r| = (xa + yb
+ zc) fa de origine.
Amplitudinea unei unde reflectate pe o anumit direcie x poate fi descris
printr-o ecuaie de forma:
Putem include n aceast ecuaie un factor de reflexie f pentru fiecare atom,
cu ajutorul cruia putem defini un factor de structur F ce reprezint
amplitudinea fiecrei unde reflectate la valori specifice ale indicilor Miller:
unde N reprezint numrul atomilor din unitatea cristalografic.
De fapt, reflexia razelor X este direct proporional cu densitatea de electroni
(r) = (x, y, z) a fiecrui element infinitesimal de volum dxdydz = dV, astfel
nct putem rescrie factorul de structur sub forma:
ceea ce n esen este echivalent cu ecuaia precedent, deoarece n poziiile
n care sunt amplasai atomii probabilitatea de a gsi electroni este maxim.
13
( )
hkl
d
n
c klb c hla b hka c l b k a h

+ + + + + sin 2 * cos * * 2 * cos * * 2 * cos * * 2 * * *
2 / 1
2 2 2 2 2 2
) / ( 2
0 0 0
sin cos
j
r x t i
e E x iE x E E
+
+

N
j
i
j
e f F hkl F
1
2
) ( ) (
j
r S
S

dV e V F
i r S
r S

2
) ( ) (
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
Aceast expresie reprezint o serie Fourier, n care factorul de structur, care
este funcie de reflexia n spaiul reciproc, este scris n termenii unor densiti
electronice din spaiul real. O imagine de difracie de orice tip (fie de raze X fie
de electroni) este o reprezentare a spaiului reciproc i nu are nici o
asemnare cu obiectele care reflect radiaia. Prin transformare Fourier
obinem o funcie care descrie densitatea electronic n orice punct particular
din spaiul real n termenii vectorului de reflexie din spaiul reciproc:
n care V* este elementul de volum din spaiul reciproc iar V este volumul
unitii cristalografice. ntruct difracia are loc pe un motiv regulat, i, n
concordan cu condiiile von Laue, n puncte discrete, densitile electronice
pot fi calculate dintr-o sum a factorilor de structur pentru toi indicii Miller,
care reprezint o serie Fourier a reflexiilor discrete:
Deoarece n practic nu putem msura toate reflexiile posibile, trebuie s
trunchiem seria Fourier la valori finite ale (h k l). Dac msurm factorii de
structur pentru un mare numr de vectori de reflexie S, putem calcula uor
densitatea electronic n orice punct al spaiului, rezolvnd astfel structura
cristalului. Exist totui o problem: dei factorii de structur pot fi calculai
pornind de la un set cunoscut de poziii atomice, ei nu pot fi msurai direct
ntr-un experiment de difracie. Ceea ce putem msura este intensitatea
razelor X difractate pentru fiecare reflexie. Astfel, avem informaia de
amplitudine pentru fiecare factor de structur, ns pierdem informaia de
faz:
n care F*(S) reprezint conjugata complex a lui F(S):
Exist multiple modaliti de rezolvare a acestei probleme, numit i problema
fazei. Cea mai utilizat la ora actual este nlocuirea molecular, datorit
uurinei n aplicare i posibilitii de a rezolva structuri mari. Se pornete de
14

) ( *
1
) (
2
S r
r S
F e dV
V
i

h k l
i
e hkl F
NV
r S
r

2
) (
1
) (
2 2
2 2
) ( * ) ( ) ( ) ( ) (
im re
F F F F F hkl F I + S S S S

N
j
im re
i
j
iF F e f F
1
2
) ( *
j
r S
S

Metode de difracie
la o structur cunoscut, care are o poriune comun cu structura de
determinat. Aceasta furnizeaz factorii atomici de reflexie ct i informaia de
faz (din coordonatele acestor atomi). Astfel se pot exclude atomii din
regiunea nepartajat i calcula harta ei de densitate electronic, numit hart
de densitate electronic de diferen sau hart a omisiunii., deoarece atomii
care nu sunt similari sunt omii din calcularea factorilor de structur F(S).
Calitatea hrii de diferen depinde de acurateea fazelor calculate pornind
de la modelul iniial. Cu o bun hart de diferen, putem folosi densitatea
electronic rezidual pentru a construi acele pri ale structurii necunoscute
care s se ncadreze n densitile observate. Alt restrngere a nlocuirii
moleculare este c modelul trebuie s fie amplasat ntr-o orientare corect i
n poziiile absolute din unitatea cristalografic. Dac aceste criterii nu sunt
ntrunite, chiar i un model perfect nu poate faza corect datele de difracie.
Aceast condiie este critic atunci cnd utilizm un model derivat din alte
metode (de exemplu din structuri determinate prin NMR) sau dintr-o structur
cu parametri diferii ai unitii cristalografice. Evident, cel mai simplu caz este
unul n care modelul folosit pentru fazarea datelor provine dintr-o structur
plasat n exact aceeai orientare i poziie n interiorul crstalului iar cristalele
sunt isomorfe. Cnd acest caz nu este valabil, modelul de pornire trebuie
plasat n noua unitate cristalografic i poziionat corespunztor. Aceasta se
realizeaz de obicei printr-o serie de rotaii i translaii pentru a suprapune
modelul peste densitatea electronic. La fel, succesul metodei depinde de ct
de bine se suprapune structura iniial peste structura necunoscut.
O alt metod de rezolvare a problemei fazei este utilizarea funciei
Patterson. ntruct intensitile nregistrate pe o imagine de difracie conin o
anumit informaie de faz asupra poziiilor relative ale atomilor n unitatea
cristalografic, se poate construi o serie Fourier pornind de la intensitile
experimentale i poziiile atomilor, numit funcie Patterson:
Datorit simetriei difraciei, dac transformata reflexiei F(S) este (r),
transformata conjugatei sale complexe F*(S) este (-r), deci harta Patterson
este de forma:
15
( )
) ( 2
2
1
) , , (
lz ky hx i
h k l
e hkl F
V
z y x P
+ +

) ( ) ( ) , , (
1 1
k k
N
j
N
k
j j
z y x P r r r

Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
Poziiile maximelor pe aceast hart corespund diferenelor vectoriale ntre
poziiile atomilor. Pentru cazul cel mai simplu, al unui cristal cu doi atomi A i
B n unitatea cristalografic, harta Patterson, reprezentat n Figura 9b,
conine poziia vectorului diferen. n cazul adugrii a nc doi atomi A' i B'
n poziii simetrice cu A i B fa de centrul unitii cristalografice, harta
Patterson cuprinde multiple maxime, care sunt unite prin vectori ncruciai
(cross vectors) sau vectori proprii (self vectors) - Figura 9cd. Dac doi vectori
diferii coincid, amplitudinile maximelor Patterson sunt aditive. Astfel, pentru o
molecul cu un numr mare de atomi, vectorii proprii din origine devin rapid
trstura dominant a hrii Patterson.
Harta Patterson n sine nu presupune neaprat simetria unitii cristalografice,
ns anumite seciuni, numite seciuni Harker, reflect anumite elemente de
simetrie ale grupului spaial original al cristalului. Pentru cristalele de acizi
nucleici harta Patterson este util n rezolvarea structurii, datorit repetiiei
perechilor de baze amplasate la distane egale de-a lungul axei helixului.
) , , ( ) (
B A B A B A B A
z z y y x x r r
16
Metode de difracie
Astfel, distanele interatomice ntre planurile perechilor de baze tind s
domine harta Patterson.
Cea mai rspndit metod de fazare a datelor de difracie rmne totui
nlocuirea isomorf multipl. Dup colectarea unui set de date de difracie,
numit set nativ, pe un cristal nemodificat, ai crui factori de structur sunt
notai F
P
, se obin cristale isomorfe prin includerea unor atomi grei de metal
sau halogen n anumite poziii specifice. Pe aceste cristale modificate, care au
form aproape identic i aparin aceluiai grup spaial, se nregistreaz
seturi derivate de imagini de difracie, cu factori de structur F
PH
. Aceste seturi
sunt scalate fa de setul nativ, obinndu-se un set diferen cu factorul de
structur F
H
, care reprezint difacia doar de ctre atomii elementului greu
utilizat pentru nlocuire. Procesul este repetat pentru un derivat cu un alt atom
greu. Fazele a cel puin doi atomi grei sunt utilizate pentru a estima faza
setului de date nativ. Metoda poate fi neleas intuitiv cu ajutorul diagramelor
17
Figura 9. a. Poziiile a doi atomi ntr-o unitate cristalografic, i b., harta
Patterson corespunztoare, cu indicarea celor doi vectori ncruciai. c.
adugarea a doi atomi suplimentari simetrici duce la o hart Patetrson complex,
d., cu patru vectori ncruciai suplimentari.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
Argand. n aceste diagrame, factorii de structur F
P
i F
PH
, a cror amplitudine
este cunoscut, ns a cror orientare spaial rmne incert, determin
cercuri ale cror centre sunt decalate prin F
H
. Din interseciile celor dou
cercuri se pot reconstitui dou orientri posibile ale factorilor de structur,
ambiguitatea fiind rezolvat prin folosirea mai multor substituii.
Folosind fazele estimate ale setului de date nativ se poate reprezenta o hart
aproximativ a densitii electronice. Prin conectarea regiunilor continue cu
densitate ridicat se poate construi un model iniial al structurii
macromoleculare. n proteine, primele structuri care devin evidente sunt
structurile regulate ale -helixurilor, care pot fi fitate prin unui lan polialanil n
regiunile bine definite de densitate electronic, procedu denumit trasarea
lanurilor. Pe msur ce se adaug informaie structural la acest model
iniial, informaia de faz se mbuntete i harta de densitate electronic
devine mai precis conturat. Atunci cnd cea mai mare parte a lanului
principal a fost ordonat, catenele laterale ale reziduurilor mai voluminoase
ncep s ias n eviden. n aceast etap, secvena devine un element
indispensabil n definitivarea structurii.
Un criteriu obiectiv de evaluare a acurateii fitrii unei structuri este factorul R,
calculat pornind de la amplitudinile factorilor de structur experimentali, F(hkl),
i ai modelului structural, F
calc
:
18

) (
) (
hkl F
F hkl F
R
calc
Figura 10. Estimarea fazei n metoda nlocuirii isomorfe multiple cu ajutorul
diagramelor Argand. Razele celor dou cercuri Argand, corespunztoare
structurii native i celei substituite cu un atom greu, au amplitudinile factorilor de
structur corespunztori, |F
P
| i |F
PH
|, iar centrele sunt separate prin factorul de
structur al atomului greu, F
H
.
Metode de difracie
Factorul R variaz de la aproximativ 70% pentru o fitare aleatoare la 0 pentru
o fitare ideal. n general se consider c un factor R sub 20% indic o fitare
bun, care poate reprezenta soluia unei structuri.
n fine, o alt metod de fazare a datelor de difracie este cea a dispersiei
anomale. Fenomenul se bazeaz pe absorbia radiaiei X incidente de ctre
atomii grei, ceea ce face ca factorul de reflexie f s devin dependent de
faz. Diferena ntre intensitile perechilor Friedel poate fi folosit pentru
determinarea fazei atomilor grei. Recent, fenomenul dispersiei anomale a fost
aplicat n metoda numit multiple-wavelength anomalous dispersion (MAD),
care permite fazarea macromoleculelor folosind un derivat cu un singur atom
greu. Lucrnd la dou lungimi de und diferite, se obin dou informatii de
faz, care sunt suficiente pentru rezolvarea structurii.

2. Metode de rezonan magnetic nuclear
Fenomenul de rezonan magnetic nuclear (NMR) se bazeaz pe
proprietatea de spin a particulelor cu sarcin electric din nucleele atomilor.
ntr-o aproximaie clasic, o sarcin n rotaie reprezint o bucl de curent
electric, care genereaz un cmp magnetic, deci poate fi caracterizat printr-
un moment magnetic de dipol m. n descrierea cuantic, aceast proprietate
este reprezentat printr-un numr cuantic de spin I, numit prescurtat spin.
Pentru multe tipuri de nuclee, momentele magnetice de dipol ale particulelor
constituente se anuleaz reciproc, deci spinul nuclear de ansamblu este 0. La
aplicarea unui cmp magnetic extern, un nucleu de spin I poate lua un numr
de 2I+1 orientri distincte fa de direcia cmpului extern. Aceste orientri
sunt caracterizate prin numrul cuantic magnetic m
s
. Astfel, protonul, cu un
spin I = , poate lua doar dou orientri distincte fa de un cmp magnetic
extern, n sensul cmpului sau n sens opus cmpului, caracterizate prin
numerele cuantice magnetice m
s
= +1/2 i 1/2. Evident, orientarea de
energie minim este cu spinul n sensul cmpului extern. Particula poate fi
imaginat ca executnd o micare de precesie a spinului n jurul axei
cmpului magnetic extern, definit ca ax z, asemntoare micrii de
precesie a unui titirez fa de planul mesei, sau micrii de precesie a
Pmntului sau altei planete fa de planul orbitei circumsolare. Energia
19
Metode de rezonan magnetic nuclear
potenial de interaciune a unui dipol magnetic m cu un cmp magnetic
extern de inducie H este dat de expresia:
Componenta momentului magnetic de dipol pe direcia cmpului extern, m
z
,
se poate calcula prin formula:
unde este o constant empiric numit factor giromagnetic, avnd valori
diferite pentru diferite nuclee (Tabelul 1.2). Se observ cu uurin c protonul
(izotopul
1
H) are att un factor giromagnetic favorabil ct i o abunden larg
n compuii biochimici naturali, de aceea este cel mai utilizat nucleu n studiile
de spectroscopie NMR.
Tabelul 1.2. Parametrii magnetici ai principalilor izotopi utilizai n NMR pentru
structuri biologice
Izotop Spin Abundena
natural
(%)
Factor
giromagnetic
(10
7
rad/sec T)
Sensibilitate
relativ
Sensibilitate
relativ n
abundena
natural
Frecvena
NMR relativ
1
H 99.98 26.7552 1.00 1.00 100.000
2
H 1 1.5 x 10
-2
4.1066 9.65 x 10
-3
1.45 x 10
-6
15.351
13
C 1.108 6.7283 1.59 x 10
-2
1.76 x 10
-4
25.144
15
N 0.37 -2.7126 1.04 x 10
-3
3.85 x 10
-6
10.133
19
F 100 25.1815 0.83 0.83 94.077
31
P 100 10.8394 6.63 x 10
-2
6.62 x 10
-2
40.481
113
Cd 12.26 -5.9609 1.09 x 10
-3
1.33 x 10
-3
22.182
Pentru o particul de spin , variaia de energie la tranziia ntre cele dou
stri de spin este:
20
H m E
s z
m h m
Figura 11. Cele dou orientri posibile ale momentului magnetic de dipol m al
unei particule cu spin 1/2 plasat ntr-un cmp magnetic extern de inducie H, i
variaia de energie E la tranziia ntre cele dou stri.
Metode de rezonan magnetic nuclear
fiind proporional cu inducia magnetic H. Frecvena de rezonan
corespunztoare acestei tranziii rezult dintr-un calcul cuantic simplu:
Aceast diferen de energie este mult inferioar cuantei de energie termic
k
B
T la temperatura camerei, deci, conform unei distribuii Boltzmann, starea
fundamental i cea excitat sunt aproape egal populate, cu un excedent de
numai 10
-4
pentru starea fundamental. ntruct coeficienii de tranziie B,
definii de Einstein, sunt egali pentru absorbia i emisia de radiaie, emisia
anuleaz aproape integral absorbia. De aceea instrumentele NMR trebuie s
21
H h H m E
z
2

2
H

Figura 12.
Decalajele chimice ale
protonilor din
principalele grupri
funcionale.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
fie extrem de sensibile, cu cmpuri magnetice puternice (de civa T), pentru
a crete diferena de populaie ntre cele dou stri, iar eantioanele msurate
suficient de consistente (cteva miligrame). Din punct de vedere constructiv
exist dou tipuri de spectrometre NMR: un tip mai vechi, numit cu und
continu (continuous wave CW), n care radiofrecvena de excitaie este
fix, iar rezonana se obine printr-o variaie liniar a intensitii cmpului
magnetic extern aplicat eantionului, i un tip modern, numit spectrometru
NMR cu transformat Fourier (Fourier transform FT), n care intensitatea
cmpului magnetic extern este constant, iar variaia radiofrecvenei de
excitaie se obine prin aplicarea unui puls scurt la frecvena fundamental, ce
poate fi descompus ntr-un spectru continuu de frecvene pe un anumit
interval (Figura 17). Schema constructiv a unui spectrometru NMR cu und
continu este reprezentat n Figura 13. Direcia cmpului magnetic extern
aplicat, de obicei cu ajutorul unor bobine supraconductoare, definete axa z.
Perechea de bobine orientate pe axa y este folosit pentru excitaia cu
frecven fix, iar bobina orientat pe axa x n jurul eantionului funcioneaz
ca detector al absorbiei radiofrecvenei de excitaie.
ntr-un spectrometru NMR de tip FT, frecvena de rezonan la absorbie
s
a
unui grup de protoni poate fi legat de frecvena fundamental de excitaie
0
prin relaia:
unde poart numele de coeficient de ecranare, el fiind dependent de
proprietile nveliului electronic al protonului respectiv, deci implicit de
) 1 (
0

s
Figura 13.
Schema constructiv a
unui spectrometru NMR de
tip CW.
22
Metode de rezonan magnetic nuclear
gruparea chimic din care acesta face parte. Pentru a calibra acest efect i a-l
face independent de intensitatea cmpului magnetic aplicat, se calculeaz
diferena ntre frecvena de
rezonan
s
i frecvena de
rezonan
r
a unor protoni foarte
bine ecranai din compui
standard precum tetrametilsilanul
(TMS) sau 2,2-metil-2-
silanpentan-5-sulfonatul (DSS), i
se raporteaz la frecvena
fundamental a instrumentului
0
,
definindu-se astfel un decalaj
chimic (chemical shift) ,
exprimat n pars per milion
(ppm):
Decalajele chimice ale protonilor din principalele tipuri de grupri chimice
funcionale sunt reprezentate n Figura 12, unde se pot distinge mai multe
tipuri de efecte. Ecranarea pozitiv local este produs de cmpul magnetic
indus n nveliul electronic sferic ce nconjoar protonul, care intr n
rezonan cu radiofrecvena de excitaie, producnd un cmp magnetic de
sens contrar celui extern (Figura 14a). Substituenii electronegativi ai
metanului exercit o atracie a nveliului electronic, scznd densitatea
electronic i n consecin ecranarea n jurul protonilor, n ordinea H
3
CO
(-)
,
H
3
CC, H
3
CN, H
3
CO. Ecranarea interatomic dat de atomii nvecinai poate
crete sau scade inducia cmpului magnetic extern aplicat. De exemplu,
23
0

s r

Figura 14. Tipuri de efecte

electronice locale n NMR.
a. Ecranarea pozitiv local.
b. Ecranarea interatomic.
c. Cureni inelari.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
electronii de legtur ntre doi atomi de carbon produc un cmp magnetic
indus atunci cnd leagtura este orientat pe direcia cmpului magnetic
extern. n etan i etilen, datorit unghiului pe care l fac protonii cu
axa legturii carbon-carbon, ecranarea este n general negativ, crescnd
intensitatea cmpului magnetic extern, ns n acetilen, unde protonii sunt
plasai pe axa legturii, ecranarea este pozitiv (Figura 14b). Curenii inelari
se datoreaz electronilor delocalizai ai ciclurilor aromatice. Aceti cureni
indui pe bucle largi produc cmpuri magnetice intense, cu efecte diferite n
funcie de poziia geometric a protonilor (Figura 14c), efecte importante n
special n macromolecule.
Interaciunile spin-spin, numite i interaciuni prin legtur, produc modificarea
decalajului chimic i despicarea vrfurilor de rezonan. Ele sunt
independente de intensitatea cmpului magnetic aplicat, i depind doar de
natura legturilor ntre cele dou grupri. De exemplu, spectrul NMR al
acetaldehidei ar trebui s conin dou vrfuri de rezonan, unul
corespunznd protonilor metil, cu un decalaj chimic mic (aproximativ 2), i
unul corespunznd protonului din gruparea aldehidic, cu un decalaj chimic
mare (ntre 9 i 10). n practic se constat ns un grup de rezonan cu 4
vrfuri, cu un decalaj chimic ntre 9 i 10. Acesta se explic prin interaciunea
ntre spinul protonului aldehidic i spinii celor trei protoni ai gruprii metil. n
funcie de orientrile acestor grupri de spini nivelul energetic fundamental se
despic n 4 subniveluri, cu 0, 1, 2, 3 spini metil orientai paralel cu spinul
aldehidic. Diagrama de combinaii a acestor grupri de spini (Figura 15b)
explic i raportul ariilor rezonanelor corespunztoare, de 1:3:3:1.
Figura 15. Interaciunile spin-spin n acetaldehid deplaseaz decalajul chimic al
protonilor din gruparea metil i despic vrful lor de rezonan. a. Diagrama de
niveluri de energie ale protonului aldehidic, i. b. cea a protonilor din gruparea
metil.
24
Metode de rezonan magnetic nuclear
Interaciunea spin-spin ntre dou nuclee poate fi cuantificat printr-o
constant de cuplaj spin-spin J, ce reprezint magnitudinea despicrii
vrfurilor de rezonan n Hz, independent de intensitatea cmpului
magnetic
extern aplicat. Ea depinde ns de
orientrile relative ale celor dou nuclee,
conform formulei gsite de Martin Karplus
n 1959:
n care y i z definesc nucleele care
interacioneaz, iar x definete tipul
cuplrii: geminal (prin dou legturi, x =
2), caz n care reprezint unghiul dintre
cele dou legturi, sau vicinal (prin trei legturi, x = 3), n acest caz
reprezentnd unghiul diedru dintre planurile definite de cele dou grupuri de
trei atomi din legtur. Cuplajul spin-spin poate fi anulat prin metode de dubl
rezonan, excitnd la saturaie unul dintre protoni cu o frecven i studiind
rezonana celuilalt proton cu o a doua surs de radiofrecven astfel se
realizeaz decuplarea celor doi protoni.
Un alt tip de interaciune ntre nuclee observat n spectroscopia NMR este
interaciunea prin spaiu, numit i efect Overhauser nuclear (NOE). Ea
reprezint o interaciune de tip dipol-dipol, deci are o dependen strns de
distana dintre cele dou nuclee (e proporional cu r
-6
), fiind semnificativ la
distane sub 0.5 nm. Excitarea unuia dintre nuclee cu o frecven de
rezonan determin o emisie ce se propag prin spaiu la al doilea nucleu,
25
C B A J
yz
x
+ + cos cos
2
Figura 16. Creterea excedentului de spini
pe nivelul fundamental N
g
dup saturarea
sistemului, prin relaxare spin-latice (entalpic)
cu constanta de timp T
1
.
Constanta de timp de relaxare spin-spin
(entropic) T
2
poate fi calculat din lrgimea
vrfului de rezonan.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
modificnd raportul ntre populaiile de pe nivelul fundamental i cel excitat.
Aceast schimbare poate fi detectat cu un al doilea semnal de
radiofrecven, intensitatea rezonanei permind estimarea distanei dintre
cele dou nuclee.
O surs puternic poate alinia fazele micrii de precesie a spinilor nucleari.
La ncetarea activitii sursei de radiofrecven de excitaie au loc diferite
fenomene de relaxare care duc la pierderea acestei coerene de faz. n
relaxarea spin-latice protonii n stare excitat interacioneaz cu cmpurile
magnetice fluctuante generate de ali atomi din molecul (laticea). Aceasta
este o relaxare entalpic, deoarece readuce protonii pe nivelul fundamental,
genernd cldur. Excitnd eantionul cu o surs CW puternic se aduce
sistemul la saturaie, cu populaii egale ale celor dou niveluri, fundamental
ground (N
g
) i excitat (N
e
), moment n care vrfurile de absorbie din spectru
se terg. Apoi, la ntreruperea sursei, se monitorizeaz reapariia vrfurilor de
rezonan, proces caracterizat printr-o cinetic de tip monoexponenial,
definit prin constanta de timp de relaxare spin-latice T
1
. n relaxarea spin-
spin are loc o interaciune de tip dipol-dipol ntre spini de acelai tip,
modificnd popularea nivelurilor fundamental i excitat. Acest proces duce la
dezordonarea sistemului, deci este o relaxare entropic. Deoarece constanta
de timp de relaxare spin-spin T
2
este mai mic dect T
1
, ea reprezint
procesul predominant ce definete lrgimea vrfurilor de rezonan. Astfel,
semilrgimea unui vrf de rezonan, msurat la din intensitatea maxim
a vrfului, este aproximativ egal cu 1/T
2
.
ntr-un spectrometru de tip CW, prin variaia intensitii cmpului magnetic
extern aplicat se poate nregistra spectrul de absorbie unidimensional al unui
compus chimic. Un astfel de spectru are nscris pe abscis decalajul chimic
n ppm iar pe ordonat intensitatea semnalului de radiofrecven n bobina de
detecie. n spectrometrele de tip FT se aplic un puls de radiofrecven
avnd frecvena fundamental
0
i o durat limitat , de ordinul a 10 s.
Prin analiz Fourier se demonstreaz c un astfel de semnal poate fi
descompus ntr-un spectru continuu de frecvene centrate n jurul frecvenei
fundamentale, ale cror amplitudini sunt date de formula:
1
]
1

) (
) ( sin
2
0
0
H
26
Metode de rezonan magnetic nuclear
Energia absorbit la frecvenele de rezonan aduce n faz micarea de
precesie a spinilor protonici. Dup ncetarea pulsului de excitaie, coerena de
faz a precesiei spinilor nucleari se pierde treptat prin procese de relaxare
spin-spin i spin-latice. Acest proces este nregistrat de aceeai pereche de
bobine folosite pentru aplicarea pulsului de excitaie, n intervalul de timp
imediat consecutiv, numit perioad de detecie, n care se obine un semnal
cu decrement exponenial, numit free induction decay (FID). Prin
transformarea Fourier a semnalului FID din domeniul timp n domeniul
frecven se obine un spectru unidimensional similar celui nregistrat cu un
instrument CW, obinut ns ntr-un interval de timp mult mai scurt. n plus,
prin medierea coerent a unui mare numr de semnale FID raportul
semnal/zgomot se amelioreaz considerabil, ceea ce duce la o sensibilitate
crescut a spectrometriei FT.
n absena radiofrecvenei de excitaie, micarea de precesie a spinilor
27
Figura 17. Pulsul de radiofrecven de excitaie de durat limitat folosit n
FT-NMR, i spectrul echivalent de frecvene. Jos: etapa de detecie n FT-NMR:
semnalul de free induction decay (FID) i transformata sa Fourier.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
nucleari pe cele dou orientri posibile nu este aliniat n faz. Datorit
uorului excedent de spini pe nivelul fundamental, exist un moment
magnetic de dipol net M orientat pe axa z. La aplicarea unui puls de
excitaie de o
anumit intensitate acest exces de spini se
redistribuie uniform pe cele dou niveluri, deci
magnetizarea pe axa z dispare, ns apare o aliniere
a micrii de precesie a spinilor n planul xy, care
duce la apariia unei magnetizri nete cu precesie n
acest plan la frecvena de excitaie. Astfel axul
magnetizrii se schimb cu 90, de aceea pulsul
respectiv poart numele de puls de 90 sau puls /2.
La intensiti mai mari ale undei de excitaie se pot
obine pulsuri de 180 () sau chiar 270 (3/2). La
un astfel de puls precesia spinilor are loc tot n
planul xy, ns n antifaz cu semnalul de excitaie.
Spectrul NMR unidimensional poate aduce o serie
de informaii utile despre structura chimic a
compuilor analizai, n special dac acetia sunt de complexitate redus i
rezonanele pot fi identificate fr ambiguitate. Pentru compuii
macromoleculari ns numrul rezonanelor crete spectaculos i spectrul 1D
devine neinterpretabil.
n ncercarea de a depi aceste dificulti au fost imaginate protocoale NMR
multidimensionale, care identific interaciunile prin legtur sau prin spaiu.
Ele poart numele generic de metode spectroscopice de corelaie.
Interaciunile pot avea loc ntre diferite tipuri de nuclee cu activitate NMR:
1
H
1
H,
1
H
13
C,
13
C
13
C, etc. Cele mai rspndite sunt protocoalele FT NMR
28
Figura 18. a. cele dou orientri ale spinilor nucleari
ntru-un cmp magnetic extern. b. excedentul de
populaie pe nivelul fundamental, i c. anularea acestui
excedent i fazarea precesiei spinilor printr-un puls de
excitaie de 90.
Metode de rezonan magnetic nuclear
bidimensionale (2D) numite correlated spectroscopy (COSY) i nuclear
Overhauser effect spectroscopy (NOESY).
Protocolul COSY folosete dou pulsuri de 90 separate de un interval de
timp variabil t
1
. Ele definesc trei etape numite preparare, evoluie i detecie.
n perioada de preparare se disipeaz coerena de faz obinut din
29
Figura 19. Etapele protocoalelor FT-
NMR 2D COSY i NOESY.
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
protocolul anterior i se reface distribuia Boltzmann pe niveluri prin relaxare
spin-spin i spin-latice. Aplicarea primului puls de 90 aduce o nou coeren
de faz, care se redistribuie n cursul perioadei de evoluie prin interaciuni
spin-spin (prin legtur). Efectele acestei redistribuiri sunt detectate dup
aplicarea celui de-al doilea puls. Intervalul de evoluie t
1
este incrementat cu
cte 150 s, pn la aproximativ 100 ms. Pentru fiecare valoare a t
1
se culege
un numr semnificativ statistic de spectre, de exemplu 64, care se mediaz
coerent. Astfel, pe o diagram bidimensional se pot reprezenta cele dou
dimensiuni de frecven
1
i
2
, corespunztoare celor dou intervale de timp,
evoluie (t
1
) i detecie (t
2
). n afara vrfurilor de pe diagonala principal, care
reprezint fenomene de autorezonan i sunt echivalente cu un spectru
unidimensional, se nregistreaz un numr de vrfuri secundare
corespunztoare legturilor chimice ntre nucleele rezonante. n cazul
oligopeptidelor metoda este util n identificarea secvenei de aminoacizi,
atunci cnd rezonanele fiecrui reziduu aminoacil (sistemele de spin) pot fi
30
Figura 20. Semnificaia celor dou dimensiuni ale diagramei unui protocol FT-NMR
2D (n acest exemplu este artat un protocol complet pentru obinerea unei
diagrame COSY).
Figura 21. Diagrama de conectivitate NOESY-COSY a inhibitorului bazic pancreatic
bovin de tripsin (BPTI) ce duce la identificarea secvenei (dup Wttrich et al.
1981)
Metode de rezonan magnetic nuclear
identificate fr ambiguitate i legturile peptidice ntre reziduurile adiacente
pot fi stabilite, ns aplicabilitatea este destul de limitat.
Protocolul NOESY introduce un al treilea puls, de amestec, ntre cel de
evoluie i de detecie. Astfel se definesc patru intervale de timp: preparare,
evoluie, amestec, i detecie. Intervalul de amestec duce la disiparea
rezonanelor prin legtur, care sunt predominante, astfel nct pulsul de
detecie deceleaz, n afara autorezonanelor, transferurile de rezonan prin
spaiu, prin efect Overhauser nuclear. Astfel se pot obine date structurale
importante despre grupri funcionale distincte, care se pot gsi la mare
distan n secvena macromoleculei, ns pot fi apropiate spaial unele de
altele n structura tridimensional. Prin combinarea unei diagrame COSY cu o
diagram NOESY (ambele reprezentri sunt simetrice fa de diagonala
principal, deci o jumtate a graficului tiat de aceast diagonal conine
informaia n totalitate) se poate construi o diagram de conectivitate NOESY-
COSY care s duc la identificarea secvenei de aminoacizi. Vrfurile de
interferen NOESY pot fi folosite pentru a conecta gruparea C

H a reziduului
i cu gruparea NH a reziduului i + 1, iar interferenele COSY pentru a conecta
gruparea NH cu gruparea C

H a reziduului i + 1. Metoda a fost imaginat de

K. Wttrich et al. n 1981. Spectroscopia NOESY are aplicaii importante n
stabilirea domeniilor de structur secundar ale macromoleculelor. -helixurile
proteice prezint interferene C

H/NH pronunate ntre reziduurile i i i + 3,

corespunznd unei distane ntre protoni de 0.32 nm, iar helixurile 3
10
interferene NH/NH pronunate ntre reziduurile i i i + 1, corespunznd unei
distane ntre protoni de 0.28 nm. Foile au interferene secveniale C

H/NH
puternice ntre reziduurile i i i + 1, corespunznd unei distane ntre protoni
de 0.22 nm. Diagrama NOESY ofer distanele aproximative ntre protonii
scheletului principal, protonii catenelor laterale, i protoni care sunt relativ
ndeprtai n secven ns apropiai n structura spaial (geometria
distanelor). n plus, constantele de cuplaj spin-spin dau cu aproximaie
unghiurile de torsiune. Exist programe care folosesc toate aceste
constrngeri conformaionale i minimizarea energetic pentru a genera
structura unei proteine din datele NMR restrained molecular dynamics.
31
Metode experimentale n explorarea structurii biomoleculelor
Principala problem n utilizarea NMR pentru determinarea structurii
proteinelor este identificarea rezonanelor protonice. Exist i alte protocoale
2D utile n acest scop, de exemplu TOCSY (total correlation spectroscopy),
care identific interaciunile spin-spin peste o serie mai mare de legturi dect
COSY, ajutnd la rezolvarea ambiguitilor legate de profilurile de spin
similare ale diferitelor tipuri de aminoacizi, atribuirii catenelor laterale, i
incertitudinii datorate aglomerrii interferenelor. Exist i posibilitatea folosirii
interferenelor cu izotopii
13
C i
15
N n experimente 2D heteronucleare n mod
invers, n care izotopii sunt excitai n t
1
iar protonii sunt detectai n t
2
.
n studiile NMR 2D asupra acizilor nucleici, se pot identifica interferene
datorit apropierii spaiale a unor protoni din bazele organice azotate i din
ciclurile monozaharidice. Astfel, au fost descrise dou ci ce pot fi puse n
eviden pe diagramele NOESY (Figura 22): calea 1' i calea 2'2". n plus, se
pot folosi i n acest caz experimente heteronucleare. Izotopul natural
31
P
poate face trecerea de la C
4'
H la C
3'
H, iar izotopul
13
C poate fi folosit n
experimente n mod invers.
32
Figura 22. Cele dou ci de interferen
spaial a protonilor din bazele azotate i
monozaharide folosite pentru identificarea
secvenei DNA n experimente NOESY: calea
1' () i calea 2'2" (- - -).