Sunteți pe pagina 1din 5

5. Manipularea genetica a animalelor 5.

1 Introducere In cele trei capitol anterioare am luat in considerare metodele valabile in ceea ce priveste transferarea genelor in celulele animalelor. In acest capitol vom avansa putin mai departe principiul transferului de gene si vom discuta despre modificarile genetice nu care au loc la nivelul unei celule, ci la intreg animalul. Abilitatea de a manipula genomul animalelor este unul dintre cele mai importante progrese stiintifice din ultimii 50 de ani, prevede testarea fundamentala a sistemului a functiei si a reglementarii genelor. Modificarea genetica a speciilor domestice poate fi folosita de asemenea si pentru imbunatatirea calitatii trasaturilor in ferme, cresterea rezistentei la boli si generarea turmelor de elita. Un animal in care fiecare celula este purtatoare de noi informatii genetice este descris ca fiind transgenic. Original, de fapt, acest termen a fost restrictionat pentru animalele purtatoare de adn strain ( ex. Adn de la o specie diferita sau adn recombinat), dar in zilele noastre este usor acceptabil sa descrii un animal purtator de copii suplimentare ale secventelor endogene ca transgenic atat timp cat aceste secvente au fost introduse artificial in genom precum adn-ul exogen. Totusi, majoritatea oamenilor de stiinta nu descriu animalele modificate genetic ca fiind transgenice daca acestea sufera mutatii minore, cum ar fi centrul mutatiilor introduse de catre tinta genelor. Trebuie sa distingem clar inca de la inceputul acestui capitol diferenta dintre un animal transgenic si un animal (sau om) care a fost supus transferului de adn in vitro folosind metodele descrise in capitolele 2-4. Obstacolul care trebuie depasit atunci cand producem animale transgenice este introducerea aceleasi secvente de adn exogen in acelasi loc in fiecare celula inclusivin cele germline astfel incat animalul transgenic produce urmasi transgenici. Doar introducerea adn-ului in sange sau intr-o populatie specifica de celule ale pielii sau muscular nu va duce la nici o realizare, de aceea terapia genica la nivelul tesuturilor somatice pe oameni este considerata din punct de vedere etic acceptabila pe cand terapia genica germinal nu. Spre deosebire de cultivarea de celule intr-un vas,pur si simplu nu este posibil sa introduci un adn intr-un animal si sa selectezi acele celule care au fost transformate. In schimb, adn-ul trebuie introdus in celule individuale care au potentialul de a produce un animal intreg, asemenea cellule fiind descrise precum totipotent sau pluripotent. In general aceasta implica intoducerea de adn direct in celulele germinale, gameti sau embrion timpuriu (mai important decat dezvoltarea germinala), desi in unele tulpini de soareci este posibil sa explorezi avantajele culturilor de celule prin folosirea de celule stem embrionice, care sunt derivate din preimplatare embrionala si care contrubie la toate tesuturile de dezvoltare a animalului ( incluzand partea germinala) daca este introdus intr-o gazda embrion la stadiul de dezvoltare corect. Celulele embrionice stem vezi continuarea pe pc flavius. Aici vine partea de pe laptopul tau, 5.3. Metodele standard pentru producerea de soricei transgenici

Microinjectia pronucleara Tehnica care a fost stabilita pentru producerea de soricei transgenici este injectarea adn-ului in pronucleul de sex masculine, conform figurei 5.1. Imediat dupa fertilizare, nucleul de sperma este neacoperit dar ramane separate de pronucleele de feminine mici pana dupa prima divizare a zigotului. In aceasta etapa, o cantitate mica de adn poate fi introdusa printr-o injectie fina, pregatita prin intinderea unei pipete de sticla intr-o flacara Bunsen. In timpul procedurii de transfer, oul este tinut in loc cu o pipeta de aspirare. Dupa injectare, embrionii sunt cultivate in vitro pana la stadiul de a 8-a sau a 16-a celula apoi fiind transferate femelelor pseudoinsarcinate transmise de pereche cu cele masculine, pentru dezvoltarea la termen ( Protocol 5.1.). ADN-ul introdus prin microinjectie tinde sa se integreze pe un singur loc ( desi multiple locuri de integrare au fost documentate) in general ca o matrice de 10-50 copii. Un numar mai mare de copii au fost raportate si acest lucru poate fi o functie a valorii ADN-ului injectat. In mai multe cazuri, AND-ul se integreaza imediat si rezultatul generatiei de soareci F0 ( transformat primar sau fondator) este transgenic. In alte cazuri, AND-ul nu se integreaza decat pana cand prima sau a doua runda de diviziune nu este complete, asa ca embrionul timpuriu este de tip mozaic ( un mix dintre celulele transformate si netransformate derivate de la acelasi fond genetic) mai degraba decat transgenic. Sub astfel de circumstante, soarecele fondator el insusi poate fi transgenic, daca toate celulele netransformate contribuie la membranele extra-embrionice, dar este mult mai probabil sa fie de tip mozaic. Este necesar sa testam prima generatie de pui (F1) privind prezenta de transgene pentru confirmarea transmiterii de germline. Este posibil ca insasi germline sa fie de tip mosaic, ceea ce inseamna ca doar o parte din pui vor fi purtatori de transgene. Microinjectia pronucleara este de incredere, variind in eficienta de la 5% pana la 50% ( proportia linie transgenice de la ouale injectate). Ocazional, poate fi pe scara mare rearanjari sau stergeri genomice la locurile integrarii si in unele cazuri intregul loc poate fi hiper-metilic sau redus la tacere ( Capitolul 8). Locul integrarii este intamplator ceea ce probabil reflecta pozitia spatiilor cromozomiale pre-existenti. Transductie cu retrovirusi recombinati Dupa cum am discutat in capitolul 4, retrovirusii recombinati furnizeaza un mechanism natural pentru stabilizarea introducerii AND-ului in genomi a impartirii celulelor animale. Retrovirusii pot infecta embrionii timpurii a soriceilor precum si de cultura de cellule stem ( vezi alaturi), astfel vectorii retrovirali recombinati au fost folositi considerabil pentru soarecii transgenici. In timp ce este adevarat ca transductia retrovirala tind sa genereze o singura copie transgenica fara o rupture semnificativa a AND-ului genomic inconjurator, exista mai multe limitari majore care restrange utilitatea acestei metode. Acestea include capacitatea limitata a vectorilor retrovirali asa cum un transgenic asa de mare nu poate fi integrat in aceasta maniera, tendinta elementelor reglatorii virale de a interfera cu expresia gene exogene inconjuratoare si tendinta provirusilor integrati de a deveni metilici si

redusi la tacere. Embrionii fondatori de multe ori sunt de tip mozaic mai mult decat transgenici, asa ca transmiterea germica trebuie sa fie confirmata de generatia F1. In zilele noastre, transductia retrovirala este foarte putin folosita pentru a forma soareci transgenici din cauza beneficiilor mai mari rezultate din alte metode. Totusi, ramane de folos in cazul transferului de gene la pasari si alte mamifere si ca metoda pentru a genera sectorul transgenic a embrionilor pentru studiile de dezvoltare. 5.7. Broaste transgenice Dupa cum am discutat mai devreme, AND-ul introdus in embrionii broasca tind sa ramana epistomal mai degraba decat integrandu-se in genom, facand acest lucru dificil de a produce linii transgenice. Intr-adevar , in timp ce AND-ul extracromozomial din celulele mamiferelor este foarte repede distrus, AND-ul introdus in ouale de broasca nu numai ca persista bine pe perioada dezvoltarii, dar da si replici, in crestere de pana la 100-fold de faza gastrula. In dezvoltarea tarzie, cantitatea de AND episomal scade pentru fiecare embrion, partea de AND ramasa pare sa se integreze, desi intr-o mare reprezentare mozaicala diferit integrate evenimente in celuli diferite. Aceasta diferenta dintre mamifere si amfibieni reflecta cel mai probabil stagiile diferite de dezvoltare: lente si asincrone clivaje in divizionarea mamiferelor cu debut precoce a expresiei genelor embrionice, in comparative cu diviziuni rapide si sincronice in ouale Xenopus prin urmare este asamblat imediat in cromatina si sufera reproducere in arie cu rapida sinteza a ADN-ului deja survenit in nucleu. Din cauza tendintei AND-ului exogen de a ramane in statutul de episomal in ouale de broasca, un process efficient pentru transgenica Xenopus a fost dezvoltarea implicand manipularea spermei in nucleu. In aceasta tehnica, cunoscuta ca restrictie de integrare enzymemediated, plasmide liniarizate care contin transgena de interes sunt amestecate cu nucleul spermei intr-un mediu inconjurator total artificial si limitarea cantitatii unei enzyme pentru introducerea de nick-uri in AND. Nucleele sunt introduse in nefertilizatele oua Xenopus, unde AND-ul este reparat, rezultand integrarea plasmidei AND-ului in genom. Tehnica genereaza embrioni tansgenici care in general supravietuiesc pana la stadiul de mormoloc, dar este de asemenea sufficient pentru producerea adultilor transformati care pun bazele liniilor transgenice. Ca si in cazul Xenopus laevis, care este o specie tetraploid, tehnica poate fi aplicata de asemenea si in cazul Xenopus tropicalis, care este diploid si are un interval de viata mai scurt. 5.8. Pestii transgenici In momentul scrierii, numarul raportat de specii de pesti transgenici aproape de 40 probabil surprinzator, este mult mai mare decat numarul de mamifere transgenice. Lista include modele de specii precum pestele zebra ( Danio rerio), peste puffer( Fugu rubripes) si medaka ( Oryzias latipes), important aliment din punct de vedere comercial si multe alte specii de pesti ca stiuca, pestele de aur, tipar si somn. Din anul 1985 cand primul transgenic a fost reportat, transferul de

gene la peste a ajuns predominant la stadiul de injectare a AND-ului in citoplasma oualelor fertilizate, in general rezultand integrare in mozaic si productia de transgenici in generatia F1. Eficienta acestei procedure este comparabila cu cea a transferarii de AND mamiferelor domestic, aproximativ 1% transgenic. In peste unde ouale sunt protejate dur, este deseori necesar sa formezi o gaura prealabil injectand sau explorand micropyle pentru introducerea AND-ului. Mai recent, metode precum electroporatie si bombardamentul particulelor au fost de asemenea utilizate cu succes pentru formarea de pesti transgenici. O noua thenica aplicata pe unele specii in electroporatia spermei cu plasmida AND-ului urmata de sperma mediate AND-ului transferat, o procedura care este in mare masura asemanatoare cu tehnica REMI descrisa pentru amfibieni.aceasta pare sa fie mai putin eficienta decat injectarea , dar cu toate acestea da rezultate in trangenica crapului, pisicii de de mare, somnului si a stiucii. Ca si la broaste, injectarea AND-ului in ouale de peste si a embrionilor timpurii conduc la o copie si la o expresie extinsa pentru transgenicii neinjectati, asa pestele ca si broastele pot fi folositi la testarea transgenica. O parte din AND se integreaza in genom, conducand la o transmisie germica mozaicala si la productia de peste transgenic. 5.9 Insectele si viermii transgenici Aceste doua specii de modele nevertebrate sunt Drosophila melanogaster si Caenorhabditis elegans. In ambele cazuri, transmisia este realizata de o microinjectie in zona embrionului care va da nastere celulei germ stalpul plasmic la insecta si ganod la vierme. La insect, transferul de gene a fost prezentat in 1980 odata cu exploatarea transpozonilor exogeni numiti elementi P, care poate sari in mod spontan in genom al nucleului germoplasmei. In cazul viermelui, injectarea AND-ului este o metoda de rutina a transferului de gene, insa descoperirea RNA care a intervenit in anul 1998 a aratat ca mici parti din acizii nucleu ar putea fi introdusi in vierme doar punandu-I intr-un mediu care contine RNA sau hranindu-I din bacteria detinatoare de RNA. Transferul de gene la Drosophila Strategia de rutina folosita de a introduce AND in embrionul Drosophilei invoca elementele P, fiind transpozonii AND-ului la fel ca la elementele Sleeping Beauty discutate mai inainte. Deosebitul sistem a Sleeping Beauty, totusi, elementele P care apar in mod natural si pe deplin functionali transpozonii gasiti in anumite tulpine ale Drosophilei melanogaster sunt specii inrudite. Acesti transpozoni sunt activi doar in celulele germdar pot fi intradevar foarte active, ducand la un fenomen cunoscut precum P-M disgenezie hibrid unde rezultatul inserarii genomului multiplu intr-un numar mare de mutatii si anomalii cromozomiale la pui, cauzand o varietate de defecte genetice, sterilitate si dezvoltare anormala. Acest lucru este posibil atunci cand are loc imperecherea dintre un masculii care sunt purtatori de element P si femelele care duc lipsa de acest element. Nu apare in incrucisarea dintre masculii de tip M si femelele de tip P sau din incrucisarea in care amandoi atat masculul cat si femela sunt de tipul P. acest lucru reflecta faptul ca femelele de tip P

produc un represor a transpunerii elementului P, astfel transpunerea are loc doar atunci cand elementele P din nucleul de sperma sunt introduse in ou de tip M ( lipseste represorul Prima procedura pentru transformarea Drosophilei a fost conceputa de Spradling si Rubin si implica injectarea a elementului P din AND la polul opus a embrionului de tip M in etapa blastoderma. Ca si la alte insecte, dezvoltarea Drosophilei implica o faza in care nucleul zigotului se divide foarte rapid de mai multe ori, dar fiica nucleu ramane in general in citoplasma ). Substanta injectata a fost o plasmida continand un element P functional in care AND-ul in plus ( initial pentru vectorul clonat pBR322) a fost inserat in repetate randuri in cele 31bp. Polul opus a fost ales pentru injectare deoarece nucleul din aceasta regiune formeaza eventuale cellule sterm, facilitand transformarea germica. Dupa cum neam asteptat, unele progenituri de insecte contin elemental P recombinant, care a fost transportat din plasmida in aleator in partea genomului. Cu toate ca folosirea unui element P functional pentru transpunere faciliteaza efectiv transformarea germica a Drosophilei, un dezavantaj a acestei tehnici pripite a fost faptul ca viitoarele evenimente de transpuneri se pot produce in generatia urmatoare conducand la o duplicare transgenica si la mutatii a genelor exogene.