Biosinteza i dinamica intracelular a proteinelor

Biosinteza proteinelor

Fromarea legturilor peptidice...

... n procesul de traducere a informaiei genetice

Codul genetic

Regula universal de traducere a codonilor (grupuri de trei nucleotide) din ARNm n aminoacizi din lanul polipeptidic Este redundant codoni diferii sunt tradui n acelai aminoacid Codoni start (AUG) i stop (UAA, UAG sau UGA)

ARN de transfer

Molecule adaptoare ntre ARNm i aminoacizi ~80 nucleotide Structur teriar cu bucle: T, anticodon i D

ARN de transfer

Conin nucleotide neobinuite, rezultate prin modificri chimice post-transcriere (pseudouridin , dihidrouridin D, inozin I, etc.) Pot exista mai multe molecule ARNt pentru acelai aminoacid (48 anticodoni la om pentru 20 aa)

ARN de transfer

A treia baz azotat a codonului poate recunoate nucleotide ambigue ale anticodonului (wobble position) -> codul genetic este degenerat Anticodoni pentru acelai aminoacid difer n poziia a treia
Codon U C A G Anticodon A sau G sau I G sau I U sau I C sau U

ARN de transfer

E sintetizat de ARN polimeraza III E modificat covalent nainte de a prsi nucleul:

moleculele de ARNt precursor sunt scurtate uneori exist introni care sunt excizai i ARNt e nndit (splicing)

Realizarea modificrilor e dependent de plierea corect a moleculei de ARNt

Aminoacil-ARNt sintetaze

Enzime care cupleaz moleculele ARNt de aminoacidul corect (activarea aa) Exist 20 de aa-ARNt sintaze, cte una pentru fiecare aminoacid -> recunosc setul de ARNt corespunztor acelui aa

aa-ARNt sintetaze

Att aa-ARNt sintetazele, ct i ARNt asigur traducerea precis a codului genetic (adaptori)

Aminoacil-ARNt sintetaze

2 clase de aa-ARNt sintetaze:

I: ataaz restul aminoacil de radicalul hidroxil 2 din adenozina II: ataaz restul aminoacil de radicalul hidroxil 3 din adenozina

Exist mecanisme care asigur funcionarea corect a aa-ARNt-sintetazelor:

hidroliza aa recunoscui greit (editare hidrolitic) interaciunea cu anticodonul i captul 3 al ARNt

Biosinteza polipetidelor

Sinteza unei noi legturi peptidice: adugarea captului cacrboxi-terminal al lanului polipeptidic la un nou aminoacil-ARNt Energie eliberat prin hidroliza legturii macroergice peptid - ARNt

Ribozomii

Sediul sintezei lanurilor polipeptidice Complexe ribonucleoproteice mari Formai din dou subuniti: mare i mic Numr variabil n funcie de tipul celular i activitatea metabolic celular (cteva milioane / celul) Subunitile ribozomale sunt sintetizate la nivelul nucleolului

Ribozomii

Aspect ME: granule electronodense de 1530 nm Localizare:

liberi: n citosol, n matricea mitocondrial ataai membranei reticulului endoplasmic, anvelopei nucleare

http://www.nobelprize.org

GE Palade Nobel Prize Lecture, 1974

Biosinteza proteinelor

Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

Ribozomii

Procariote: 70S; 2,7 MDa (subuniti 50S i 30S) Eucariote: 80S; 4,3 MDa (subuniti 60S i 40S) Mitocondrii: 55S; ~3 MDa (subuniti 39S i 28S)

Structura ribozomilor 80S

Subunitile 60S (stnga) i 40S (dreapta) ale ribozomilor eucariotici cu eIF6, respectiv eIF1 ataate https://www.mol.biol.ethz.ch/groups/ban_group/Ribosome - 2011 Klinge S, Voigts-Hoffmann F, Leibundgut M, Arpagaus S, Ban N. (2011), Science 334(6058):941
Rabl J, Leibundgut M, Ataide SF, Haag A, Ban N. (2010), Science 331(6018):730

Subunitatea mare ribozomal 60S

Alctiut din 3 molecule ARN: 28S, 5,8S (provenite dintr-un transcript comun de 45S) i 5S Conine aprox. 50 lanuri proteice (notate L1L50), cu greutate molecular mic

Subunitatea mic ribozomal 40S

Alctuit dintr-o molecul ARN: 18S Conine aprox. 33 lanuri proteice (notate S1S50), cu greutate molecular mic

ARN ribozomal

Genele pentru ARN ribozomal:

ARNr 28S, 5,8S i 18S se formeaz dintr-un transcript iniial comun 45S. ADN-ul pentru ARNr 45S se gsete n 5 regiuni de pe cromozomii 13, 14, 15, 21 i 22. Transcris de ARN polimeraza I. ARNr 5S: gene n tandem rspndite n genom (ex. cromozomul 1). Transcris de ARN polimeraza III.

Ribozomii

Se gsesc cel mai frecvent grupai de-a lungul unei molecule de ARNm, formnd poliribozomi = polizomi
Molecular Biology of the Cell. 4th edition. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 2002.

Ribozomii

Molecular Biology of the Cell. Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. New York: Garland Science; 1994.

Situsuri ribozomale

Situsuri pentru ARNt:

A (aminoacil-ARNt) P (peptidil-ARNt) E (exit)

Situs pentru ARNm

Ribozomii

Etapele sintezei lanului polipeptidic: 1.Iniierea sintezei 2.Alungirea lanului 3.ncheierea sintezei

Iniierea sintezei lanului polipeptidic

Se formeaz un complex de preiniiere din: subunitatea mic ribozomal, primul aminoacil-ARNt, iniiator, (ntotdeauna metionin-ARNt) i factorii eucariotici de iniiere eIF1 eIF4 Complexul se ataeaz pe ARNm

Iniierea sintezei lanului polipeptidic

Complexul de preiniiere detecteaz primul codon start AUG Se formeaz complexul de iniiere prin legarea subunitii ribozomale 60S i pierderea factorilor de iniiere. MetARNt este situat n situsul P al ribozomului

Iniierea sintezei lanului polipeptidic

Iniierea sintezei lanului polipeptidic poate controla eficiena sintezei proteinelor sunt importante secvenele din vecintatea codonului start Uneori, sinteza poate ncepe de la un alt codon start, situat spre captul 3 (IRES Internal Ribosome Entry Sites)

Alungirea lanului polipeptidic

1: E - gol P polipeptidil-ARNt A primete un nou aaARNt conform codonului urmtor

Alungirea lanului polipeptidic

2: polipeptidul este adugat aa din situl A i subunitatea mare se mic => E ARNt fr aa/pp P noul polipeptid A - gol

Alungirea lanului polipeptidic

3: subunitatea mic se mic => E gol P noul polipeptid A gol, n dreptul urmtorului codon de pe ARNm

Alungirea lanului polipeptidic

ciclul se reia cu legarea urmtorului aa-ARNt n situl A

Alungirea lanului polipeptidic

Factori de elongare cu activitate de GTP-aze sporesc rata sintezei i asigur direcionalitate:

EF-Tu (legat de aa-ARNt ce ocup situl A) EF-G (ocup situl A dup micarea subunitii mari)

Terminarea sintezei lanului polipeptidic

n situsul A ajunge un codon stop al ARNm Acesta dicteaz fixearea unui factor de eliberare (Realease Factor RF), de natur proteic

Terminarea sintezei lanului polipeptidic

Ca urmare, polipeptidul se desprinde de ARNt din situl P Factori de reciclare ribozomal contribuie la dezasamblarea subunitilor ribozomale i detaarea lor de ARNm

Ribozomii

Ribozomii

Eficiena sintezei proteice e mare: 2 aminoacizi / sec. pentru fiecare ribozom -> o proteina e sintetizat n cteva minute Mai muli ribozomi traduc simultan aceeai molecul de ARNm Rata de eroare la incorporarea de aa n polipeptid e mic: 1 la 10.000 aa Consumul de energie e mare: cel puin 4 legturi macroergice / aa incorporat

Ribozomii

Mecanisme de control al calitii sintezei proteice (structura primar)

Activitate proofreading a aa-ARNt sintetazelor Activitate de corectare a erorilor de recunoatere a aa-ARNt de ctre ribozom Asigurarea calitii moleculei de ARNm traduse: recunoaterea existenei modificrilor 5 (cap) i 3 (coad poli-A)

Sinteza proteinelor

n timpul traducerii, lanul polipeptidic trece printr-un canal hidrofil (de aprox. 10 nm 1.5 nm) din structura subunitii ribozomale mari Proteinele nu sunt pliate n acest tunel, ci dup ieirea din subunitatea ribozomal Plierea proteinelor poate ncepe chiar nainte de sfritul sintezei lor

Sinteza proteinelor

Unele anibiotice interfer cu sinteza proteinelor n ribozomii 70S:

Tetraciclina Streptomicina Cloramfenicolul Eritromicina Puromicina

Inhib legarea aa-ARNt n situsul A Inhib trecerea de la iniiere la elongare Inhib activitatea de peptidil transferaz Blocheaz reacia de translocare a subunitii mici Analog aa-ARNt, duce la clivarea prematur a polipeptidului n curs de formare

Maturarea proteinelor

Polipeptidele nouformate nu sunt nc funcionale Sunt necesare:

adoptarea unei structuri secundare corecte modificri covalente post-traducere (glicozilare, fosforilare, etc) asamblarea subunitilor roteinelor complexe

Plierea proteinelor

Primul pas pentru obinerea unei conformaii spaiale funcionale Secvena aminoacizilor e important:
aa polari (+, -, fr sarcin net) / nonpolari dicteaz structura secundar (a helix, b pliuri) dicteaz i viteza cu care structura secundar e format

Plierea proteinelor

Domeniile proteinelor se formeaz imediat dup ieirea din canalul subunitii ribozomale mari (modificare co-traducere)

Plierea proteinelor

Stare intermediar: globul topit (molten globule)

Plierea proteinelor

aperone (chaperones): clas de proteine ce contribuie la plierea corect a altor proteine

aperone

ase familii dintre care dou importante: hsp60 i hsp70 (Heat-shock proteins) Diferite n citosol fa de matricea mitocondrial n lumenul RER: BIP (Binding Immunoglobulin Protein) din familia hsp70 hsp70 ajut plierea iniial, co-traducere hsp60 acioneaz mai trziu

aperone

hsp70 3 domenii: ATP-az, domeniu de legare a substratului (aa hidrofobi sau neutri), i domeniu c-terminal cu rol de reglare a interaciunii cu substratul

aperone

hsp60 (aperonine) oligomer, dou subunit. heptamerice hsp60 (mitocondrii), TCP-1 (citosol)

Plierea proteinelor

Plierea corect a proteinelor este esenial pentru funcia acestora Proteinele pliate incorect pot agrega i se acumuleaz n celul Patologii date de pliere incorect: boala Creutzfeldt-Jacob, boala Alzheimer

Plierea proteinelor

Semnalul de pliere incorect: proteinele expun resturi hidrofobe pe suprafa Proteinele pliate incorect sunt degrdate prin proteoliz Aprox. 30% din proteinele nou formate, greit pliate, sunt degrdate Proteazomii: proteaze complexe ce distrug proteinele n citosol

Proteazomii

Distrug proteine citosolice i proteine din lumenul RE care au fost retrotranslocate Structur cilindric (20S) cu capac (19S)

Proteazomii

Activitate ATP-azic realizeaz proteoliza ntregului lan polipeptidic capacul recunoate proteinele marcate cu ubiquitin marcarea cu ubiquitin reprezint semnalul distrugerii unei proteine

Ubiquitina

Protein mic, 8,5 kDa Capt globular hidrofob, coad C-terminal cu care se leag de resturile lizin din structura polipeptidelor

Ubiquitina

Se ataaz covalent de alte proteine sub aciunea unui complex proteic numit ubquitin-ligaz E1: enzima de activare a ubiquitinei E2: enzime de conjugare a ubiquitinei Complexul E2-E3: ubquitin-ligaz

Ubiquitina

30 tipuri E2 sute de tipuri E3 Complexul E2-E3 recunoate diferite semne de degradare a proteinelor:
denaturare mpachetare greit aa anormali (aa oxidai, etc)

Discerne proteinele greit pliate de cele incomplet pliate (proteine imature)

Ubiquitina

Activarea ubiquitin ligazei se poate face prin:

fosforilare legarea unui ligand formarea unui complex proteic

Marcarea cu ubiquitin se realizeaz i pentru proteinele normale, dar cu durat scurt de via; poate fi un rspuns la decanarea unei ci de semnalizare intracelulare.