ANEXA I.

Compartimentul de genomic funcional

Aa cum a fost conceput pn la aceasta etap, nucleul de cercetare molecular din cadrul Platformei reprezint un centru interdisciplinar de cercetare fundamental n domeniul acizilor nucleici, genomicii funcionale cu aplicaii clinice i terapeutice. n cadrul compartimentului de genomic funcional au fost elaborate, prin mbinarea resurselor preexistente n Laboratorul de Imunologie i Genetic cu aparatura ultramodern necesar achiziionat n 2006 i 2007, dou circuite sens unic de biologie molecular, de manipulare a acizilor nucleici (ADN/ARN), conform normelor i cerinelor internaionale n vigoare. Aspectul esenial i primordial al necesitii circuitelor este evitarea contaminrii i a degradrii acizilor nucleici, fenomene de altfel curente i practic imposibil de evitat n absena unor condiii drastice de manipulare: - Un circuit nchis pentru manipularea ADN (circuit extracie-amplificare-electroforezlectur-conservare), n scopul evitrii contaminrii reaciilor PCR sau a probelor de ADN destinate coleciei. - Un circuit paralel pentru unica manipulare a ARN (circuit extracie-amplificareelectroforez-lectur -retrotranscriere---circuit ADN), n scopul consolidrii unei zone de laborator Rnase free lipsit de contaminani i de Rnazele omniprezente. O astfel de zon necesit practic aceleai echipamente ca cele ale circuitului ADN, ns de folosin rezervat doar manipulrilor ARN. Compartimentul de genomic funcional este situat n incinta Laboratorului de Imunologie i Genetic, aflndu-se sub responsabilitatea d-lui asistent universitar Lucian Negur. Compartimentul de genomic funcional este structurat n 4 zone distincte cu echipamente proprii, cu activiti separate dar interdependente (vezi anexa 1 Compartimentu de genomic funcional) : 1. Zona de stocare reactivi i preparare mix PCR 2. Zona de extracie / amplificare a) Zona de extracie b) Zona de cuantificare a acizilor nucleici c) Zona de definitivare a amestecului PCR d) Zona de amplificare 3. Zona de electroforez / hibridizare 4. Zona de secveniere / Real-Time PCR / Interpretare

Circuitul de biologie/medicin molecular este alctuit din 4 zone/sli distincte, independente i izolate, dup cum urmeaz :

ZONA 1 : STOCARE REACTIVI / PREPARARE MIX PCR

Sala nr.1 este cea de stocare la rece (-20C sau +4C) a reactivilor necesari amplificrilor PCR, n pri alicote : primeri enzime (polimeraze, proteinaze, DNaze, kinaze, fosfataze) soluii buffer (tampon) asociate enzimelor sruri de Mg, Na, K mixuri de nucleotide i nucleotide modificate ap nuclease-free

ATENIE ! N ACEAST SAL NU SE PSTREAZ I NU SE INTRODUC PROBE ADN !

Toi aceti reactivi sunt eantionai n alicote numerotate i etichetate, necesare fiecare uneia sau mai multor reacii, dup caz. Rezervele mari de reactivi fiind criostocate (-80C) n sala de frig, sala nr.1 va conine eantioanele tuturor reactivilor necesari pentru totalitatea proiectelor/utilizatorilor, timp de o sptmn. Zona de stocare are un dublu rol protector : A) Evitarea contaminrii reactivilor cu reziduuri ADN/ARN, contaminare ce ar anihila orice rezultat de amplificare PCR. n sala nr.1 nu va fi prezent nici o surs de ADN. Accesul n sal se face printr-o singur u frontal. Zona nu comunic direct cu slile de culturi celulare sau de primire probe. Accesul n zona nr. 1 va fi strict limitat, att ca numr de persoane, ct i ca frecven de intrri/ieiri. B) Evitarea degradrii reactivilor termosensibili (primeri, enzime) prin cicluri repetate de dezgheare/ngheare. Fiecare utilizator va dispune de propriile pri alicote ce vor fi supuse la un numr ct mai mic de variaii termice (maxim 10).

Din aceste motive, zona nr. 1 se va afla permanent sub responsabilitatea unei persoane competente n manipularea/supravegherea reactivilor. Responsabilul reactivi are urmtoarele sarcini :

- Recepionarea, direcionarea i stocarea reactivilor ; - Eantionarea i etichetarea tuturor stocurilor de reactivi ; - Realizarea unui flux permanent ntre camera de frig i camera reactivi ; - Verificarea i nnoirea sptmnal a prilor alicote. Responsabilul reactivi i persoanele delegate de acesta sunt singurii care efectueaz, n condiii de sterilitate maxim, operaiile de eantionare/alicotare. Un set de pipete automate va fi destinat exclusiv acestor operaii.

Zona nr.1 este o zon de protecie maxim, steril, nuclease-free. Accesul se face obligatoriu n halat + mnui. Stocarea se va face n dou combine frigider/freezer, una destinat reactivilor necesari amplificrilor ADN, cealalt pentru reactivii ARN (ReverseTranscription PCR). Primerii i enzimele vor fi stocate n sertare separate.

Totodat, zona nr.1 trebuie s fie accesibil tuturor utilizatorilor de amplificare PCR, n scopul pregtirii amestecurilor de reacie, EXCLUSIV ADN. Cu acordul responsabilului reactivi, fiecare utilizator i va pregti probele de amplificare la o mas de lucru steril nuclease-free. Sunt necesare dou astfel de mese de lucru, fiecreia fiindu-i atribuit un set distinct de pipete automate. Astfel n zona nr.1 pot avea acces simultan maximum 2 utilizatori.

Echipamente necesare n zona nr.1 : Combin frigider / freezer X 2 Mas lucru biologie molecular X 2 Centrifug de mas cu rcire X 2 Agitator vortex X 2 Baie de ap de mas cu agitare Baie uscat cu agitare Set pipete automate X 3 Alte ustensile comune de laborator (sticlrie....) Etajere, dulapuri...

ZONA 2 : EXTRACIE / AMPLIFICARE

Zona nr.2, nvecinat cu sala reactivilor, este sala n care probele sunt primite, procesate i amplificate. n aceast sal sosesc, n scopul extraciei ADN/ARN : probele de snge periferic, din exteriorul laboratorului probele celulare/tisulare din camera de culturi celulare sau din camera de criostocare amestecuri de amplificare provenite din zona nr.1 geluri electroforez din zona nr.3, n scopul purificrii ADN din gel.

ATENIE ! COMUNICAREA ZONEI NR.2 CU SALA REACTIVILOR (1) SE FACE OBLIGATORIU NTR-UN SINGUR SENS, DE LA 1 SPRE 2 I NICIODAT INVERS. Astfel, reactivii din 1 pot ajunge n 2, dar nici un reziduu ADN nu se va ntoarce n sala reactivilor. Comunicarea ntre zonele 2 i 3 se face n ambele sensuri. Zona nr. 2 este format din 4 poziii distincte, putnd primi simultan maxim 5 utilizatori : a) Zona de extracie separat la mijloc n 2 pri pentru extracia ADN i ARN. Cele dou operaii necesit obligatoriu seturi de pipete i consumabile distincte, jumtatea ARN fiind RN-ase free. Extracia acizilor nucleici presupune existena proxim a urmtoarelor aparate : - Mas lucru biologie molecular / Hot laminar - centrifug cu rcire i adaptatori pentru tuburi 0,5-50 ml - agitator vortex - Baie de ap de mas cu agitare - Baie uscat cu agitare - Set pipete automate X 2 - Alte ustensile comune de laborator (sticlrie....)

Probele destinate extraciei ajung direct n zona de extracie i nu intr n contact cu celelalte zone ale slii nr.2. Un responsabil de extracii vegheaz la buna desfurare a manipulrilor, la accesul utilizatorilor n zone i la respectarea independenei ADN/ARN. Reactivii necesari extraciilor (pstrai la temperatura camerei) sunt depozitai n dulapuri i etajere murale separate n regiuni individuale. Soluiile-stoc se afl n partea superioar a dulapurilor, accesul la acestea fiind rezervat responsabilului de zon. Ceilali reactivi (pstrai la rece) se gsesc n zona (c). Consumabilele necesare sunt pstrate n ambalaje sterile i nu

pot fi deschise dect sub hot laminar. n zona extracie pot lucra simultan 2 utilizatori (1 ADN i 1 ARN). Accesul la zon se face cu ajutorul unui caiet de programri, gestionat de responsabilul de zon. Dup cuantificare (b), acizii nucleici vor fi eantionai i etichetai corespunztor, n funcie de destinaia lor : - spre zona de amplificare - spre spaiul de stocare pe termen scurt-mediu (zona c) - spre spaiul de stocare pe termen lung (camera de frig)

b) Zona de cuantificare a acizilor nucleici, format din spectrofotometru + computer. Dup extracie, cantitatea acizilor nucleici este determinat spectrofotometric folosind diluii corespunztoare provenite din zona de extracie. Aceste diluii nu se ntorc n zona de extracie. Accesul este liber, sub supravegherea responsabilului de extracie. Alternativ, cuantificarea poate fi realizat prin estimare de intensitate de band n gel, la nivelul slii de electroforez (3).

c) Zona de definitivare a amestecului PCR, n care sosesc mixurile de amplificare din sala de reactivi (aceste mixuri nu intersecteaz zona de extracie (a)). n aceast zon exist frigidere + freezere n care sunt stocai la rece reactivi de extracie (alcooli, tampoane, etc), precum i eantioanele ADN pstrate pe termen scurt-mediu. Este necesar o mas de lucru pentru adugarea ADN n mixurile PCR. Accesorii necesare n zona (c) : Combin frigider / freezer X 2 Mas lucru biologie molecular Centrifug de mas cu rcire Agitator vortex Baie de ap de mas cu agitare Baie uscat cu agitare Set pipete automate Alte ustensile comune de laborator (sticlrie....)

Dup definitivarea mixurilor i distribuirea acestora n tuburi/plci PCR, se trece n zona de amplificare propriu-zis (d). Concomitent, n zona (c) se ntorc anumii produi de amplificare n vederea purificrii. Este vorba de acele produse destinate secvenierii (sau hibridizrilor moleculare).

Purificarea intr n sarcina responsabilului de secveniere. n zona (c) nu pot avea loc simultan pregtirea mixului i purificarea produilor de amplificare.

d) Zona de amplificare, format din 3 termocyclere de performan, dintre care unul conectat la computer. Accesul i programarea aparatelor se realizeaz doar cu acordul i sub supravegherea responsabilului specialist PCR. Cele 3 aparate pot funciona simultan cu acordul responsabilului PCR. Accesul se face pe baza unui caiet de programri. Produii de amplificare sunt dirijai spre zona 3 pentru vizualizare n gel de electroforez sau se pot ntoarce n zona (c) pentru purificare. Alternativ, amplificarea se poate realiza n timp real n zona 4 (unde este situat aparatul de Real-Time PCR). Atenie ! tuburile destinate zonei 4 prsesc zona 2 NCHISE !!!

ZONA 3 : ELECTROFOREZ / HIBRIDIZARE

n aceast zon, produii de amplificare pot fi vizualizai prin electroforez n gel, operaie ce permite simultan vizualizarea, cuantificarea i, uneori, diagnosticarea ADN. Responsabilul de electroforez are n grij buna desfurare i independena migrrilor verticale / orizontale, n geluri de agaroz / acrilamid. n zona 3 pot lucra concomitent 7 utilizatori. Pentru electroforez sunt necesare : Reactivi pentru geluri, depozitai la rece (frigider) sau n dulapuri i etajere murale Surse curent X 4 Accesorii electroforez orizontal (set complet X 2) Accesorii electroforez vertical (set complet X 2) Transiluminator UV GelDoc X 2 + computere

n paralel, aceeai zon 3 este accesibil experimentelor de hibridizare / blotting. Diversitatea acestor tehnici i a aplicaiilor lor nu face necesar prezena unui responsabil de hibridizare ; fiecare utilizator va fi responsabil de propriul experiment. Probele necesare hibridizrii provin din zona 2c, unde a fost realizat purificarea produilor de amplificare. Zona 3 va reprezenta de asemenea spaiul de arhivare a documentaiei de electroforez. De aceea, necesitatea exploatrii maximale a spaiului mural, prin dulapuri/etajere.

ZONA 4 : SECVENIERE / REAL-TIME PCR / INTERPRETARE

n zona 4, reactivii sau probele trebuie s ptrund NCHISE. n acest spaiu nu exist mese de lucru cu reactivi, ci doar aparatur de nalt performan : secveniator ADN, aparat de PCR n timp real, computerele asociate acestora, precum i alte computere de analiz i stocare a informaiilor. Zona 4 reprezint punctul de ntlnire al circuitului ADN cu alte circuite de acelai tip. Responsabilul de zon este specialist n secveniere i Real-Time (poate fi vorba de dou persoane sau de una singur). Accesul n zon se face cu acceptul responsabilului i sub ndrumarea acestuia, dup un caiet de programri. Spaiul mural este exploatat la maxim cu dulapuri / etajere necesare depozitrii accesoriilor de secveniere/realtime i arhivrii informaiilor. Zona 4 nu este obligatoriu steril. n zona 4 pot avea acces simultan 2 persoane n afara responsabilului.

Exemple de activitate n cadrul compartimentului de genomic funcional :

Sistemul de analiz genic Beckman Coulter CEQ8000, folosit pentru secveniere genic i analiz de fragmente ADN prin electroforez capilar

Exemplu de secveniere ADN folosind sistemul de analiz genic Beckman Coulter CEQ8000

Exemplu de analiz de fragmente ADN folosind sistemul de analiz genic Beckman Coulter CEQ8000

Sistemul de amplificare PCR n timp real Corbett Resarch Rotor Gene 6000, folosit pentru amplificarea cantitativ a acizilor nucleici

Exemplu de cuantificare a expresiei genice Real-Time folosind Sistemul de amplificare PCR n timp real Corbett Resarch Rotor Gene 6000