Separarea ADN-ului prin electroforez Electroforeza n geluri de agaroz reprezint metoda standard de analiz a acizilor nucleici.

Deplasarea moleculelor se face n prezena unui curent electric (acizii nucleici sunt ncrcai negativ datorit prezenei gruprilor fosfat i migreaz spre electrodul ncrcat pozitiv). Mobilitatea electroforetic este influenat de urmtorii factori: concentraia de agaroz, conformaia moleculei de ADN (monocatenar, bicatenar sau superrsucit), prezena compusului fluorescent n gel, tamponul utilizat, tipul de agaroz i voltajul aplicat.

Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeza orizontal (de tip submarin)

Tehnica se folosete pentru determinarea puritii ADN-ului sau ARN-ului, la verificarea existenei produilor rezultai n urma PCR-ului (reacie de polimerizare a nucleotidelor) sau la analiza fragmentelor rezultate dup clivarea enzimatic (cu ajutorul enzimelor de restricie) a ADN-ului. Fragmentele analizate pot avea mrimi ntre 1000 i 23000 pb (pb perechi de baze). Unul dintre avantajele acestei tehnici este acela c ADN-ul nu este denaturat, pstrndu-i intact elementele structurale. Pentru a evita fragmentarea ulterioar a ADN-ului manipularea trebuie fcut n aa fel nct s se evite contaminarea cu amprente, picturi, saliv sau microorganisme. Din acest motiv se prefer utilizarea de materiale sterile (vrfuri etc.). Cele mai folosite sisteme tampon (pH 8) pentru electroforeza n geluri de agaroz sunt: TAE (Tris-acetat 40 mM, EDTA 1 mM), TBE (Tris borat 45 mM, 1 mM EDTA), TPE (Tris-fosfat 90 mM, EDTA 2 mM). Soluiile tampon pentru electroforez se pstreaz sub forma unor stocuri concentrate (10X-50X) i pstrate la temperatura camerei. Tamponul de ncrcare are n componen un colorant (albastru de bromfenol sau rou de crezol 0,25%) care permite vizualizarea frontului de migrare i zaharoz (40%) sau glicerin (30%) pentru a asigura o vscozitate corespunztoare la aplicarea probei. Benzile sunt vizualizate cu compui fluoresceni (bromura de etidiu sau SYBR Green) prin iradiere cu lumin UV. Sensibilitatea variaz ntre 100 pg i 1

ng/band. Datorit faptului c aceti colorani se intercaleaz ntre bazele ADNului dublu catenar, sensibilitatea deteciei depinde de lungimea lanului acizilor nucleici. ntrebri: 1. Electroforeza este: a) procesul de separare a fragmentelor ADN; b) procesul de adugare de noi nucleotide la ADN cu ajutorul cmpului electric; c) procesul de replicare al fragmentelor de ADN n cmp electric; d) nici un rspuns. 2. Ce se ntmpl cu lanurile de ADN de aceeai lungime: a) se deplaseaz cu aceeai vitez i se plaseaz n zone diferite; b) se deplaseaz cu aceeai vitez i se grupeaz n aceeai zon; c) se deplaseaz cu viteze diferite i se grupeaz n aceeai zon; d) nu se deplaseaz. 3. Ce compus este utilizat pentru developarea gelurilor n care se separ fragmentele de ADN? a) agaroz; b) poliacrilamid; c) glicerin; d) bromura de etidiu. 4. Electroforeza poate fi aplicat pentru separarea: a) lipidelor; b) proteinelor; c) zaharurilor; d) acizilor nucleici. 5. Din ce motive se utilizeaz albastru de bromfenol la electroforeza acizilor nucleici? 6. Un fragment de ADN liniar a fost tiat cu o enzim de restricie. innd cont de faptul c ADN-ul are dou situsuri de legare susceptibile la clivarea cu aceast enzim, identificai numrul de fragmente separate prin electroforez dup clivare.