Transpozoni

Elemente genetice
mobile,care dovedesc
PLASTICITATEA
genomului
TRANSPOZITIA
SCHIMBAREA LOCALIZARII UNEI SECVENTE DE
ADN dublu catenar IN GENOM


ARE LOC o recombinarea genetica DESI NU SE
PRODUCE UN SCHIMB DE MATERIAL GENETIC

1948 BARBARA McCLINTOCK descoperea genele
saritoare investigand porumbul
1983 este rasplatita cu Premiul Nobel
Exista transpozoni ADN, dar si ARN
Ce urmeaza:
http://www.nature.com/nrg/journal/v12/n9/fig_tab/nrg3030_ft.html
Initial Barbara Mc Clintock observa rupturi frecvente la nivelul unui cz. (respectiv 9),
rupturi care se asociaza cu modificarea culorii bobului la porumb (Zea mays).
Ea numeste gena implicata in modificarea culorii disociator (Ds).
Ds produce mutatii instabile sarind
in diverse pozitii pe cz.
Prin insertia transpozonului Ds gena
de la nivelul locusului C este
inactivata. Gena C fiind
implicata in producerea culorii
bobului acesta devine alb.
Dar mutatia este reversibila, caci
transpozonul va sari iarasi,
astfel ca gena pentru pigmentul
bobului va fi din nou activa.
INTRODUCERE
De asemenea B. Mc Clintock a descoperit gena Ac (Activator), care controlea-
za transpozitia genei Ds, ceea ce are ca urmare ruperea cromozomului.
Gena Ac poate sari
datorita prezentei unei
enzime (transpozaza).

Gena Ds poate sari
doar in prezenta
genei Ac, caci Ds
nu are transpozaza.

Marimea petelor de culoare
este determinata de
momentul transpozitiei in
decursul dezvoltarii plantei.

C este gena normala
c-m este gena mutanta
Transpozitia genei Ds in diferite celule este intamplatoare,
de unde aparitia mozaicului coloristic.


1. Prima dovada a controlului unei gene
asupra alteia (fiind baza conceptului de
reglare genica).
2. Prima dovada si definire a elementelor
genetice mobile.
3. Dovada teoriei cz. demonstrand ruperea
cromozomilor si fuziunea fragmentelor.
4. Dezvoltarea celor mai bune tehnici de
studiere a cz. la plante.



Barbara Mc Clintock a fost premiata la varsta de 81 ani, datorita contributiei
deosebite si anume:
Un citat din spusele laureatei Nobel
Over the years I have found that it is difficult if not impossible to bring
to consciousness of another person the nature of his tacit assumptions
when, by some special experiences, I have been made aware of them.
This became painfully evident to me in my attempts during the 1950s
to convince geneticists that the action of genes had to be and was
controlled. It is now equally painful to recognize the fixity of
assumptions that many persons hold on the nature of controlling
elements in maize and the manners of their operation. One must
await the right time for conceptual change. (1973)
Transpozon (Tn) - sinonime
ELEMENTUL GENETIC MOBIL produce o ruptura
cromozomiala la nivelul unui situs de insertie, ceea
ce determina mutarea locusului genei saritoare
(jumping gene) = TRANSPOZITIE

ELEMENTUL TRANSPOZABIL nu apare niciodata in
forma libera, individualizat, in genom sau in celula
in general.


Genom dinamic
Adica un genom sigur nu este:
- nici fix
- nici imuabil
http://www.nature.com/nmeth/journal/v2/n10/fig_tab/nmeth1005-735_F1.html
Exoni albastru

IR gri

Promotor rosu

Gena reglatoare
mov

SD, SA donor si
acceptor de splicing

a) Insertie
b) Deletie si insertie
c) Expresie genica
anormala





IR = repetitii terminale
inversate (in oglinda)
Transpozonii pot fi o sursa majora de
modificari evolutive in genom
Rearanjamentele creeaza secvente noi si schimba functia secventei
initale/tinta
Uneori pot aparea maladii ca urmare a insertiei intr-o gena
functionala, efectul fiind asemanator mutatiilor

La om elementele transpozabile sunt de 2 tipuri: transpozoni si
retrotranspozoni (predomina in genomul uman)
Al treilea mecanism/tip il reprezinta secventele de inserat, care se
intalnesc numai la procariote.
Integrarea segmentelor IS (inserted sequence)
in ADNul cromozomial
I . SECVENTE DE INSERAT
Secventa de inserat (IS) este flancata de 9
13 pb = repetitii terminale inversate

Repetitiile directe si inverse/inversate (IR)
indica prezenta elementelor genetice mobile
la nivelul genomului.

Transpozaza
Secventa de inserat contine:
- o regiune unica codanta pt. enzima
transpozaza si/sau
- o zona centrala ce poate fi utilizata ca
marker genetic, de ex. gena pt. rezistenta la
antibiotice
II. TRANSPOZONII (Tn) comporta 2 tipuri
de transpozitii: replicativa (1) si non replicativa (2)
1. Tn original ramane la locul sau, se copiaza, iar copia
este inserata la alt nivel creste nr.de copii ale
Tn in genom;
Mecanism:
copy - paste
1. Transpozitie replicativa (~Copy-
and-paste)
Elementul transpozabil este copiat; copia se
insera in segmentul cromozomial tinta.
Element
trans-
pozabil
Segm.tinta
Recipient Donor
Integrare
Replicare
2. Transpozitia conservativa
(non-replicativa)
Mecanism: cut and paste
Tn insusi ca entitate fizica se muta direct pe alt
situs
Transpozaza (se leaga de capetele transpozonului original, le
sectioneaza lasand in urma capete coezive, sticky ends - si
alipeste Tn in alt loc al genomului)
ADN polimeraza umple golurile dintre capetele in zig-zag
(staggered) ale ADN-ului tinta, iar
ADN ligaza inchide scheletul glucidofosforic (dupa unii autori,
iar mai nou s-au evidentiat enzime din grupa recombinazelor de
tip rezolvaza/invertaza si integraza)
Tn5 si Tn10 (ale E.coli) se excizeaza din
cromozom, se deplaseaza, apoi se re-integreaza.
Totul cu ajutorul actiunii transpozazei.
Complexul transpozon + transpozaza necesita cationi de Mg pentru a se re-
insera . Daca Mg
+
lipseste in mediu (de cultura), ia nastere o structura stabila
numita transpozom; acesta se va insera aleator in genomul gazda daca este
introdus in celule prin electroporare.
TRANSPOZOM
In ADN-ul tinta au loc
rupturi in zig-zag.
Polimeraza umple
golurile, astfel luand
nastere segmentele
repetitive ce
flancheaza
transpozonul.
Transpozaza
Se leaga:
- Specific de un situs
- Oriunde in ADN
Secventele repetitive
scurte directe si inverse
sunt importante in
excizia transpozonilor de
catre transpozaza, dar si
pt ADN polimeraza
2. Transpozitia conservativa (~Cut-
and-paste)
Elementul se muta prin excizie si integrare.
Element transpozabil
Segment
tinta
Recipient Donor
Excisie & Integrare
III. Retrotranspozonii
Retrotranspozitia apare cel mai frecvent
la om
1. ADN-ul elementului mobil este transcris in RNA.
2. ARN-ul este revers-transcris in ADNc (complementar), care
este apoi inserat in segmentul cromozomial acceptor.
Target
Donor
Integrare
Transcriere
RNA
ADNc
Revers transcriere
Exista 3 clase importante de retrotranspozoni la
mamifere:
Retrovirusurile endogene au secvente asemanatoare retrovirusurilor, dar nu
pot infecta celule noi avand actiune limitata la un singur genom; au revers-
transcriptaza si LTR (long terminal repeats)
Retrotranspozonii nevirali (sau Tn ADN fosili), fara 3LTR au revers-
transcriptaza fiind capabili de transpozitie independenta
Retro-pseudogenele = pseudeogene procesate; sunt de 2 tipuri:
- cu nr.redus de copii (LINE
s
:L1, L2, L3 ) respectiv aprox. 850.000 copii

- cu nr. inalt de copii (aprox. 1,7 milioane copii): SINE
s;
Ex. fam. Alu (1,5 mil.
copii)

L-1 LINEs (long-interspersed sequences):
elemente lungi de spatiere sau elemente
nucleare dispersate lungi
Elemente de 6,5 kb, repetate de 50.000-100.000
de ori (~21% din genom).
SINEs (short-interspersed sequences)
elemente nucleare dispersate
scurte
< 500 pb, repetate de peste 1.500.000 de ori
dispersate in intregul genom, in medie o copie
la 3000pb; reprezinta 10% -13% din genomul
uman

Alu = 300pb; reprezinta 5% din genomul uman

Enzima de restrictie al carei
nume il poarta provine de la
Arthrobacter luteus

Retrotranspozonii sau retropozonii:
elemente transpozabile a caror mobilitate este
ARN-mediata
Little Alberts 6-34
Garland
Reverse transcriptase
encoded by the LINE-1 element
Activitatea L1 presupune:
- ARN polimeraza transcrie ADN in ARN
- Endonucleaza taie ADNul tinta
- Revers-transcriptaza copiaza L1 ARN in
L1 ADN, care este inserat

Astfel creste numarul elementelor L1
in genom; acestea sunt uneori mai
scurte decat L1 initiale (au deletii)
Datorita diversitatii lor la nivelul genomului uman LINE
s
sunt folosite in analize
moleculare (DNA fingerprint) ca markeri.
L-1 LINEs
Contin gene cu valoare functionala cum sunt
cele ce codifica polimeraza (pol) si transcriptaza;
Migreaza in genom prin intermediul ARN
Nu contin structuri de control (promotori) si de
aceea nu se exprima (sunt pseudogene).

Unele cazuri de hemofilie A au aparut prin
insertia unui element L1 in gena pentru factorul
de coagulare VIII.



Cromozomi hibridizati cu probe pt secvente Alu (verzui); oarece
corespondenta cu benzile R

Elemetele Alu constau dintr-o secventa de 260 perechi de baze (in medie)
si contin o secventa pe care o recunoaste enzima de restrictie AluI
respectiv:
SINE
s

Nu codifica transcriptaza si depind de prezenta unui element activ (L1).
Densitatea elementelor repetitive variaza in
diferite regiuni genomice

Elementele LINEs se acumuleaza in regiuni
bogate in AT
Elementele Alu se acumuleaza in regiuni
bogate in GC; de asemenea in intronii genelor putand fi
recunoscute de spliceozom si pastrate in ARNm matur. Astfel apare
matisarea alternativa
RetroTn nu sunt activi la om. S-au identificat mai
multe mecanisme de inhibare a retrotranspozitiei
printre care si unele epigenetice precum compactarea
cromatinei si metilarea ADNului.


Sunt componente normale si ubicuitare ale genomului procariot si eucariot.

Procariote-transpozitie de la/catre cromozomul celulei, plasmidic, fagic.

Eucariote-transpozitie in cadrul aceluiasi cromozom sau pe un altul.

Produc modificari genomice; prin amplificarea si dispersia lor, prin
rearanjamentele induse de excizie/insertie au o contributie importanta in
evolutia genomului speciilor.

Determina rearanjamente cromozomiale (deletii, insertii,
duplicatii, translocatii).
Cresc dimensiunea genomului (in special la plante),
Deseori creste nr. de copii ale elementului mobil in genom.
Genele sau secventele genice se muta in alte regiuni ale
genomului avand urmari cu efecte fenotipice;
Se creeaza pseudogene.
TRANSPOZONII
= elemente genetice mobile ale cromozomilor, deoarece au capacitatea de
a-si modifica pozitia in genom.
Concluzii:
+/- efecte in urma transpozitiei
Alterari la nivel genic
Inactivarea genelor prin insertii;
Crearea unor secvente noi in cadrul genelor care pot
determina modificarea functiei .
Alterarea secventelor reglatoare modificari de
expresie genica
Crearea de noi introni;
Asamblarea de noi gene prin componentele purtate
de un element mobil.

Agenti mutageni biologici: modifica structura/
expresia genelor
Efectele elementelor mobile
asupra evolutiei genomului
In decursul evolutiei elementele mobile (initial doar cele in galben) s-au replicat,
pentru ca in final sa intre si in secventele informationale.
http://www.nature.com/nrg/journal/v12/n9/fig_tab/nrg3030_ft.html
Transpozitia
poate avea
loc oricand in
timpul
evolutiei unui
organism
Concluzii actuale
Datorita prevalentei lor in orice tip de genom, transpozonii sunt
un subiect mult discutat, totusi inca nu in totalitate elucidat.
Inca nici macar nu este clar, daca ar trebui considerati o parte
integranta a unui genom specific unei specii sau paraziti de
succes!
Precum un virus se deplaseaza de la un individ la altul, poate si
transpozonii se pot muta de la un anumit genom la altul (de la
un individ la altul) si nu numai in interiorul genomului unui
individ dintr-o anumita specie?
Datorita importantelor efecte la nivel genic si fenotipic,
secventele transpozabile sunt intens cercetate fiind o posibila
cale de aplicare a terapiei genice, exemplu :the sleeping
beauty
Sistemul transpozon Sleeping Beauty
este un transpozon ADN sintetic (artificial), construit pentru a
introduce secvente de ADN precis definite in cromozomii
vertebratelor, cu scopul de a determina noi caractere si a descoperi
noi gene (oncogene) si functiile lor.
este compus din transpozaza Sleeping Beauty (SB) si
transpozonul ADN construit in 1997 pentru a se insera dupa modelul
cut-and-paste
a fost desemnat ca Molecula anului 2009 de catre International
Society for Molecular and Cell Biology and Biotechnology Protocols
and Researches
comparativ cu vectorii virali folositi in terapia genica, costurile de
productie si utilizare sunt mai reduse. Primele studii clinice sunt in
curs si vizeaza tumori maligne (limfoame cu celule B)
Lectura recomandata: Sleeping Beauty transposon-based system for
cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced
pluripotent stem cells
http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2012/12/25/nar.gks1305.full