MODIFICAREA „IN VIVO”

A INFORMAŢIEI
GENETICE
Contrar unor afirmaţii conform cărora ingineria genetică ar fi “artificială”, permiţând
modificarea naturii după bunul plac al omului, există numeroase dovezi referitoare la
faptul că natura, ea însăşi, realizează “experimente” de modificare a patrimoniului
genetic al speciilor. Pot fi menţionate mai multe exemple, cum ar fi: transferul
interregn al unor gene (Agrobacterium - plante dicotiledonate) care duce la
integrarea de gene bacteriene în genomul plantelor; transferul interspecific şi
intergeneric al genelor de rezistenţă la antibiotice care conduce la fenomenul de
rezistenţă multiplă a bacteriilor; transferul de gene prin intermediul virusurilor
(transducţia genetică) etc.
Intr-un anumit sens, omul perfecţionează şi adaptează conform intereselor sale ceea
ce natura a realizat în cursul evoluţiei.
Modificarea naturală a informaţiei genetice a oricărui tip de organism este posibilă
prin mutageneză şi prin recombinare genetică.
 Acizii nucleici
ADN şi ARN sunt molecule complexe, polinucleotidice, formate prin unirea unui număr mare
de unităţi monomere, numite nucleotide. O nucleotidă reprezintă unitatea structurală
fundamentală a acizilor nucleici, fiind alcătuită din trei componente:
• o bază azotată purinică sau pirimidinică
• o moleculă de pentoză, riboză, pentru ARN şi dezoxiriboză pentru ADN
• un rest de fosfat anorganic.
Structura primară a acizilor nucleici se referă la succesiunea celor patru deoxinucleotide
specifice care intră în alcătuirea lui şi stabilesc legături fosfodiesterice covalente 3'-5'.
Aceste legături se stabilesc între gruparea OH din poziţia 3' a moleculei de deoxiriboză a
unei nucleotide şi gruparea OH din poziţia 5' a deoxiribozei din nucleotida adiacentă, prin
intermediul grupării fosfat. În felul acesta, se formează monocatene liniare cu o
extremitate 3'-OH şi una 5'-fosforilată. Această particularitate implică existenţa unei
polarităţi a catenei polinucleotidice. Prezenţa legăturilor fosfodiesterice internucleotidice
conferă catenei un grad important de flexibilitate care permite realizarea structurilor
secundare şi terţiare ale moleculelor, cu semnificaţie funcţională.
Structura secundară a ADN rezultă din asamblarea coaxială a două
catene polinucleotidice prin înfăşurarea lor, una în jurul celeilalte şi cu
orientare spre dreapta. Elaborarea modelului structurii secundare a
ADN de către James Watson şi Francis Crick (1953) este considerat ca
unul dintre cele mai importante evenimente care au stat la baza
evoluţiei biologiei moleculare. Modelul de structură propus de Watson
şi Crick a permis înţelegerea mecanismelor esenţiale care asigură
transmiterea corectă a informaţiei genetice. Cercetările realizate de
Watson și Crick la Cavendish Laboratory din Cambridge s-au desfășurat
aproape simultan cu cele ale lui Rosalind Franklin și Maurice Wilkins la
Kings College London, ele având drept scop clarificarea structurii ADN.
În conformitate cu modelul dublu helical al moleculei de ADN, această
structură are la bază două caracteristici sau principii fundamentale:
principiul complementarităţii şi cel al antiparalelismului.
Particularităţile moleculelor de acizi nucleici, a ADN în special, pot fi determinate prin
utilizarea unor tehnici variate: microscopie electronică, ultracentrifugare, electroforeză,
tehnici biochimice, spectrofotometrie etc, aplicarea acestora depinzând de scopul
cercetărilor.
Structura genelor la procariote și eucariote diferă.
La procariote secvențele de nucleotide din genă se regăsesc în moleculele de ARN care au
copiat informația genetică. Funcționarea genelor este controlată atât de gene reglatoare
cât și de elemente reglatoare: promotor – localizat la extremitatea 5’ a genei și regiunea de
terminare, localizată la extremitatea 3’ a genei.
La eucariote structura genelor este mult mai complexă, ele conținând atât
secvențe informaționale (exoni) cât și secvențe noninformaționale (introni).
 Organizarea materialului genetic
Sistemele biologice cuprind două tipuri fundamentale de organizare: acelulară şi
celulară.
• Organizarea acelulară se întâlnește la virusuri, viroizi și prioni
• Organizarea celulară cuprinde două categorii divergente de organizare, cea
procariotă (bacterii – cromozom și elemente genetice extracromozomale) şi cea
eucariotă (unul sau mai mulți cromozomi + genomul mitocondrial sau genomul
cloroplastic).
• La bacterii, la nivelul cromosomului se găsesc genele implicate în procesele esenţiale
supravieţuirii, ele fiind grupate în operoni. In afară de informaţia genetică esenţială
conţinută de cromosom, bacteriile pot prezenta şi o informaţie genetică
suplimentară care poate conferi avantaje selective majore în condiţii modificate de
mediu. Majoritatea genelor ce codifică o asemenea informaţie genetică sunt
localizate pe plasmide sau pe elemente de tipul transpozonilor sau al secvențelor de
inserție.
Funcțiile materialului genetic
Replicarea – sinteza unor noi catene de ADN pe modelul unei catene
vechi (modelul semiconservativ)
Transcrierea – copierea mesajului genetic din ADN de către moleculele
de ARN (ARNm, ARNr, ARNt etc)
Traducerea – covertirea informației genetice reprezentate de
succesiunea de nucleotide la catene polipeptidice (succesiune de
aminoacizi)
 Mutațiile și mutageneza
• Structura materialului genetic poate fi modificată în mai multe moduri
consecinţele fiind, de obicei, apariţia unor fenotipuri diferite de celulele
normale. Structura, proprietăţile fizice sau biologice ale proteinelor se
datorează succesiunii de aminoacizi, astfel că orice schimbare a acesteia,
datorata unor modificări ale genelor codificatoare, conduce la noi proprietăţi
ale proteinelor în cauză. Modificările la nivelul genelor se pot produce
spontan sau pot fi induse de o serie de factori mutageni (fizici, chimici sau
biologici).
• După mărimea segmentului de ADN afectat mutaţiile pot fi genice şi
cromosomale. Mutaţiile genice pot avea loc la nivelul oricărei gene,
determinând afectarea unei singure nucleotide (mutaţii punctiforme) sau a
unui grup de nucleotide. Mutaţiile cromosomale determină modificări ale
structurii şi numărului cromosomilor de la eucariote., cu efecte fenotipice
evidente.
Modificările spontane ale ADN ce determină apariţia unei mutaţii pot
implica un număr variat de perechi de nucleotide: de la o singură
pereche (mutaţii punctiforme) la sute de perechi de nucleotide (mutaţii
genice sau cromosomale). La rândul lor, mutaţiile punctiforme pot fi
datorate substituirii unei perechi de nucleotide de către alta (mutaţii
prin substituţie), eliminării (deleţiei), inserării unei noi perechi de
nucleotide (adiţie), inversării unei anumite secvenţe de nucleotide
(inversii) sau duplicaţiilor.
Schimbarea succesiunii normale a nucleotidelor prin substituție conduce la
greşeli de împerechere în cursul proceselor de replicare, recombinare sau
reparare. Consecinţa modificărilor ce apar în succesiunea normală a
nucleotidelor din structura ADN poate fi modificarea cadrului de citire al
mesajului genetic şi, prin urmare, a fenotipului determinat de acesta. Alteori
însă, datorită caracterului degenerat al codului genetic, mutaţia rămâne fără
consecinţe fenotipice, fiind considerată „mutaţie tăcută” („silent mutation”).
In cazul mutațiilor prin deleție consecințele sunt mai numeroase:
 prin eliminarea unei părţi a unei gene sau a genei în întregime are loc inactivarea
completă a produsului codificat de aceasta;
 determină uneori fuziunea unei gene cu o alta, astfel că amândouă ajung să fie
controlate simultan;
 determină modificarea cadrului de citire a mesajului genetic (fiind astfel mutaţii de
tip „frameshift”), iar modificările fenotipice sunt evidente;
 ele nu permit apariţia de mutaţii de reversie, cu excepţia cazurilor în care are loc
inserarea corectă a secvenţei lipsă.
Mutaţiile prin adiţie sau inserţie sunt cauzate de inserarea unei
nucleotide sau a unei secvenţe de nucleotide la nivelul unei anumite
regiuni a ADN. De cele mai multe ori, asemenea mutaţii se datorează
integrării elementelor genetice transpozabile: transpozonilor (Tn) sau
secvenţelor de inserţie (IS). Integrarea unei anumite secvenţe de
nucleotide într-o genă determină, de obicei, inactivarea acesteia, prin
modificarea cadrului de citire. Mutaţiile de acest tip, produse de Tn sau
IS, pot suferi reversii la tipul normal, deoarece eliminarea secvenţelor
integrate se realizează în mod corect.
Mutaţiile prin duplicaţie reprezintă o categorie specială de mutaţii
datorate copierii unei anumite secvenţe din ADN şi integrarea sa în
continuarea celei iniţiale (în tandem). De cele mai multe ori, regiunile
duplicate sunt alcătuite din copii multiple ale aceleiaşi secvenţe, având
astfel lungimi foarte mari.
 Transferul natural de gene și recombinarea genetică
Transferul de gene între organisme ce trăiesc în același mediu este cunoscut sub numele de
transfer orizontal de gene, el fiind descris mai ales în cazul organismelor unicelulare. Transferul
orizontal este diferit de transferul vertical care se referă la transmiterea informației genetice de la
părinți la descendenți. De exemplu, apariția și răspândirea rezistenței la antibiotice la bacterii
poate fi explicată printr-un asemenea mecanism. De asemenea, transferul orizontal de gene a
jucat un rol important în evoluția unor animale, așa cum sunt nematodele în genomul cărora au
fost identificate numeroase gene de origine microbiană sau vegetală care permit respectivelor
organisme să degradeze anumite tipuri de compuși polimerici naturali.
In urma unui studiu asupra genomurilor a 12 specii de musculițe de oțet, 4 specii de nematode și
10 specii de primate, inclusiv om și compararea genelor s-a evidențiat prezența unor gene care ar
fi provenit de la alte specii prin transfer orizontal. De exemplu, la om au fost confirmate 17 gene
de acest tip și au fost identificate alte 128 de gene străine asociate unor caractere variate așa cum
sunt: grupele sanguine (sistemul ABO) care ar fi provenit de la vertebrate prin transfer orizontal,
gene ce codifică enzime implicate în diferite procese metabolice (metabolismul lipidic), gene
implicate în realizarea răspunsului imun etc. Originea acestor gene este variată (bacteriană, fungică
sau virală), transferul realizându-se la specii ancestrale din care au provenit primatele. De ex. peste
50 de gene de la primate sunt de origine virală.
 Recombinarea genetică la eucariote
La eucariote recombinarea genetică este legată de fenomenul sexualităţii şi se
realizează în special în cursul meiozei, fiind condiţionată de realizarea contactelor
între cromosomi urmată de disjuncţia independentă a perechilor de cromosomi
(bivalenţi). In cazul organismelor eucariote au fost descrise trei tipuri de recombinare
genetică:
• recombinarea intracromosomală realizată prin crossing-over (schimb reciproc de segmente
cromosomale);
• recombinarea intercromosomală realizată prin disjuncţia independentă a cromosomilor omologi;
• recombinarea genetică nereciprocă, prin conversie genetică.
In afara acestor mecanisme „clasice” în ultima vreme s-a evidențiat implicarea unor
bacterii, transpozoni sau a unor virusuri în transferul de gene intra- și mai ales
interspecific. Exemple: genomul bacteriei Wolbachia integrat în genomul unor
nevertebrate
Wolbachia pătrunde în celulele gazdă iar ADN-ul său este incorporat în genomul gazdei (Drosophila) prin diferite
mecanisme
 Recombinarea genetică la procariote
• In cazul procariotelor au fost descrise mai multe modalităţi de transfer de
material genetic (transformare genetică, conjugare, sexducţie şi transducţie),
acestea putând fi asociate cu mecanisme ce asigură integrarea noii informaţii
genetice în genomul gazdei.
• Indiferent de natura sa, transferul de gene reprezintă o situaţie în care
moleculele informaţionale îşi schimbă gazda, având de traversat două bariere
celulare: una la ieşirea din celula donatoare şi cealaltă la intrarea în celula
receptoare. In cazul conjugării, aceste procese sunt corelate în timp ce, în cazul
transformării genetice şi al transferului de gene mediat de bacteriofagi, ieşirea
ADN din celula donatoare şi pătrunderea sa în noua gazdă sunt procese separate
în timp şi spaţiu.
Modalităţi de transfer de material genetic la bacterii
Menţinerea şi multiplicarea moleculelor de ADN recombinant este
condiţionată de pătrunderea lor într-o gazdă adecvată, în al cărei sistem
genetic să se integreze. Principala metodă utilizată pentru introducerea
moleculelor de ADN recombinant într-o celulă gazdă este transformarea
genetică.
Transformarea genetică reprezintă transferul de informaţie genetică,
realizat prin intermediul unei fracţiuni de ADN eliberată dintr-o celulă
donor, prin liză celulară şi extracţie chimică. Fenomenul natural a fost
descoperit la bacterii de către Griffith, în 1928, iar ulterior Avery, Mac Leod
şi McCarthy au descoperit în 1944 natura agentului transformant, acesta
fiind ADN izolat din celulele bacteriene.
Sistemele de transformare bacteriene se împart în două grupe:

• primul grup cuprinde acele sisteme la care capacitatea celulelor receptoare de a

reacţiona cu ADN transformant este strâns legată de o etapă fiziologică importantă, în
care se realizează starea de "competenţă“ naturală. Această stare apare în timpul
creşterii celulelor într-un mediu special şi se menţine o perioadă strict determinată.
Sistemele cel mai bine caracterizate din cadrul acestui grup sunt reprezentate de
Bacillus subtilis, Diplococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae.
• al doilea grup este reprezentat de acele organisme la care competenţa este indusă
artificial, prin tratamente cu CaCl2 sau RbCl, cel mai bine studiat fiind fenomenul de
transformare de la E.coli. Procesul se realizează prin permeabilizarea învelişurilor
celulare în urma tratării bacteriilor cu CaCl2 70-100mM, ceea ce suprimă bariera
celulară normală faţă de înglobarea ADN. Mecanismul transformării cu ADN plasmidial
este analog cu cel al transformării genetice cu ADN cromosomal, dar există şi unele
diferenţe. Astfel, atât la E.coli cât şi la B.subtilis, transformarea plasmidială este
afectată de sistemul de restricţie al gazdei (ca şi în cazul transfecţiei fagice). La
B.subtilis, plasmidele de tip oligomer şi nu cele monomere sunt active în transformare,
pe când la E.coli această diferenţiere nu se remarcă.
La bacterii, procesul natural de transformare
genetică (cu fragmente de ADN
cromosomal eliberat prin liza celulelor
bacteriene) se realizează în mai multe
etape:
• legarea reversibilă (“adsorbţia”) a moleculelor
de ADN dublu catenar la nivelul situsurilor
receptoare aflate pe suprafaţa celulară;
• preluarea ADN exogen de către celulele
competente;
• convertirea ADN dublu catenar la forma
monocatenară prin degradarea uneia dintre
catenele moleculei iniţiale;
• integrarea segmentului de ADN monocatenar
în cromosomul celulei receptoare;
• segregarea şi exprimarea fenotipică a noii
informaţii genetice integrate în genomul
celulei gazdă
• După pătrunderea lor în celula gazdă (prin fenomenul de transformare),
moleculele de ADN exogen se multiplică datorită sistemului propriu de
replicare. Ca urmare a replicării şi prin amplificare, fiecare moleculă
recombinată dă naştere unei clone moleculare, adică unei populaţii
omogene de plasmide sau fagi (în funcţie de tipul de vector utilizat), care
propagă un segment determinat de ADN.

• Spre deosebire de celulele natural competente, bacteriile la care

competenţa a fost indusă prin diverse tratamente (de ex. cu ioni de
calciu) sunt capabile să preia atât ADN monocatenar cât şi dublu catenar.
Aceasta înseamnă că ele pot fi transformate nu numai cu ADN
cromosomal linear ci şi cu ADN plasmidial circular. Aceasta particularitate
a celulelor devenite competente prin tratament „in vitro” este de mare
importanţă pentru experimentele de clonare moleculară sau pentru alte
aplicaţii care necesită introducerea în celule a ADN plasmidial sau viral.
 Transducţia fagică
• Transducţia fagică este procesul prin care un fragment din cromosomul
bacterian este transferat de la o bacterie la alta prin intermediul capsidei
anumitor bacteriofagi temperaţi. In funcţie de structura genetică a fagilor
transductori şi de mecanismul de formare a materialului genetic al particulei
fagice au fost descrise două tipuri de transducţie fagică: transducţie specializată
şi transducţie generalizată.
• Bacteriofagii ce realizează transducţia generalizată produc particule ce conţin în
cea mai mare parte ADN provenit din bacteria gazdă (din orice parte a
cromosomului bacterian) şi doar o foarte mică parte genom fagic. In cazul fagilor
ce determină transducţia specializată, ei produc particule ce conţin atât gene
fagice (majoritare) cât şi gene cromosomale bacteriene provenite dintr-o
anumită regiune a cromosomului bacterian.
• Mecanismul de transducție este în general asemănător și în cazul virusurilor ce
infectează celulele eucariote. La celulele animale, mecanismul de infectare a
celulelor gazdă presupune, în general pătrunderea particulei virale în interiorul
gazdei, decapsidarea realizându-se în citoplasmă.
Transducţia generalizată
Transducţia specializată
(bacteriofagul lambda)
CONCLUZII
• Informația genetică este purtată de molecule de ADN (procariote și
eucariote) sau de ADN sau ARN în cazul virusurilor
• In general informația genetică este conservată de-a lungul proceselor de
diviziune celulară prin intervenția mecanismelor reparatorii celulare
• Cu o frecvență relativ mică informația genetică se poate modifica
spontan prin mutații sau prin recombinare genetică, aceasta din urmă
permițând îmbogățirea sau diversificarea informației genetice prin
integrarea unor noi secvențe de ADN sau prin relocarea/modificarea
genelor proprii.
• De regulă transferul informației genetice se realizează la nivel
intraspecific, nedepășindu-se (cu unele excepții) barierele de specii.