VECTORI DE CLONARE

Vectorii de clonare sunt molecule de ADN

obţinute „in vitro” care permit integrarea unui
fragment de ADN de interes la nivelul unui
situs specific, de obicei un „situs multiplu de
clonare” („multiple cloning site” = MCS)
(secvenţă de nucleotide recunoscută de mai
multe enzime de restricţie), molecula
rezultată putând fi introdusă într-o gazdă
specifică unde se multiplică generând un
număr mare de clone de ADN recombinant.
 Caracteristicile unui vector de clonare
 să fie capabil de replicare autonomă în
celula gazdă (secvența ori)
 să prezinte markeri genetici selectabili
(de ex.gene de rezistenţă la
antibiotice);
 să aibă mai multe situsuri unice de
clivare cu enzime de restricţie, la
nivelul unor regiuni neesenţiale ale
vectorului/să conţină un număr crescut
de situsuri unice de restricţie grupate la
nivelul unei regiuni specifice numită
situs multiplu de clonare ("multiple
cloning site")
 să aibă o greutate moleculară mică şi
să prezinte cât mai multe copii per
celulă (eventual să fie amplificabil prin
tratament cu cloramfenicol);
 să fie uşor de purificat, să permită
obţinerea unor cantităţi mari de ADN,
suficiente pentru experimentele de
clonare
 să conţină secvenţe specifice de ADN
ce permit selecţia rapidă a clonelor
recombinate (selecţie directă pe medii
specifice sau selecţie prin teste
histochimice)
Alte însușiri pentru vectorii moderni:

• să fie cunoscută secvenţa de nucleotide a vectorului;

• să prezinte siguranţă în folosire (să aibă o
transmisibilitate redusă în prezenţa unor plasmide
conjugative, iar replicarea să fie sensibilă la temperatura
corpului mamiferelor);
• să prezinte dimensiuni din ce în ce mai reduse dar să
permită clonarea unor fragmente mari de ADN heterolog;
• să prezinte secvenţe care să asigure generarea de
molecule monocatenare necesare tehnicilor de
secvenţiere sau pentru construirea de sonde de ADN;
• să conţină secvenţe specifice de tip promotori,
terminatori, activatori (enhanceri) ce asigură transcrierea
"in vitro" a ADN clonat (vectori de exprimare).
 CLASIFICAREA VECTORILOR DE CLONARE
1. După structură şi mod de funcţionare pot fi:
– vectori plasmidiali
– vectori virali
– vectori hibrizi de tip fagimide (cu structură hibridă, de plasmidă şi
de fag filamentos) sau cosmide (cu structură hibridă, de genom
de fag şi de plasmidă).
 Clasificarea vectorilor de clonare

2. In funcţie de posibilitatea replicării şi menţinerii stabile a vectorului în

diferite gazde, vectorii de clonare pot fi:
– vectori congenerici ce pot fi folosiţi doar la organisme aparţinând
aceluiaşi gen taxonomic
– vectori de tip "shuttle" (navetă) care se replică şi se menţin stabil
în două gazde diferite, dintre care una este Escherichia coli.

3. In funcţie de posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de ADN

clonate vectorii pot fi:
– vectori de clonare care permit doar clonarea unei anumite
secvenţe de ADN, nu şi analiza exprimării sale, deoarece nu
conţin secvenţe promotor la nivelul situsului de inserţie
– vectori de exprimare care au în structura lor secvenţe ce permit
exprimarea fragmentului de ADN clonat şi determină, în anumite
situaţii, obţinerea de proteine de fuziune.
• realizată în 1977 de către Bolivar și
Plasmida pBR322
Rodriguez în laboratorul lui Herbert Boyer, la
Univ.of California
• are dimensiuni mici: 4361pb (2,9 MDa);
• conţine secvenţa ori de la plasmida ColE1
• gena rop – genă reglatoare care controlează
numărul de copii/celulă;
• este uşor de purificat și este amplificabilă
prin tratament cu cloramfenicol;
• conţine doi markeri genetici de selecţie: gena
de rezistenţă la tetraciclină (derivată de la
plasmida pSC101) şi gena de rezistenţă la
ampicilină (derivată din plasmida RSF2124);
• are mai multe situsuri unice de restricţie
pentru diferite enzime de restricţie: EcoRI,
Bam HI, Pst I, Hind III, Sal I etc;
• permite clonarea inserţională la nivelul
situsurilor unice de restricţie din genele
marker(Bam HI în gena de rezistenţă la
tetraciclină şi Pst I în gena de rezistenţă la
ampicilină)
1977
 Vectorii de tip pUC
Aceşti vectori au fost construiţi între anii 1982-1985 de către grupul de
cercetători conduşi de Messing, denumirea vectorilor reprezentând locul unde
aceştia au fost obţinuţi (plasmid of University of California). Ei sunt derivaţi de
la pBR322, prin includerea genei lacZ' (partea din gena pentru beta
galactozidază ce codifică secvenţa NH 2-terminală a proteinei = peptidul  ce
conţine primii 145 de aminoacizi din cei 1023 câţi are fiecare dintre catenele
tetramerului -galactozidaza) şi a unei secvenţe sintetice (polilinker de 54
perechi de baze) ce conţine situsuri unice de recunoaştere pentru mai multe
enzime de restricţie (13 enzime de restricţie).
Sinteza beta galactozidazei funcționale se realizează doar în anumite tulpini
mutante de E.coli care conțin porțiunea din gena lac Z corespunzătoare
peptidului ω, după introducerea vectorului de clonare ce conține porțiunea din
gena lac Z corspunzătoare peptidului α (complementație genică).
 Vectori derivați de la bacteriofagul λ
Bacteriofagul λ este un virus care are drept gazdă Escherichia coli. Morfologia
virionului este specifică, ele având toate elementele caracteristice unui
bacteriofag (cap, gât, coadă, placa bazală și filamente terminale). Bacteriofagul
are un genom reprezentat de o moleculă lineară de ADN dublu catenar, ce
conţine 48502 perechi de baze. La capetele acestei molecule lineare se găsesc
secvenţe specifice, complementare (coezive) de 12 nucleotide (situsul cos),
care permit circularizarea ADN fagic în celulele bacteriene infectate (tulpini de
E.coli). Genomul viral se prezintă astfel în 2 conformații: lineară la nivelul
virionului și circulară în citoplasma celulei bacteriene infectate (circularizarea se
produce după infecție la nivelul situsului cos).
Pornindu-se de la genomul fagului , prin prelucrări "in vitro" au
fost construiţi o serie de vectori de clonare, încadraţi în două
categorii: vectori de înlocuire şi vectori de inserţie.
Pentru a se putea obţine asemenea vectori, genomul fagului  a
fost modificat: au fost eliminate situsurile de restricţie din
zonele esenţiale, iar prin folosirea oligonucleotidelor sintetice,
situsurile de restricţie au fost plasate în poziţiile cele mai
favorabile pentru clonare.
Deoarece regiunea centrală a genomului viral (aproximativ o
treime din genom) nu este esenţială pentru evoluţia litică, ea
poate fi eliminată complet, sau înlocuită cu ADN de interes.
Vectorii de înlocuire (substituţie) se caracterizează prin faptul că ADN
heterolog (străin, de interes) înlocuieşte un fragment neesenţial din vector,
după ce acesta a fost tratat cu două enzime de restricţie ale căror situsuri de
acţiune flanchează respectiva regiune virală. Asemenea vectori permit
clonarea unor fragmente de ADN de 9-23 kb, fiind folosiţi pentru obţinerea
bibliotecilor de gene (colecţie de vectori recombinaţi ce conţin fragmente de
restricţie de ADN genomic de la o anumită specie). Din această categorie fac
parte vectorii de tip λ Charon şi λ EMBL.
Vectorii de inserţie se caracterizează prin faptul că ADN de interes
este clonat la nivelul unui situs unic de restricţie, localizat la nivelul
unei gene neesenţiale pentru evoluţia litică a fagului. Din această
categorie fac parte vectorii de tip  gt şi cei de tip  ZAP. Se folosesc
pentru realizarea bibliotecilor de fragmente de ADN (de gene).
Vectorii hibrizi de tip cosmide reprezintă plasmide modificate ce conţin:
- secvenţa cos de la fagul lambda necesară împachetării ADN în
particulele fagice
- originea replicării de la plasmida ColE1
- un marker de selecţie (de obicei, gena de rezistenţă la ampicilină)
- situs multiplu de clonare.
Cosmidele se pot replica şi menţine ca plasmide
(permiţând selecţia coloniilor purtătoare pe
mediu ce conţine antibioticul corespunzător)
sau, în condiţii specifice, datorită prezenţei
situsului cos, ele se pot împacheta în particule
fagice, fiind propagate prin transducţie sau
transfecţie (transformarea celulelor sensibile cu
ADN izolat din particule fagice recombinate).
Cosmidele permit clonarea la nivelul lor a unor
fragmente mari de ADN străin (de până la 45-50
kb), favorizând în acest fel propagarea unor
gene eucariote întregi. Deoarece în cosmide se
pot insera fragmente mai mari de ADN,
comparativ cu vectorii derivaţi de la fagul
lambda, ele sunt preferate în experimentele de
realizare a băncilor genomice la eucariote.
Vectorii hibrizi de tip fagimide

Fagimidele sau plasmidofagii reprezintă o categorie

specială de vectori, ce combină caracteristicile vectorilor
de tip plasmidiali cu cele ale fagilor filamentoşi. Se
deosebesc de cosmide prin absența situsului cos dar
prezența unor secvențe provenite din genomul unor fagi
filamentoși.
Fagimidele, în cea mai simplificată formă, conţin:
– originea replicării de la plasmida ColE1 (asigură
menţinerea vectorului în forma plasmidială);
– genă marker de selecţie (rezistenţă la antibiotice,
sinteză de β-galactozidază etc);
– copie a unei secvenţe dintr-un fag filamentos (de
obicei M13 sau f1), ce conţine informaţia genetică
pentru replicarea ADN viral (sinteza de ADN
monocatenar) şi pentru morfogeneza particulelor
fagice.
Fagimidele pot fi propagate şi menţinute
stabil în forma plasmidială într-o tulpină
bacteriană cultivată în condiţii normale de
mediu (pe mediu selectiv ce conţine un
antibiotic, de ex.ampicilină).
Atunci când celulele gazdă sunt infectate
cu un bacteriofag filamentos ajutător
("helper"), sunt activate funcţiile virale, iar
ADN este împachetat în particule fagice
(ca ADN monocatenar circular). ADN
monocatenar purificat din asemenea
particule poate fi utilizat pentru procesele
de secvenţiere a fragmentelor de ADN
clonate sau pentru obţinerea de sonde
moleculare (de ADN monocatenar).
ADN heterolog poate fi integrat la nivelul
unui MCS localizat la nivelul unei gene ce
permite rapidă selecţie a vectorilor
recombinaţi.
Exemplu: vectorii de tip pBluescript sunt
vectori multifuncţionali, construiţi pentru a
simplifica clonarea moleculară şi analiza
genetică .
Vectorii de exprimare
Experimentele de inginerie genetică necesită nu numai transferul unui
fragment de ADN de interes într-o nouă gazdă ci și exprimarea
informației genetice noi. Exprimarea ADN străin depinde de prența
la nivelul său a unor elemente reglatoare ce pot fi recunoscute de
noua gazdă și care asigură exprimarea (promotor, secvență de
terminare, situs de legare la ribosomi – pentru gazdele bacteriene).
Grupul vectorilor de exprimare este foarte heterogen, ei permiţând fie
doar sinteza ARNm pentru gena de clonată, fie și sinteza
polipeptidului codificat de aceasta. Vectorii de acest tip conţin
situsuri de clonare plasate sub controlul unor promotori puternici,
sau la capătul unei secvenţe semnal.
De regulă, în urma clonării în vectorii de exprimare se obţine o genă
hibridă formată din gena de interes fuzionată cu o genă marker.
Proteina de fuziune rezultată poate fi apoi transportată în
citoplasmă, facilitându-se în acest fel identificarea și purificarea sa.
Când se doreşte exprimarea unei gene ce nu conţine nici o secvenţă recunoscută
de echipamentul enzimatic procariot, clonarea ei se face în aşa fel încât să
conducă la obţinerea unei proteine de fuziune. Proteinele de fuziune sunt
obţinute prin unirea a două secvenţe cu cadru de citire deschis (“open reading
frame”), astfel încât produsul rezultat în urma traducerii acestei secvenţe de
ADN să conţină secvenţe de aminoacizi derivate de la ambele gene.
Promotorul, situsul de legare la ribosomi şi regiunea amino-terminală sunt
reprezentate de secvenţe ale vectorului, ceea ce asigură transcrierea şi
traducerea eficientă a produsului de fuziune. Producerea unor asemenea
proteine de fuziune conduce la exprimarea unor fragmente scurte de gene şi,
consecutiv, la separarea domeniilor funcţionale din interiorul unor proteine
complexe. Dintre genele folosite pentru obţinerea proteinelor de fuziune
menţionăm: lac Z, gst (pentru glutation S-transferaza), gfp (pentru “green
fluorescence protein”, genă izolată de la meduza Aequorea victoria), gena
pentru proteina A de la Staphylococcus aureus etc.
În cazul vectorilor de clonare ce conţin gena lac Z, la nivelul capătului 3’ al
acesteia (deci în regiunea ce codifică extremitatea COOH a proteinei -
galactozidaza) s-a introdus o secvenţă oligonucleotidică sintetică (polilinker)
ce conţine situsul de recunoaştere al mai multor enzime de restricţie
(secvenţa MCS). De asemenea, unii vectori ce conţin această genă mai
prezintă la nivelul MCS un situs Nco I (CCATGG) ce cuprinde codonul ATG,
de iniţiere a traducerii genelor eucariote. În acest fel, genele clonate la nivelul
MCS sunt exprimate ca proteine de fuziune cu β-galactozidaza, ceea ce le
asigură protecţie faţă de acţiunea proteazelor gazdei şi identificare rapidă (pe
baza activităţii enzimei β-galactozidaza).