Sunteți pe pagina 1din 13

TEHNOLOGIA ADN-ULUI RECOMBINANT

1. Scurt istoric Tehnologia a ADN-ului recombinant a fost inaugurata in anul 1973, cand a aparut si lucrarea Constructia in vitro a plasmidelor bacteriene biologic functionale, elaborata de catre S. Cohen, H. Boyer si altii. In aceasta lucrare este descris procedeul de legarea in vitro a unor fragmente de AND provenite de la doua plasmide diferite. Aceasta noua plasmida denumita himera biologica isi dovedeste functionalitatea dupa introducerea ei in bacteria E. coli. Progresele realizate in ingineria genetica au facut posibila dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant in directia realizarii unei compatibilitati intre specii diferite. Printre cele mai importante progrese realizate amintim: Descoperirea , izolarea si purificarea enzimelor de restrictie, capabile sa taie molecula de AND la anumite situsuri. Metode pentru determinarea secventei nucleotidelor in acizii nucleici si sintetizarea chimica a oligonucleotidelor. Metode pentru izolarea unor gene si clonarea lor. Metode pentru includerea vectorilor in celula procariota si eucariota Metode de identificare rapida a celulelor transformate de catre moleculele de AND create in vitro 2. Descrierea tehnologiei AND-ului recombinant Tehnologia ADN-ului recombinat este cunoscut i sub numele de clonarea genelor sau clonare molecular. Ea consta in introducerea si functionarea unor gene numite pasageri (P) intr-o celula sau organism gazda numit receptor (R). Astfel, printr-o serie de proceduri experimentale este realizat transferul de informaie genetic reprezentat de acidul dezoxiribonucleic AND, de la un organism la altul. Pentru ca gena pasager sa fie protejata de degradarea enzimatica a DN-azelor celulei receptoare, ea trebuie introdusa intr-un vehicul adecvat, numit vector (V). Tehnologia ADN-ului recombinant face posibila obtinerea unor forme de viata noi , prin introducerea unor secvente nucleotidice din ADN-ul unei rase sau specii in ADN-ul alteia. Acest procedeu nu ar putea fi realizat fara existenta enzimelor de restrictie, care taie secventele ADN in mod specific. Ele sant utilizate pentru a fragmenta ADN-ul pasagerului si pentru a taia ADN-ul circular al plasmidei (vectorul). Dupa ce ADN-ul strain (pasagerul) a fost recombinat cu ADN-ul plasmidei vectorul) , forma circulara a plasmidei poate fi refacuta cu ajutorul ADN ligazei, dupa care se poate trece la inserarea moleculei de ADN recombinat intr-o gazda adecvata (A. Griffiths si colab., 1993). Procedeul de recombinare al ADN-ului poate fi sintetizat in urmatoarele etape : (fig. 1)
1

Obtinerea pasagerului prin extractia ADN-ului de la un organism donator si scindarea lui cu ajutorul enzimelor de restrictie. Pregatirea pasagerului si a vectorului : ADN-ul strain (P) este introdus in interiorul unei celule bacteriene gazda (V) pentru a evita degradarea lui in celula receptoare. Deschiderea vehicului in vederea inserarii pasagerului se face cu ajutorul enzimelor de restrictie, iar legarea pasagerului de ADN-ul circular al vectorului este realizata de ADN- ligaze. Introducerea si exprimarea ADN-ului recombinant in celulele receptoare (ex. E. Coli).

Fig. 1

In tehnologia ADN-ului recombinant intervin mai multe elemente: vectorul , pasagerul, enzimele de restrictie, ligazele si receptorul. In continuare vom descrie succint fiecare dintre aceste elemente. 2.1. Vehicule (vectori) Introducerea unei gene straine in (P) in genomul unei gazde poate fi facuta numai prin utilizarea unui vector (V), capabil de a transporta gena straina si de a o insera in ADN-ul celulei gazde, fara a fi degradata de enzimele de restrictie ale acesteia.

Vectorii cei mai utilizati sant reprezentati de molecule mici de ADN, de forma circulara, care permit replicarea lor impreuna cu fragmentul de ADN inserat (pasagerul) intr-un numar mare de copii (aprox. 30-50 copii / celula). Ei sunt usor de recuperat din molecula hibrida. Vectorii trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: Sa poata fi obtinuti in cantitati mari si sa poata fi purificati cu usurinta Sa contina markeri genetici pentru a putea face posibila izolarea celulelor transformate Sa posede un numar limitat de situsuri de restrictie astfel incat scindarea sa fie cat mai specifica Sa contina elementele de reglaj ale unui operon procariot tipic: promotorul (P) operatorul (O) si o parte a unei gene structurale din cadrul operonului respectiv (ex. gena reporter lac Z) In practica tehnologiei ADN-ului recombinant, la procariote se utilizeaza ca vectori anumite plasmide si acizi nucleici virali cum sant plasmidele colicinogene (col. E1), colifagul lambda () si virusul SV 40 . 2.1.1. Plasmidele n calitate de vectori, plasmidele au cptat o rspndire deosebit. Plasmidele reprezint nite molecule inelare de ADN specifice bacteriilor. Ele pot exista autonom i determin unele caractere ale bacteriilor, cum ar fi: capacitatea de conjugare, rezistena la antibiotice, agresivitatea. Plasmidele necesare pentru transferul de gene trebuie s posede un numr restrns de regiuni sensibile la aciunea enzimelor de restricie. n acest caz, se poate realiza ruperea i apoi inseria de ADN exogen n plasmid. Primul plasmid bacterian, folosit ca vector pentru transferul de gene, a fost cel notat pSC 101, realizat de S.Cohen (1973). Vectorii de clonare n celulele vegetale sunt derivai de la plasmide naturale (plasmidele Ti sau Ri de la Agrobacterium tumefaciens, respectiv A.rhizogenes) sau de la virusuri specifice celulelor vegetale, ce asigur funcionarea unor anumite secvene de ADN dup integrarea lor n genomul celulelor vegetale. Ca i n cazul vectorilor pentru alte tipuri de organisme, vectorii pentru celulele vegetale sunt, de obicei, vectori de tip navet, ceea ce nseamn c ei pot funciona n dou gazde diferite: E.coli i Agrobacterium sp., iar anumite poriuni ale lor se exprim n celulele eucariote. Un exemplu de asemenea vector, mult utilizat n experimentele de transfer de gene n celulele vegetale, este pBI121 (fig.2)

Fig.2. Harta genetic a plasmidei pBI121. Plasmida pBI121 este un derivat al plasmidei pBin19 construit de Bevan n 1984. Ea are 13 kb i conine o serie de elemente genetice ce i permit meninerea n E.coli i n diferite tulpini de Agrobacterium (ori, gena de rezisten la kanamicin). De asemenea, vectorul pBI121 conine i secvene ce sunt transferate n genomul celulelor vegetale. Acestea sunt: secvenele marginale de 25pb (derivate de la ADN-T din plasmida Ti de la A.tumefaciens) eseniale pentru transfer, ntre care au fost clonate dou gene marker: gena de rezisten la kanamicin (nptII) i gena ce codific sinteza -glucuronidazei (gus). Cele dou gene marker au fost clonate sub controlul unor regiuni promotor sau terminator specifice: gena nptII este controlat de promotorul NOS (de la gena pentru nopalin-sintetaz)(P1) i de terminatorul NOS, iar gena gus se afl sub controlul promotorului 35S de la virusul CaMV (virusul mozaicului conopidei)(P2) i a secvenei terminatoare NOS. Acest tip de vector permite sinteza de proteine de fuziune prin clonarea genei de interes la nivelul MCS localizat dup promotorul 35S. Interesul deosebit al cercettorilor pentru introducerea de gene heteroloage n celulele vegetale i pentru studiul funcionrii lor, a condus la construirea unor vectori din ce n ce mai perfecionai. Unii dintre asemenea vectori permit exprimarea difereniat a unor gene clonate: la nivelul unor organe specifice ale plantei sau n diferite momente ale dezvoltrii acesteia. Bacteriile Agrobacterium tumerfaciens descoperite n 1907 de E.Smith i C.Townsend, provoac formarea unor tumori cancerogene (crown gall) pe tulpinile unor plante (la speciile din 93 de familii de dicotiledonate). Plasmidul Ti (tumor inducing) descoperit la A.tumefaciens cauzeaz tumori la plante prin transferul unui segment de ADN (ADN-T) din plasmid n celulele vegetale. n principiu, plasmidele Ti conin mai multe regiuni, cu funcii distincte: regiunea ADN-T (coninnd genele de tumorigenez), regiunea de virulen (genele vir), regiunea de incompatibilitate (genele inc), regiunea ce controleaz transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc, primele dou fiind ns cele mai importante pentru procesul de transformare a celulelor vegetale. Strategia pentru transferul genelor cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal include: introducerea segmentului de ADN-T ntr-un plasmid de E. coli;

introducerea n plasmidul format a genei necesare i a genei marker (gena pentru rezisten la Kanamicin); introducerea plasmidului recombinat n Agrobacterium tumerfaciens; infecia cu A.tumerfaciens a plantelor respective; selectarea plantelor transformate (fig.3). Pentru realizarea transferului de gene n celula vegetal este utilizat metoda culturilor de celule i esuturi n vitro. Firma american Monsanto comercializeaz deja plante transgenice (transformate) de cartof, rezistente la gndacul de Colorado.

Fig.3. Transferul de gene cu ajutorul plasmidului Ti n celula vegetal.

2.2. Pasageri (gene) In tehnologia ADN-ului recombinant pasagerul reprezinta fragmentul de ADN strain care contine gena de interes.Pasagerul poate fi izolat din celule cu ajutorul enzimelor specifice sau poate fi sintetizat artificial prin metode chimice.

Oricare ar fi metoda de transfer, rata reusitei este intotdeauna foarte mica, de aceea este necesara asocierea la gena de interes si a unei gene marker (care codifica rezistenta la un antibiotic sau ierbicid), care favorizeaza selectarea celulelor in care s-a integrat transgena. Principalele gene marker, de selectie, folosite in transformarea plantelor (dupa Schrott, 1995) : kanamicina, neomicina geneticina (GA18) nptII (APH3II) neomicinfosfotransferaza II gentamicina aacC3, aacC4 gentamicin-3-N-acetiltransferaza higromicina hph, hpt (APH4) higromicin-fosfotransferaza metotrexat dhfr dihidrofolatreductaza spectinomicina ADNr16S aadA ARNr 16S aminoglicozida-3-adeniltransferaza
streptomicina SPT

ADNr 16S aadA streptomicinfosfotransferaza ARNr 16S aminoglicozida-3-adeniltransferaza bleomicina, fleomicina ble blasticidina bsr blasticidin S deaminaza sulfonamida sul dihidropteratsintaza fosfinotricina bar fosfinotricinacetiltransferaza clorsulfuron als, csr-1 acetolactatsintetaza bromoxinil bxn bromoxinilnitrilaza glifozat EPSPS 5-enolpiruvil-3-fosfatsintetaza 2,4-D tfdA 2,4-diclorfenoxiacetat monooxigenaza atrazina psbA proteina QB 2,2-DCPA dehalogenaza 4-metil-triptofan tdc triptofandecarboxilaza nitrat NR nitratreductaza S-amonoetil-L-cisteina DHPS dihidropicolinatsintetaza lizina/treonina AK aspartatchinaza aminoetil-cisteina ocs octopinsintetaza O alta gena marker este gena dhfr pentru enzima dihidrofolatreductaza (DHFR), izolata tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR confera rezistenta la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la concentratii mici ale acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfr a fost transferata la specii cum ar fi: tutunul, petunia si graul. Genele raportoare, spre deosebire de markerii de slectie nu confera celulelor rezistenta fata de un anumit compus. Ele codifica proteine care pot fi detectate direct sau catalizeaza reactii specifice ai caror produsi pot fi detectati prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de transcriptie cis sau trans, in conditiile transformarii tranziente sau permanente, precum si monitorizarea si optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare sunt:

gena gus (uidA) codifica -glucuronidaza (GUS) si a fost izolata de la E. coli K12 (Jefferson si colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizata la plante. Exista pentru aceasta hidrolaza compusi substat pentru evidentierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice la nivelul tesuturilor rezultand un compus de culoare albastra usor de evidentiat. La pH-ul utilizat pentru determinarea GUS nu exista activitate glucuronidazica detectabila in nici un tesut vegetal. Toate metodele de determinare se aplica insa, numai celulelor fixate, nonviabile. * gena raportoare luc pentru enzima luciferaza foloseste un sistem substrat-enzima care produce bioluminescenta. Gena luc a fost izolata de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimata in plante (Ow si colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extrasa din tesuturi iar activitatea ei poate fi determinata in prezenta luciferinei. Dar, exista si o metoda de determinare non-letala si neinvaziva direct in tesuturile si organele plantelor transformate, pentru masurarea bioluminescentei fiind necesar un luminometru. gena gfp pentru proteina cu fluorescenta verde (GFP) reprezinta cea mei noua gena raportoare si totodata cea mai spectaculoasa si avantajoasa. Gena a fost izolata de la o meduza, Aequarea victoria, fiind transferata la cateva specii de plante (Chalfie si colab., 1994). GFP prezinta o serie de avantaje si anume: nu necesita un substrat, proteina se evidentiaza in tesuturi intacte in vitro si in vivo, prin excitarea in UV, proteina poate fi fuzionata
cu alte proteine permitand monitorizarea traficului proteic si a metabolismului (vezi Rakosy-Tican si colab., 1999; 2000). gena cat izolata de la E. coli, codifica enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizata ca gena raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretentioasa bazanduse pe monitorizarea acetilarii cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produsii fiind separati prin cromatografie in strat subtire (TLC) si masurati prin densitometrie sau prin scintilatie. Uneori poate exista activitate CAT si in unele tesuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce afecteaza eficienta acestui sistem. antocianii sunt pigmenti rosii sau purpurii care se acumuleaza in vacuole in unele tesuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlata de gene structurale si reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate si clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare in tesuturile si organele unor genotipuri care contin gene structurale dar nu sintetizeaza antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezinta o serie de avantaje: nu necesita un substrat, se exprima doar in celulele viabile si metabolic active, sunt usor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcriptie R si C1 de la porumb (Schrott, 1995). genele care confera rezistenta la streptomicina si/sau spectinomicina au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care il au, prin inactivarea cloroplastelor. Pasagerul (gena de interes) poate fi obtinuta printr mai multe etape: Izolarea ADN-ului genomal Digestia ADN-ului genomal cu o enzima de restrictie Separarea fragmentelor de restrictie prin electroforeza

2.3. Enzimele de restrictie (endonucleazele de restrictie 7

Enzimele de restrictie sant produse de catre plasmidele bacteriene si au capacitatea de a taia molecula de ADN la nivelul situsurilor pe care le recunoaste (situsuri de restrictie). In urma taierii rezulta fragmente cu capete monocatenare adezive 3 sau 5, sau capete bonte. Unele enzime de restrictie (ex.Hind II) taie simultan ambele catene ale ADN-ului in acelasi punct, rezultand fragmente cu capete boante (blunt ends), in timp ce altele (ex. Eco RI) taie defazat rezultand capete adezive sau cozive 3 sau 5 (stiky or cohesive ends). Fig.4

capete coezive

capete bonte

Fragmentele de ADN obtinute in urma digestiei cu enzime de restrictie pot fi incluse in molecule vectoare mici, autoreplicabile, care vor fi introduse in gazde diferite.

Clasificare Sistemele enzimatice de restricie/modificare (sau restricie/metilare) au fost mparite n 3 categorii: Tipul I, Tipul II i Tipul III. Tipurile I i III constau n enzime care au att funcii de restricie ct i funcii de modificare; ambele tipuri recunosc secvene specifice, nemetilate, de ADN dc; enzimele de tip I cliveaz ADN-ul ntr-o manier randomizat (situs-nespecific), pe cnd cele de tip III taie la situsuri specifice, dar nu n cadrul secvenei de recunoatere, ci la o distana de 25-27 nucleotide de acesta (ex: EcoP1 codificat de fagul P1). Sistemele de tip II constau n enzime separate care ndeplinesc funciile de metilare, respectiv, restricie.
Denumirea enzimelor de restrictie se face cu simboluri ce marcheaza prima litera a genului, urmata de doua litere reprezentand specia si alte simboluri.

Fig.4 Enzimele de restrictie si situsurile lor de clivaj

Hartile de restrictie Locurile tinta ale enzimelor de restrictie pot fi utilizate ca markeri pentru ADN. ADN-ul dintr-o sursa specifica este supus unei digestii succesive realizata de diferite enzime de restrictie. Dupa ce fragmentele au fost separate electroforetic pe gel de poliacrilamida, se poate determina harta situsurilor de restrictie (A. Griffiths si colab. 1993).

2.4 Alte enzime ADN ligazele au fost descoperite in anul 1967 in celulele de E.coli neinfectate sau infectate cu bacteriofagul T4. Aceste enzime sant implicate in sinteza ADN-ului si au rolul in legarea fragmentelor de restrictie. Ele catalizeaza formarea unor legaturi fosfodiesterice intre capetele 3-hidroxil si 5 fosfat ale unor nucleotide adiacente din fragmentul de ADN. Prin aceasta reactie ligaza repara sparturile (nicks) dintr-o catena de ADN. ADN polimerazele au fost identificate si purificate in anul 1950 de catre A. Kornberg. Aceste enzime catalizeaza reactia de replicare a ADN-ului, reactie care are loc numai in prezenta formelor trifosfat ale nucleotidelor (deoxiadenozintrifosfatul- dATP, sau dGTP, dCTP, dTTP). Fig. 5
9

ADN parental + (Primer)

dATP + dGTP + dCTP + dTTP

ADN polimeraza >>>>>>>>>>>>>>>> Molecule de ADN fiice

Revers-transcriptazele au fost descoperite in anul 1970 de H. Temin si S. Mizutani si sant enzime care determina transcriptia inversa a informatiei genetice de la ARN la ADN. Catena de ADN sintetizata pe marita ARN-ului are la inceput o bucla care constituie un primer pentru sinteza celei de a doua catene de ADN. Acest tip de ADN a fost numit ADN complementar. Terminal transferazele sant reprezentate de un grup de enzime care adauga nucleotide identice la capetele 3 ale catenelor de ADN. Unele adauga adenina formand o coada monocatenara (AAAA) la extremitatea 3 a moleculei de ADN, iar altele timina (TTTT) in acelasi mod. Intre aceste cozi monocatenare ale unor molecule de ADN de origini diferite se pot realiza legaturi complementare (A-T) cu ajutorul ADN-ligazelor, rezultand astfel molecule hibride de ADN. 2.5. Receptorul Receptorul are rolul de a accepta, multiplica si exprima moleculele de ADN recombinant ce contin pasagerul cu informatia dorita. Receptorul se alege in functie de tipul de vector utilizat si poate fi reprezentat de culturi bacteriene cum ar fi E.coli sau Bacillus subtilis. 3. Aplicaii ale transgenezei la plante Speciile vegetale prezint o mare diversitate genetic, iar cele slbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obine gene importante din punct de vedere practic. Cercetrile de inginerie genetic la plante prezint o semnificaie teoretic deosebit, facilitnd cunoaterea modului de aciune a genelor acestor organisme, a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltrii plantelor, a mecanismelor de inactivare a genelor etc. (Meyer, 1995). De asemenea, prin aplicarea tehnicilor de biologie molecular se pot obine informaii utile asupra particularitilor genomului plantelor folosite n ameliorare, a localizrii unor gene de interes, a gradului de nrudire dintre diferite specii etc (Gresshoff, 1994; Edwards i Karp, 1997). n ceea ce privete aplicaiile practice, pn n prezent au fost obinute o serie de rezultate semnificative, unele aplicate deja n practic aa cum sunt: plante transgenice rezistente la viroze; plante transgenice rezistente la atacul unor duntori, plante transgenice rezistente la erbicide (fig. 3); plante transgenice de interes horticol (plante ornamentale cu fenotipuri noi, plante care produc fructe rezistente la nmuiere); plante transgenice capabile s sintetizeze metabolii secundari n cantiti crescute; plante transgenice productoare de anticorpi comestibili etc.

10

Fig. 3. Comparaie ntre aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la aciunea erbicidelor i cel al unor plante Pe lng aceste reuite, cercetrile efectuate n prezent vizeaz, pe de o parte extinderea numrului de specii de plante la care transferul de gene utile s fie eficient i, pe de alt parte, studii asupra controlului dezvoltrii plantelor i a exprimrii genelor (activarea i silenierea genelor) (Chua i Sundaresan, 2000). Aa cum se poate vedea din cele spuse mai sus, aplicaiile plantelor transgenice sunt extrem de diverse astfel c abordarea tuturor direciilor ntr-o singur lucrare nu este posibil. Cteva dintre aceste aplicaii, care fie au potenial aplicativ spectaculos, fie nu au fost pe deplin rezolvate, fie pot aduce nouti n plan fundamental i practic: protecia plantelor fa de atacul insectelor, fitopatogenilor microbieni, virali i a nematodelor obtinerea de plante transgenice productoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi obtinerea de plante transgenice folosite pentru cercetri asupra unor procese fiziologice fundamentale (biosinteza unor hormoni, proteine, enzime etc.)

----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Bibliografie selectiv 1. Altman, A., 1999, Plant biotechnology in the 21st century: the challenges ahead, EJB, 2, 2. 2. Augustin Vlaic,1997, Inginerie Genetica, Ed. Promedia Plus, p. 53-104 3.Carozzi,N., WarrenW., Rice,D.A., Evola,S., Koziel,M.G., 1992, Expression of chimeric CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco, Plant Molec.Biol., 20, p.539-548. 4. Cucu, N., Stefan, M., Mitru, M, Gavril, L., 1998, Modification of plant genome by genetic transformation: interaction of alogenes with the host genome, n Implicaii tiinifice i bioetice n analiza i manipularea genomului, Edit.Ars Docendi, p.161-169

11

5. Gatz,C., 1997, Chemical control of gene expression, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 48, p.89-108. 6. Gold, J., Harder, D., Smith, F., Aung, T, Procunier, J., 1999, Development of a molecular marker for rust resistance genes Sr39 and Lr35 in wheat breeding lines, EJB., 2, nr.1. 7. Hedden, P., Phillips, A. L., 2000, Manipulation of hormone biosynthetic genes in transgenic plants, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.130-137. 8. Hileman, B., 2002, Whats hiding in transgenic foods? Chemical Eng. news, ian. 2002, p. 20-2 9. Ho, M. W., 2001, Horizontal gene transfer the hidden hazards of genetic engineering, Institute of Science in Society. 10. Martinelli, L., Mandolino, G., 1994, Genetic transformation and regeneration of transgenic plants in grapevine (Vitis rupestris), Theor. Appl. Geneti., 88, p.621-628 11. Riva, G. A., Cabrera, J. G., Padron, C. A., 1998, Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation, EJB, 1, nr.2. 12. Roberts RJ; Murray, Kenneth (November 1976). "Restriction endonucleases". CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (2): 12364 13. Robinson,J., 1999, Ethics and transgenic crops, Electronic Journal of Biotechnology, 2, nr.2. 14. Sharma, H. C., Sharma, K. K., Seetharama, N., Ortiz, R., 2000, Prospects for usig transgenic resistance to insects in crop improvement, EJB, 3, nr.2. 15. Tinland, B., 1996, The integration of T-DNA into plant genomes, Trends in Plant Science, 1., nr.6.p.178-183. 16. Tourte, Y., 1998, Genie genetique et biotechnologie: concepts et methodes, Edit.Dunod 17. Walmsley, A. M., Arntzen, C. J., 2000, Plants for delivery of edible vaccines, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.121-129. 18. Watson, J. D., Gilman, M., Witkowski, J., Zoller, M., 1992, Recombinant DNA, Scientific Academic Books. 19. Weising, K., Kahl., G., 1996, Natural genetic engineering of plant cells: the molecular biology of crown gall and hairy root disease, World J. Microbiol.Biotechnol., 12, p.327351. 20. Whitelam, G. C., Cockburn,W., Owen, M. R. L., 1994, Antibody production in transgenic plants, Biochem. Society Transact., 22., p.940-943. 21. Zuo, J., Chua, N. H., 2000, Chemical inducible systems for regulated expression of plant genes, Current Opinion in Biotechnology, 11, p.146-151

12

13