MARKERI GENETICI I MARKERI MOLECULARI

Markerii genetici sunt alele mutante care marcheaz prezena unei gene la nivel
individual i controleaz caractere uor evideniabile, marcante. Sunt de dou feluri:
- markeri morfologici, markeri care controleaza caractere morfologice ex.
culoarea bobului la porumb (gena R
r
pentru culoarea roie, gena R
st
pentru
boabe pestrie, gene localizate pe cromozomul 10; gena wx localizat pe
cromozomul 9 pentru aspectul ceros al bobului).
- markeri biochimici care controleaza nsuiri biochimice.
La rndul lor, markerii biochimici sunt de mai multe feluri:
1. markeri izoenzimatici sunt reprezentai de gene care codific izoenzimele;
2. markeri auxotrofi specifici bacteriilor, sunt forme mutante, incapabile s
sintetizeze un anumit component (de regul aminoacid) pe care formele
slbatice, prototrofe, l pot sintetiza (ex. met
-
, his
-
);
3. markeri de rezisten ex. gena de rezisten la antibiotice: Ap
R
(rezisten la
ampicilin), Km
R
(rezisten la kanamicin ) etc;
4. markeri de deficien sunt alele mutante ce codific enzime nefuncionale
(NR
-
- nitrat reductaza, nu permite supravieuirea pe mediu cu azot nitric, numai
pe mediu cu azot amoniacal);
Din punct de vedere al ingineriei genetice, markerii pot fi:
1. markeri de selecie, care permit selecia celulelor transformate prin utilizarea
unui mediu de selecie pe care formele netransformate nu pot supravieui. De
regul sunt markeri de rezisten. De exemplu forma rezistent la ampicilin
poate supravieui pe un mediu cu ampicilin.
2. markeri de detecie, care permit identificarea esuturilor transformate.

Tipuri de markeri de detecie

Marker Enzima codificat Substratul Reacia
GUS-int (EK) -glucoronidaza X-Gluc culoare albastr
Gal (PK) -galactozida X-Gal culoare albastr
Lac Z (PK) -galactozida Z-Gal culoare albastr
Luc luciferaza luciferina chemiluminiscen verde
GFP - - protein fluorescent verde

Markerul GFP s-a izolat de la medusa Aequoria vectoria, este cel mai modern, nu
omoar celula sau esutul pentru evideniere.

Markeri moleculari - sunt markeri genetici care pot marca prezenta unei gene la
nivelul ADN-ului.
Caracteristicile markerilor moleculari
1. pot fi obtinui n numr nelimitat, din orice esut, n orice etap de dezvoltare;
2. sunt independeni de expresia genic i nu sunt influenai de condiile de
mediu;
3. nu sunt supui presiunii de selecie;
4. de regul, nu prezint interaciuni nealelice (epistatice) i nu manifest
pleiotropie;
5. se transmit mendelian, simplu;
6. pot fi dominani, cnd nu se deosebesc heterozigoii de homozigoi sau
codominani, cnd se pot deosebi heterozigoii de ambii prini homozigoi.

Clasificarea markerilor moleculari
I.Markeri care permit evidenierea polimorfismului monolocus
1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism);
2. PCR (Polymerase Chain Reaction), cu urmtoarele tipuri:
CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences);
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism);
DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)
SSR (Simple Sequences Repeats) sau markeri ADN
microsatelit.

II.Markeri care permit evidenierea polimorfismului polilocus (la gene
diferite sau cromozomi diferii)
1. RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) cu urmtoarele tipuri:
DAF (DNA Amplified Fingerprinting)
AP PCR (Arbitrary Primed PCR)
2. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat)
3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism).


Markeri RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
Se bazeaza pe polimorfismul molecular al formelor parentale, la nivel allelic, in
ceea ce privete lungimea i numrul fragmentelor de restricie obinute prin digestia
enzimatic a ADN-lui genomal cu enzimede restricie (enzime care taie ADN-ul n
situsuri specifice).
Fragmentele de restricie se evideniaz n urma hibridrii moleculare cu o anumit
sond (sonda este o secven de ADN complementar genei care se dorete a fi
identificat). Dac sonda este radioactiv, hibrizii moleculari (fragmentele de restricie
pe care s-a fixat sonda) se relev prin autoradiografie.
Enzimele de restricie sunt codificate de gene plasmidiale i sunt specifice
anumitor specii i genuri bacteriene. O enzim de restricie recunoate la nivelul ADN-
ului un situs de restricie, la nivelul cruia poate produce tierea moleculei de ADN. n
urma tierii rezult capete monocatenare adezive 5 sau 3 i capete bonte. Situsul de
restricie poate fi reprezentat de 4, 6 sau 8 nucleotide (perechi de baze).
Simbolizarea enzimei de restricie se face cu prima liter a cuvntului ce
desemneaz genul, dou litere pentru specia bacterian.




Exemplu:
Eco R
1
Escherichia coli, plasmid R

- recunoate situsul 5 G A A T T C 3
3 __________ 5 (capete adezive)
C T T A A G





__ G 5 A A T T C
C T T A A 5 G



Hae III Haemophilus aegiptius III


- recunoate situsul 5 G G C C 3
3
____________
5 (capete bonte)
C C G G


Sma I Serratia marcescens

- recunoate situsul 5 C C C G G G 3
3 __________ 5 (capete bonte)
G G G C C C



Pst I Providentia stuarti


- recunoate situsul 5 C T G C A G 3
3 ___________ 5
G A C G T C
(monocatena 3 - 5)






Tehnica de lucru
- extractia ADN-ului;
- digestia ADN-ului genomal cu enzime de restrictie;
- separarea electroforetic prin migrare n gel de agaroz;
- depurinizarea ADN cu HCl 25 molar;
- denaturarea alcalin a ADN cu NaCl;
- transferul pe membrana prin capilaritate sau echipament cu vacuum;
- hibridarea moleculara cu o sonda radioactiva (un fragment de ADN complementa
genei pe care vrem sa o identificam)
Pozitia genelor se evidentiaza prin autoradiografie.

Markeri PCR (Polymerase Chain Reaction)
Marcarea PCR se bazeaza pe polimorfismul molecular la nivel alelic n ceea ce
priveste lungimea produsilor de amplificare obtinui prin primeri specifici,
complementari capetelor 3 ale secvenelor de ADN ce urmeaz a fi amplificate.
Produii de amplificare sunt separai electroforetic prin migrare n gel de
agaroz i sunt evideniai dup o colorare prealabil cu bromur de etidium n
ultraviolet.

3 5
_______________ Reacia PCR este un proces de replicare repetat
_______________
5 3
Tehnica de lucru
Amestecul de reacie pentru amplificare (25 l) are urmtoarele componente:
- tampon (Buffer) specific enzimei cu care se lucreaz;
- MgCl
2
(25 micromoli)

Amplificarea PCR se realizeaza prin utilizarea a doi primeri specifici,
complementari capetelor 3

a fragmentului ce urmeaza a fi amplificat. Amplificarea se

realizeaza cu ajutorul unui termocicler (un calculator) in cadrul a mai multor cicluri de
replicare. Fiecare ciclu are 3 segmente:
-denaturare
-fixare primer
-extensie
Pentru fixarea primerilor, temperatura se calculeaz astfel:
T
m
= 2
o
(A+T) + 4
o
(G+C),
unde A, T, G, C reprezint numrul de perechi de baze .
La marcarea PCR primerii au n jur de 20 perechi nucleotidice.
Produsii de amplificare sunt separati electroforetic in gel de agaroza si se evidentiaza
in lumina ultravioleta dupa o colorare cu bromura de etidiu.

Tipuri speciale de PCR
1. IPCR (inverted PCR) i APCR (ancored PCR) sunt tehnici care
permit amplificarea unor secvene necunoscute, plecnd de la o
secven cunoscut.
2. AsPCR (asimetric PCR) permite amplificarea unor secvene
monocatenare
Utilizarea marcrii PCR
a. Selecia asistat de markeri moleculari markerii PCR pot fi utilizai
deoarece permit genotiparea, adica stabilirea strii homo- sau heterozigote. n acest
sens exist trei tehnici: CAPS (RFLP = PCR), SSCP i DGGE.
b. Se poate utiliza pentru confirmarea existentei unei gene sau a confirmarii
naturii transgenice in urma transgenezei;
c. Se poate folosi n scop de diagnostic;
a. Se poate utiliza in criminalistica (testul ADN).

Markeri microsatelit (SSR Simple Sequence Repeats)

Secvenele microsatelit constituie repetiii n tandem ale unor fragmente ADN
scurte, de 1-4 perechi de baze. Cele mai frecvente repetiii sunt cele dinucleotidice , de
exemplu (CA)
n,
(CT)
n
, (AT)
n
, care se repet dup 30-100 kb. La plantele superioare,
secvena cel mai frecvent ntlnit este (AT)
n
. Polimorfismul microsateliilor este dat
de numrul de secvene nucleotidice care se repet.
n msura n care se cunoate ordinea nucleotidelor la secvenele nvecinate
microsateliilor, se pot concepe primeri specifici, care vor permite amplificarea
fragmentelor ADN, ce nglobeaz microsateliii. Variabilitatea markerilor microsatelit
se datoreaz diferenelor de lungime a fragmentelor ADN amplificate.
Markerii SSR sunt codominani, permind identificarea tuturor alelelor.


Markeri RAPD
Se bazeaza pe aceleasi principii ca si marcarea PCR, cu deosebirea ca pentru
amplificare se utilizeaza un singur primer decamer, care se gaseste la nivelul
genomului, randomizat, la un situs de fixare care sa-i permita realizarea amplificarii.
Produsii de amplificare urmeaza a fi separati in gel de agaroza si se evidentiaza in UV
dupa colorarea cu bromur de etidium. Produii de amplificare apar sub forma unor
benzi fluorescente n lumin UV. Pentru obinerea produilor de amplificare, condiia
esenial este ca primerii arbitrari s aib un coninut de guanin i citozin de cel
puin 50%.
Avantajele tehnicii RAPD
- nu pezint riscuri deoarece nu implic radioactivitatea;
- cantitatea de ADN necesar pentru caracterizare este relativ redus;
- permite diferenierea speciilor, a subspeciilor i a cultivarelor.
Dezavantaje
- produii de amplificare sunt n numr relativ redus;
- markerii RAPD sunt dominani;
- repetabilitatea metodei este relativ redus, fiind influenat de condiiile de
lucru i aparatura utilizat.


Utilizarea markerilor moleculari
In studiile de genetica markerii moleculari pot fi utilizati pentru cartarea genetica (harti
genetice), pentru izolarea si clonarea unor gene, in ameliorarea plantelor. Markerii moleculari
se pot utiliza pentru eficientizarea procesului de selectie MAS (marker assisted selection),
pentru reconsiderarea strategiilor de ameliorare, pentru maximizarea efectului heterozis,
protejarea noilor creatii, pentru evidentierea variabilitatii somaclonale si pentru confirmarea
hibrizilor somatici.
Pentru eficientizarea procesului de selectie este necesar atribuirea markerilor unor gene
de interes (stabilirea relatiilor de linkage intre marker si gena de interes). In aceste conditii se
poate face o ameliorare directa a caracterelor dorite pe baza urmaririi markerilor. In cazul
caracterelor cantitative, acestea pot fi descompuse in elemente componente QTL (Quantitative
Traits Loci), care se transmit mendelian. Dupa caracterizarea moleculara a parintilot si
determinarea QTL se pot allege parintii cei mai complementari, care sa asigure exprimarea la
maxim a caracterului dorit.
Reconsiderarea strategiilor de ameliorare se refera la posibilitatea aplicarii selectiei in
masa chiar pentru caracterele cu o heritabilitate scazuta.
Maximizarea heterozisului se bazeaza pe determinarea distantelor genetice la formele
parentale pe baza de markeri si alegerea parintilor cei mai diferiti.
Protectia noilor creatii poate fi asigurata ca urmare a faptului ca fiecare soi are o anumita
amprenta moleculara, care nu poate fi falsificata.



UTILIZAREA MARKERILOR MOLECULARI RFLP
N STUDIILE DE GENETIC I N AMELIORAREA PLANTELOR

Exist dou direcii de utilizare a markerilor moleculari RFLP n studiile de genetic:
1.cartarea genetic;
2. clonarea genelor.

1.Cartarea genetic
Markerii RFLP se pot obine n numr nelimitat. Fiecare marker este definit de o
anumit sond (se obin benzi de o anumit dimensiune). Localizarea sondelor n cadrul
grupelor de nlnuire se face pe baza unor analize genetice clasice, iar distana dintre gene se
exprim n centimorgan (cM).
Pentru ca o hart genetic s fie saturat, se apreciaz c distana dintre doi markeri
trebuie s fie de maxim 20 cM. (Ex. Genomul de porumb are 14000 cM; 14000:20=700 (sunt
necesari 700 markeri). Pentru a se putea realiza cartarea, markerii moleculari trebuie s fie
polimorfi, adic alelele s se poat evidenia. Prima dat se analizeaz polimorfismul formelor
parentale. Se apreciaz c n general la alogame polimorfismul este mai mare. Populaiile
segregante de cartare se obin n urma hibridrii intraspecifice. La autogame polimorfismul
este mai mic iar populaiile segregante de cartare se obin prin hibridri interspecifice.
Populaiile de cartare pot fi reprezentate de populaii segregante F
2
sau de populaii
testcross (backcross). Aceste populaii nu sunt stabile n descendena i n consecin ele
trebuie reconstituite prin:
a. menienrea populaiilor F
2
sau testcross prin multiplicare vegetativ;
b. crearea populaiilor RI (Recombinant Inbreed). Populaiile RI se obin prin
autopolenizare i selecie individual timp de mai multe generaii.
2..Clonarea genelor cu ajutorul markerilor RFLP
Pentru clonarea genelor este necesar o form mutant a genei ce urmeaz a fi clonat,
ce poate fi complementat de forma ei slbatic. Este de asemenea necesar stabilirea
relaiilor de nlnuire ntre gena de clonat i diferii markeri genetici. Se alege markerul
genetic cel mai apropiat (n cM).



Marker RFLP gena ce urmeaz a fi clonat

_____X__________________ _________________

Sonda ce definete acest marker este utilizat n cadrul unui proces de hibridare
molecular a unei bnci de gene de tip YAC (Yeast Artificial Chromosome cromozom
artificial de drojdie). Sonda ce definete markerul este folosit n contextul unei hibridri
moleculare ce permite identificarea clonei YAC A. Captul clonei este decupat, markat i
utilizat ca sond pentru identificarea clonei YAC B. Captul clonei YAC B este decupat,
markat i utilizat ca sind pentru identificarea clonei YAC C (tehnica Chromosome Walking
sau Map Based Cloning). Pentru a stabili care sond poart gena de interes se apeleaz la
testul de complementaritate, adic utilizarea clonelor pe rnd, n contextul transformrii
genetice.
Dac la forma transformat genetic se restaureaz fenotipul slbatic dominant, rezult
ca, clona respectiv (YAC C) poart gena de interes.
Utilizarea markerilor moleculari RFLP n ameliorarea plantelor
Direcii de utilizare:
1. selecia asistat de markeri moleculari (MAS);
2. reconsiderarea strategiilor de ameliorare;
3. maximizarea heterozisului;
4. protecia noilor creaii.


1. Selecia asistat de markeri moleculari
Markerii moleculari permit selecia mai eficient a recombinrilor utile, ameliorarea
pierzndu-i caracterul probabilistic.
n cazul caracterelor calitative, dac se constat existena unor nlnuiri strnse ntre
un anumit marker i o gen util, se poate face selecie indirect eficient, pe baz de markeri
moleculari, viznd ameliorarea nsuirii controlate de gena cu care markerul este nlnuit.
Avantajul utilizrii markerilor moleculari este c acetia nu sunt influenai de condiiile de
mediu.
Caracterele cantitative (care au un determinism poligenic) pot fi descompuse n
elementele componente, numite QTL (Quantitative Trait Loci).
Cum se procedeaz?
O populaie segregant F
2
este caracterizat molecular pentru mai muli markeri.
Indivizii sunt n acelai timp msurai n privina exprimrii caracterului respectiv. Pentru
fiecare marker se face o grupare a indivizilor pe genotipuri fomozigote i heterozigote.
Eficiena seleciei depinde de distana dintre marker i QTL i de msura n care
caracterul cantitativ este definit de markerul molecular.
2. Reconsiderarea strategiilor de ameliorare
n ameliorarea clasic a plantelor exist dou metode de baz: a. selecia n mas
bazat doar pe selecia fenotipic, fr verificarea elitelor n descenden i b. selecia
individual genotipic, care presupune verificarea valorii elitelor n descenden. Selecia n
mas este foarte eficient, necesit un timp mai scurt dar poate fi aplicat numai pentru
caracterele cu un coeficient de heritabilitate (h
2
) ridicat. La caracterele cu un coeficient de
heritabilitate sczut se recomand selecia individual genotipic.
Selecia clasic n mas sau individual se dovedete eficient mai ales pentru
caracterele controlate de gene cu efecte aditive semnificative (a
2
).
n cazul markerilor moleculari, acetia nefiind influenai de mediu, heritabilitatea este
100%. n acest caz, se poate face selecia i pentru caractere cu heritabilitate sczut i
aditivitate redus.
3. Maximizarea heterozisului
Maximizarea heterozisului se bazeaza pe determinarea distantelor genetice la formele
parentale pe baza de markeri si alegerea parintilor cei mai diferiti. Sporirea efectului heterozis
implic determinarea distanelor genetice ntre diferitele forme, pe baza analizei unor profiluri
electroforetice multilocus numite fingerprint (mai multe benzi electroforetice). Pentru a obine
astfel de profile se utilizeaz un tip particular de sonde sonde ADN mitocondrial i sonde
ADN-minisatelit.
ADN-ul mitocondrial este puternic variabil, de dimensiune foarte variabil, dar totui
caracteristic unei specii.
Profil electroforetic asemntor = distane mici;
Profil electroforetic diferit = distane mari.
4. Protecia noilor creaii
Fiecare soi are amprenta sa genetic, un anumit profil electroforetic de tip fingerprint,
care nu poate fi modificat.