Sunteți pe pagina 1din 58

BIOCOMPATIBILITATE

LP 2

Scopul testelor de biocompatibilitate

Scopul testelor de biocompatibilitate este de a determina capacitatea de utilizare a unui dispozitiv pentru uz uman, și pentru a vedea dacă utilizarea dispozitivului respectiv poate sau nu avea un potențial efect fiziologic nedorit.

Conform Organizației Internaționale de Standarde: scopul principal al ISO 10993 este de a proteja oamenii de potențiale riscuri biologice ce pot provenii de la utilizarea dispozitivelor medicale”.

procesul de determinare a biocompatibilității unui dispozitiv medical 2. evaluare prin teste in 1. achiziționarea
procesul de determinare a biocompatibilității
unui dispozitiv medical
2. evaluare prin teste in
1. achiziționarea de date
3. confirmare din partea
cu privire la materialele
studiilor realizate in vivo
din care sunt realizate
dispozitivele medicale
vitro (de cele mai multe
ori se realizează doar pe
anumite părți componente
ale unui dispozitiv
care vor fi realizate pe
întreg dispozitivul.
medicale, și nu pe întreg
dispozitivul medical),

Pregatirea probelor

Pregatirea probelor
• •CULTURI DE CELULE ANIMALE SI UMANE
•CULTURI DE CELULE ANIMALE SI UMANE

Introducere

Tehnica cultivarii celulelor - proces complex in care celulele cresc in afara

tesutului (in vitro) in conditii de laborator strict controlate: asepsie, sterilitate,

temperatura, gaze si presiune optimizate.

Exista culturi de celule umane, din animale, plante, fungi si microbi, incluzand

- virusuri, bacterii si protista (grupa diversa de microorganisme eucariote)

Limite:

este necesara o expertiza speciala,

poate avea loc contaminarea

chimica,

biologica,

cross-contaminare,

echipamente si reactivi scumpi,

plastice de unica folosinta

Introducere

Avantaje:

diminueaza sacrificarea animalelor,

permite optimizarea cresterii in conditiile controlului mediului extracelular,

Dezavantaje:

dispar interactiile cu mediul in vivo, poate avea loc productia :

proteine nedorite datorita de-diferentierii celulelor

Scopul:

tehnologie indispensabila,

studiul reglarii proliferarii celulare, diferentierii

si formarii unor produsi in conditii controlate, disecarea cailor de semnalizare care regleaza expresia genica

Termeni

Generatie (numarul de/timpul de): numarul de dedublari pe care le

sufera o populatie celulara/ timpul in care o celula parentala se divide in 2 celule fiice

Proliferare: cresterea numarului de celule de acelasi tip

Celula nediferentiata: celula imatura, primitiva, ce nu a dobandit o structura si o functie speciala

Diferentiere: proces prin care dintr-o celula generica se dezvolta un tip celular specific ca raspuns la semnale specifice

De-diferentiere: proces celular in care o celula diferentiata pierde forma si functia ei speciala si revine la un stadiu de dezvoltare anterior

Cultura de organ: cultivarea unui tesut nativ pentru a retine majoritatea caracteristicilor histologice in vivo

Cultura histolitica: cultivarea celulelor in vederea reagregarii lor pentru a

forma o structura similara unui tesut

ISTORIC

In secolul 19, fiziologul englez Sydney Ringer a preparat solutii saline ce contin cloruri de Na, K, Ca si Mg ce mentin in stare viabila cordul unui animal

izolat din corp.

In 1885 Wilhelm Roux a indeparat o portiune din placa medulara a unui embrion de pui de gaina si a mentinut-o in stare viabila cateva zile intr-o solutie salina calda punand bazele culturii de tesut.

Ross Granville Harrison care a lucrat la Johns Hopkins Medical School si apoi la Yale University a publicat rezultatele experimentelor lui din anii 1907- 1910 punand bazele metodologiei culturii de tesuturi.

Tehnicile culturii celulare au avansat semnificativ in anii 1940 - 1950 pentru a

suporta cercetarile de virologie. Virusurile crescute in culturi de celule permit fabricarea de vaccinuri. Polio-vaccinul injectabil - primul vaccin produs in masa utilizand tehnicile culturii celulare (1952).

Acest vaccin a stimulat cercetarile lui John Franklin Enders, Thomas Huckle

Weller si Frederick Chapman Robbins care au primit premiul Nobel (1954) pentru dezvoltarea unor metode de crestere a virusurilor in culturi de celule renale de maimuta.

Izolarea celulelor

Celulele pot fi izolate din tesuturi pentru a se obtine culturi ex vivo prin mai multe metode.

Din tesuturile moi se pot obtine culturi celulare prin doua metode:

digestie enzimatica

si tehnica explantului.

In prima metoda celulele pot fi eliberate din tesuturile moi prin digestia ECM cu enzime: colagenaza, tripsina sau pronaza.

In a doua metoda, piese de tesut sunt plasate in mediul de crestere, cand celulele ies din tesut si cresc in mediul de cultura.

Tehnica explantului

tesut sunt plasate in mediul de crestere, cand celulele ies din tesut si cresc in mediul

Culturi de celule aderente sau in suspensie

Un numar mare de tipuri celulare, plasate intr-un vas de cultura si intr-un mediu adecvat, adera la peretii interiori ai vasului creand o

cultura de celule aderente.

Majoritatea celulelor derivate din tesuturi solide sunt aderente si cresc in culturi bi-dimensionale (in monostrat).

aderente si cresc in culturi bi-dimensionale (in monostrat). • Culturi celulare in suspensie culturile derivate din
aderente si cresc in culturi bi-dimensionale (in monostrat). • Culturi celulare in suspensie culturile derivate din

Culturi celulare in suspensie culturile derivate din sange (ex.

limfocitele) cresc in suspensie multe celule canceroase -linii

celulare ( accesibile comercial) - adaptate sa creasca in pentru a se obtine suspensie concentratii mai mari de celule. - culturile de celule de insecte necesita agitare pentru omogenizarea mediului

Cultura primara

Culturile de celule izolate direct dintr-un tesut

Caracteristici

O cultura primara reprezinta o populatie heterogena de celule;

in conditiile concrete de cultivare unele celule vor muri,

altele vor creste lent,

iar altele vor creste rapid constituind tipul dominant de celule.

In timp, celulele vor creste pana cand vor umple suprafata disponibila (stare de confluenta) cand apare inhibitia de contact. In acel moment incepe pasarea culturii prin care se va realiza purificarea celulelor din cultura.

Celulele culturilor primare au o viata limitata (exceptie culturi de celule derivate de la tumori). Dupa un numar de dedublari a populatiei celulare (limita Hayflick), celulele sufera un proces de senescenta, diviziunea inceteaza, iar celulele mai ramin vii o perioada de timp.

Exista celule (macrofagele si neuronii) care nu se divid in vitro si pot exista numai ca niste culturi primare

Mentinerea celulelor in cultura

Celulele sunt mentinute in cultura intr-un incubator care pastreaza constanta temperatura, umiditatea, amestecul gazos (comun, 37 o C, 5% CO 2 , celule mamaliene).

Conditiile de cultivare variaza mult de la un tip celular la altul, in functie de fenotipul exprimat.

Celulele sunt mentinute in stare viabila intr-un mediu de crestere a carui compozitie variaza cu tipul celular. De regula un mediu de crestere contine substante nutritive, glucoza, factori de crestere, un anumit pH. Cea mai comuna sursa de factori de crestere este serul fetal de vitel.

Celulele cresc in recipiente speciale, sterilizate: flascuri, placi Petri, placi multi-well de diferite dimensiuni si volume.

Plating density PD (nr celule/volum mediu cultura) joaca un rol critic in evolutia

culturii.

Fenotip orice caracteristica observabila la un organism (morfologica, biochimica

Factor de crestere o substanta naturala capabila de a stimula cresterea, proliferarea si diferentierea celulara (de regula un hormon)

)

Suporturi cu suprafete biomimetice

Celulele aderente necesita o suprafata pe care sa se ancoreze in vitro (sticla, plastic, metale).

Recipientele de sticla slide-uri, tuburi, flascuri, usor de spalat si sterilizat, permit observarea microscopica a culturii; sticla fabricata de aluminoborosilicat (Pyrex) este preferata sticlei obisnuite care elibereaza ioni alcalini in mediu.

Recipientele de plastic (polistiren,

polietilena, policarbonat policlorura de vinil, teflon, etc) nu sunt autoclavabile (unica folosinta).

vinil, teflon, etc) nu sunt autoclavabile (unica folosinta). In scopul imbunatatirii performantelor in atasarea celulara,

In scopul imbunatatirii performantelor in atasarea

celulara, formarea unor suprafete biomimetice,

suprafetele interne ale flascurilor de cultura au fost acoperite cu proteine : componente ale ECM (colagen, laminina si fibronectina), mucopolizaharide (heparin sulfat, hialuronat, condroitin sulfat) sau polimeri sintetici bazici ca

poli-D-lizina

mucopolizaharide (heparin sulfat, hialuronat, condroitin sulfat) sau polimeri sintetici bazici ca poli-D-lizina

Mediul de cultura si schimbarea lui

Sute de medii de cultura

Ex.

Mediul bazal EMEM (Eagle's minimal essential medium) este un mediu pentru multe tipuri celulare

Mediul DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium) contine aminoacizi (in special glutamina), vitamine, glucoza, sisteme tampon pH, indicator de pH (Phenol red), etc permite cresterea multor tipuri de celule conjunctive, poate fi suplimentat specific cu hormoni, factori de crestere (ser) viata limitata, filtrat steril, diluat steril firme producatoare de medii de cultura.

In cazul culturilor aderente, mediul trebuie schimbat: indeparat direct prin aspirare si inlocuit cu mediu proaspat

••10/23/201210/23/2012
••10/23/201210/23/2012

Culturile celulare sunt inspectate zilnic la un microscop in contrast de faza la care este adaptat un aparat de fotografiat

Curba de crestere a celulelor in cultura.

Variatia densitatii celulare cu timpul cultivarii are un aspect semi-logaritmic.

celulare cu timpul cultivarii are un aspect semi-logaritmic. • 10/23/2012 1. Faza lag - prima faza

10/23/2012

1.

Faza lag - prima faza a cresterii dupa

insamantarea celulelor, de crestere lenta cand celulele se adapteaza la mediul de cultura.

2.

Faza log (logaritmica) in care celulele prolifereaza exponential si consuma substantele nutritive din mediul de crestere.

3.

Faza platou (stationara) componentele nutritive au fost epuizate sau celulele au ocupat toata suprafata accesibila (strat monocelular) celulele intra in ultima faza, cand proliferarea este redusa sau inceteaza

Manipularea culturilor de celule

Deoarece celulele continua sa se divida in cultura, ele cresc si umplu toata suprafata (volumul) accesibila (celulele ajung la confluenta)

In cursul acestui proces au loc:

- diminuarea nivelului substantelor nutritive din mediu (scade

pH mediului, indicator de pH):

contactele celula-celula stopeaza ciclul celularinhibitie de contact; pot apare procese de diferentiere, senescenta acumularea de celule apoptotice/ necrotice.

Printre cele mai comune manipulari: schimbarea mediului, pasarea celulelor si transfectia lor toate realizate in conditii sterile, pentru a evita contaminarea

Pentru realizarea conditiilor sterile: Introducerea de antibiotice (penicilina, streptomicina) si antifungice

(amphotericin B) in mediul de cultura

10/23/2012

•- •monostratconfluenta
•-
•monostratconfluenta
• •Hota cu flux laminar
•Hota cu flux laminar

Pasarea celulelor

Subcultivarea celulelordin cultura primara permite celulelor sa traiasca in cultura pentru perioade mai lungi de timp, evitandu-se senescenta

Exemplu: Pasajul incepe cu un flasc care contine un volum de 12 ml mediu care contine celule la 80-90 % confluenta (sunt

aderate pe peretele bazal al flascului.

Celulele sunt desprinse

peretele

flascului de regula prin tratament cu un amestec tripsina-EDTA

de

pe

de regula prin tratament cu un amestec tripsina-EDTA de pe Suspensia celulara este repartizata in volume

Suspensia celulara este repartizata in volume egale in alte 3 flascuri de cultura/placi Petri si se aduce la volumul de 12 ml cu mediu proaspat.

Cele trei flascuri noi sunt plasate in incubatorul de celule (37 o C, 80 % umiditate, 5 % CO 2 ) si incubate pana cand celulele ajung din nou la confluenta

Cultura secundara o cultura care deriva dintr-o cultura primara, ce a suferit cel putin un

Cultura secundara

o cultura care deriva dintr-o cultura primara, ce a suferit cel putin un pasaj

Majoritatea celulelor din culturi secundare se divid de un numar finit de ori, dupa care mor.

Pe masura ce purificarea tipului celular determinant, dar apar si modificari morfologice si functionale caretrebuie sa fie monitorizate pentru succesul unui experiment de inginerie tisulara .

Senescenta celulara este caracterizata in primul rand prin scaderea capacitatii proliferative a celulelor. Ex. culturile de fibroblaste din derma umana .

Dupa un numar limitat de diviziuni celulare (30-50 cicluri, daca celulele sunt izolate din pielea unui adult tanar) scade treptat viteza cresterii si proliferarii celulare .

Activitatea chemotactica a fibro - blastelor scade progresiv dupa pasajul 25. Culturile de fibroblaste destinate vinde- carii ulcerelor venoase nu dau randamente bune daca sunt folosite la pasaje prea mari (> 5).

Culturi de celule canceroase

Celulele canceroase (si celulele transformate):

cresc mai usor si intr-un mediu mai simplu decat celulele normale;

nu

celulele continua sa se divide si sa formeze structuri multistratificate;

prolifereaza nedefinit (nemuritoare).

prezinta

inhibitie

de

contact;

odata

ce

suprafata

discului

este

acoperita,

Ex. Celulele HeLa cea mai veche linie celulara, separata in 1951 dintr-o tumora canceroasa (carcinom cervical) a colului uterin, de la o femeie Henrietta Lacks de 31 ani, utilizata si astazi in toate tarile lumii.

Lacks de 31 ani, utilizata si astazi in toate tarile lumii. Celulele HeLa sunt aderente si

Celulele HeLa sunt aderente si nu prezinta inhibitie de contact

Transfectia

introducere deliberata a acizilor nucleici (DNA si RNA) in celule, in scopul exprimarii unei proteine de interes tehnica presupune deschiderea temporara a unor pori in membrana celulelor prin diferite metode, pentru asimilarea materialului genetic.

diferite metode, pentru asimilarea materialului genetic. -o tehnica este si lipofectia care utilizeaza lipozomi ce

-o tehnica este si lipofectia care utilizeaza lipozomi

ce poarta DNA, fuzioneaza cu membrana

celulelor şi permite transformarea celulei.

Aplicatii: biosinteza unor anumite proteine (ex. productia de insulina), strategii de terapie genica, generarea de organisme transgenice, etc.

Un organism transgenic modficat cu materialul genetic al altei specii, modificarea este transmisa generatiilor viitoare

Linii celulare

Linii celulare • Culturile celulare pot fi finite sau continuui. • O cultura celulara finita este

Culturile celulare pot fi finite sau continuui.

O cultura celulara finita este capabila de un numar limitat de dublari ale populatiei dupa care

proliferarea celulara inceteaza.

O cultura celulara continua are celule capabile de un numar nelimitat de dublari ale populatiei, deci este o cultura de celule imortalizate.

Liniile celulare formeaza culturi celulare continuui, care nu prezinta inhibitia de contact, prolifereaza nedefinit si devin imortalizate, se formeaza din culturi primare prin procedee complicate.

Unele specii, ca rozatoarele dau nastere usor unor linii celulare, in timp ce altele dau nastere greu (tesuturile umane) sau deloc (tesuturile aviane) unor linii celulare.

liniile celulare umane sunt controversate din punct de vedere bioetic, este necesar acordul pacientilor de la care se recolteaza piese din corpul lor pentru cercetari stiintifice

• Firme producatoare de linii celulare stabilizate • American Type Culture Collection (ATCC), • European

Firme producatoare de linii celulare stabilizate

American Type Culture Collection (ATCC),

European Collection of Cell Cultures (ECACC), German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) etc

DSMZ realizeaza urmatoarele activitati:

achizitia de linii celulare

controlul identitatii si calitatii

expansiunea celulelor

caracterizarea celulelor

conservarea prin congelare in azot lichid

stocarea celulelor in vials

colectarea datelor relevante in banci de date

distributia liniilor celulare la cerere

cercetari

colectarea datelor relevante in banci de date • distributia liniilor celulare la cerere • cercetari

Culturi celulare 2-D si 3-D

Culturile celulare aderente, primare si secundare, sunt culturi bi- dimensionale care cresc intr-un monostrat de celule.

bi- dimensionale care cresc intr-un monostrat de celule. Culturile 2-D pot fi insamantate pe/ in suporturi

Culturile 2-D pot fi insamantate pe/ in suporturi 3-D poroase si pot forma culturi 3-D.

Ex.hidrogelurile sunt geluri sintetice 3-D ce pot fi utilizate in culturi 3-D pentru a mima structura ECM, cu aplicatii deosebite in ingineria tisulara

Prevenirea contaminarii

Contaminare chimica (medii, ser) cu ioni metalici, endotoxine; impuritati din gazele

incubatoarelor cu CO 2 , reziduri (germicide, pesticide) de la dezinfectarea echipamentelor, detergenti de la spalarea sticlariei, etc

Contaminarea biologica: bacterii, fungi, drojdii. Mycoplasma

Preventietehnici aseptice , facilitati de spalare si sterilizare , arii sterile, antibiotice , apa sterila , etc personal instruit si autorizat

, facilitati de spalare si sterilizare , arii sterile, antibiotice , apa sterila , etc personal
, facilitati de spalare si sterilizare , arii sterile, antibiotice , apa sterila , etc personal
•Sterile work area
•Sterile work area
• •Facilitati de sterilizare
•Facilitati de sterilizare
•Sistem de purificare a •apei si de obtinere a apei ultrapure Millie-Q •Distilare, osmoza inversa,
•Sistem de purificare a
•apei si de obtinere a
apei ultrapure Millie-Q
•Distilare, osmoza inversa, nanofiltrare
• •Crioconservarea culturilor celulare •Camera frigorifica Deep-freezer •Congelate pentru stocare in faza de
•Crioconservarea culturilor celulare
•Camera frigorifica Deep-freezer
•Congelate pentru stocare in faza de crestere in mediu + dimetilsulfoxid

Cross- contaminarea liniilor celulare

Cross

deosebite pentru acuratetea cercetarii in fdomeniu

contaminarea

co-prezenta

unui

alt

tip

celular,

problema

Problema a fost detectata la liniile celulare utilizate curent in studii de screening a unor medicamente.

Companiile trebuie sa prezinte la livrare buletine de analiza a cross-

contaminarii. In momentul de fata ATCC utilizeaza tehnica short tandem repeat (STR) DNA fingerprinting pentru autentificarea liniilor celulare.

Mai mult, verificarea unei linii celulare trebuie realizata si in

laboratoarele de cercetare dupa dezghetarea stocurilor de linii celulare, la

fiecare doua luni in timpul tehnologiei de cultivare si inainte de publicare a datelor experimentale.

Alte metode de analiza a cross-contaminarii: tiparea HLA (human lymphocyte antigen), analiza cromozomiala, kariotiparea, etc

•Evaluarea cantitativa a celulelor in cultura •Metodele directe: evaluarea numarului celulelor •Lama de numarare,
•Evaluarea cantitativa a celulelor in cultura
•Metodele directe: evaluarea numarului celulelor
•Lama de numarare, microscop in contrast de faza
•Counter electronic Coulter
•Metode indirecte: evaluarea continutului in DNA, proteine
•Determinarea viabilitatii celulare
•Eliberarea LDH in mediu

Aplicatii

1. Sisteme model:studii fundamentale privind inter-relatiile dintre celule si

boli, efectele unor medicamente, procesul de imbatranire

2. Cercetarea cancerului: studiul diferentelor dintre o celula normala

si o celula canceroasa, transformarea unei celule normale utilizand radiatii, substante chimice si virusuri, mecanisme care conduc la

tranformarea maligna, medicamente care distrug celulele canceroase, etc

3. Virologie: culturile de celule animale sunt utilizate pentru a replica virusurile pentru productia de vaccinuri, pentru a detecta si izola

virusuri, pentru a studia cresterea si ciclul de dezvoltare a virusurilor,

studiul mecanismelor de infectie, etc

4. Testarea toxicitatii: studiul efectelor noilor medicamente, cosmetice

asupra supravietuirii, cresterii unor tipuri celulare, dozarea cantitatii maxime

permise Productia de vaccinuri: polio, rabie, varicela, pojar, hepatita B

Productia de proteine prin inginerie genetica: anticorpi

monoclonali, insulina si alti hormoni

Aplicatii

5.Inlocuiri de tesuturi sau organe: piele artificiala pentru vindecarea ulcerelor metabolice si a arsurilor

6.Consiliere genetica: cultura de celule fetale extrase de la o femeie gravida permite evidentierea unor anomalii cromozomiale, detectarea timpurie a unor maladii fetale

7.Inginerie genetica: culturile de celulele animale pot fi utilizate pentru introducerea unui nou material genetic in celule si studiul expresiei noilor genesi efectul lor asupra sanatatii celulei

8.Terapie genica: culturile de celule animale pot fi modificate genetic pt a fi utilizate in terapia genica. Sunt indepartate celule de la un pacient caruia ii lipseste o gena functionala. In celula se corecteaza defectul genetic, noile celule se cultiva si sunt transplantate la pacient.

•Cultura si ingineria tisulara •Culturile de celule – componenta fundamentala a ingineriei tisulare •–
•Cultura si ingineria tisulara
•Culturile de celule – componenta fundamentala a ingineriei tisulare
•– “intelegerea principiilor cresterii tesuturilor si aplicarea lor pentru ameliorarea
•sau inlocuirea unor tesuturi”
•Aplicatii: ficat bioartificial (hepatocitele viabile), pancreas artificial
•(celule insulare care produc si regleaza productia de insulina la diabetici, vezi-
•ca biliara artificiala , tesut cartilagi-
•nos •( reparare cartilaj genunchi ),
•piele •artificiala ( celule din pielea
•umana •crescute in gel de cola -
•gen), •maduva osoasa artificiala

Alogenice: organismele donor si

receptor apartin aceleasi specii

organismele donor si receptor apartin aceleasi specii • Autoloage: organismul donor este acelasi cu cel

Autoloage: organismul donor este acelasi cu cel acceptor

Autoloage: organismul donor este acelasi cu cel acceptor •celule • celule stem Singenice sau isogenice:
•celule
•celule

celule stem

donor este acelasi cu cel acceptor •celule • celule stem Singenice sau isogenice: organismele donor si

Singenice sau isogenice:

organismele donor si receptor sunt genetic identice

Xenogenice : celule izolate de la organisme donor din alte specii

decat organismul receptor

•Strategii in terapia unor defecte tisulare: 1. celule singure; 2. scaffold singur; 3. Culturi celulare
•Strategii in terapia unor defecte tisulare:
1. celule singure;
2. scaffold singur;
3. Culturi celulare 3-D in scaffold – in prezenta
•unor factori de crestere
•Probleme majore
•Studiul efectelor unor factori de mediu si
•Sursa celulara: celule mature, progenitor
celule stem – din tesuturi umane
a
conditiilor de cultivare asupra cresterii
si
diferentierii celulare
•Dezvoltarea de noi biomateriale 3-D cu diferite
arhitecturi si compozitii bazate pe compusi sin-
tetici sau naturali ce permit atasarea, cresterea si
diferentierea celulelor
•Indepartarea gradata a
biomaterialului si inlocuirea lui
cu tesutul regenerat, functional
• •Culturi de celule stem •Celulele stem pot fi cultivate intr-un mediu artificial si transformate
•Culturi de celule stem
•Celulele stem pot fi cultivate intr-un mediu artificial si transformate
(diferentiate) la tipul celular dorit

Izolarea MSC

In stroma BM 2-5 celule stem MSC la 1 milion de celule nucleate cu rol crucial in formarea si regenerarea stromei BM

Materialul start alicote de BM obtinute de la donori sanatosi ce sufera aspirarea BM pentru transplantul maduvei alogenice (donor similar genetic, dar nu identic)

hMSCs pot fi izolate dintr-un monostrat dupa separarea BM prin centrifugare in gradient de densitate. Dupa insamantare, la mica densitate, intr-un mediu bazal suplimentat cu 10 % ser fetal bovin (FBS), populatia celulara aderata la plastic reprezinta sursa ex vivo primara de MSC

Analiza la microscopul optic sau in contrast de faza arata o populatie de celule MSC relativ omogena cu un fenotip tip fibroblastic

Dupa subcultivare, MSC manifesta un inalt potential expansiv si variabil. Unele preparate MSC sufera peste 15 dedublari celulare, altele isi inceteaza replicarea dupa maximum 4 dedublari diferente datorate numarului mic de MSC in BM, varsta, alte particularitati ale donorului

MSC human multipotent mesenchymal stromal cells

ISCT (International Society for Cellular Therapy) recomanda utilizarea termenului de Multipotent mesenchymal stromal cells pentru acronimul MSC daca celulele respective indeplinesc urmatoarele criterii:

daca celulele respective indeplinesc urmatoarele criterii: 1. Adera pe vase de plastic in conditii de cultura
daca celulele respective indeplinesc urmatoarele criterii: 1. Adera pe vase de plastic in conditii de cultura

1. Adera pe vase de plastic in conditii de cultura standard

3. Potential de diferentiere multipotent in vitro in osteoblaste,

adipocite, condrocite

2. Exprima specific antigene pe suprafata celulei

Pozitiv > 95 % Negativ < 2 %

CD105, CD73, CD90 CD79sau CD19, HLA-DR CD45, CD34, CD14 sau CD11b

Antigene

substante capabile, in conditii adecvate, de a induce un raspuns imun specific si de a reactiona cu produsii acestui raspuns, anticorpii

determinant antigenic - portiunea din moleculele proteice sau polizaharidice care se combina cu anticorpul

proteice sau polizaharidice care se combina cu anticorpul Antigenele CD ( Cluster of Differentiation ) ,

Antigenele CD (Cluster of Differentiation), exprimate de leucocite, markeri de pe suprafata celulelor, utilizati in distingerea unor linii celulare (cell lineages), a stadiilor de dezvoltare, identificati cu anti-corpi monoclonali specifici

Antigenele

CD

pot

fi

receptori,

glicani,

molecule

de

adeziune,

enzime

legate

la

membrana

Criterii pentru demonstrarea MSC umane (Dominici et al., 2006)

1. MSC trebuie sa fie celule care adera la plastic cand sunt mentinute in

conditii de cultura standard (numai un subset de MSC isi mentin aceasta

proprietate)

2. > 95 % din populatia MSC trebuie sa exprime CD105 (endoglin,

recunoscut initial de MAb SH2), CD73 (ecto 5-nucleotidaza recunoscuta initial de

MAb SH3 si SH4) si CD90 (numit si Thy-1) evaluate prin flow citometrie; in contrast cu celulele stem hematopoietice MSC trebuie sa piarda expresia unor antigene hematopoietice CD45, CD34, CD14 (CD11b), CD79  (CD19) si HLA clasa II (< 2 % pozitive)

3. Celulele se pot diferentia in osteoblaste, adipocite si condroblaste in conditii standard de diferentiere in vitro (formarea osteoblastelor demonstrata prin colorare cu Alizarin Red sau von Kossa; diferentierea

adipocitelor colorare cu Oil Red O; diferentierea condroblastelor colorare cu Alcian blue sau imunohisto pentru colagen tip II

•Detectia fluorescentei la un flow-citometru dupa sortarea celulelor •Flow ctometria permite studiul unei singure
•Detectia fluorescentei la
un flow-citometru dupa
sortarea celulelor
•Flow ctometria permite studiul unei singure celule, sortata pe baza unor
caracteristice fizice, biochimice si antigenice, prin masuratori de fluorerscenta

Identificarea mai multor markeri prezenti pe suprafata celulei

demonstreaza existenta unui tip celular stem si permite chiar izolarea lui

dintr-o populatie celulara heterogena

Se observa diferente in expresia antigenelor de pe suprafata celulara

Intre celulele umane si celulele unor specii animale

Intre tipurile de tesuturi la aceeasi specie (om) cu metoda de izolare si cultivare pe parcursul pasajelor initiale in schitele de expresie in vitro si in vivo

Fenotiparea celulelor pe baza studiului unui numar mare de markeri de suprafata - garantia rezultatelor unei cercetari pe MSCs

Alte surse de MSC

Celulele MSC au fost identificate si in alte tesuturi ale organismului adult:

sangele periferic, periost, tesuturi muscular, adipos si cartilaginos, in

plamani, sistemul nervos centrral, ficat, splina, timus, pulpa dentara, placenta,

etc, s-a demonstrat capacitatea acestor celule de a se diferentia in alte linii celulare decat cele mezenchimale (hepatocite, celule renale, astrocite) ceea ce ridica probleme de nomenclatura.

Izolarea si utilizarea acestror probleme nu ridica probleme etice sau de

tumorigenicitate ca CS embrionare, dand sperante utilizarii lor in terapia unor maladii

Celulele stem pot parasi tesutul de origine (niche) si pot circula in fluxul sangvin,

unde gasim atat MSC cat si HSC

In tesuturile fetale frecventa MSC este mai mare decat in tesuturile adulte, izolate din in primul trimestru (sangele, ficatul, BM fetala) si din plamani in al doilea trimestru

Fluidul amniotic (al 2-lea trimestru) - o sursa bogata in MSCs fetale ce manifesta un fenotip si un potential de diferentiere similar cu cel al MSC izolate postnatal din BM utilizate terapeutic.

Diferentierea in vitro a MSCs

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in osteoblaste - incubarea unui monostrat confluent de MSCs cu acid ascorbic, β-glicerofosfat si dexametasone timp de 23 saptamani. MSCs formeaza noduli de tesut osos ( colorati cu Alizarin Red si prin tehnica von Kossa ), are loc cresterea expresiei fosfatazei alcaline (FA) si a acumularii de calciu indici ai osteogenezei. Investigarea BMP (bone morphogenic proteins) indice al osteogenezei.

( bone morphogenic proteins ) – indice al osteogenezei. A) RT-PCR pentru osteo-calcina si f os

A) RT-PCR pentru osteo-calcina si f os f at aza alcalina (FA);

B) Colorarea cu Alizarin Red a depo-zitelor de fosfat de Ca produse de osteoblastele diferentiate;

C) colorarea pentru FA in culturi deMSC si respectiv osteoblaste

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in adipocite consta in incubarea culturilor de MSC cu dexametasona, insulina, isobutil metil xantina si indometacin.

Acumularea de vacuole pline cu lipide se monitorizeaza fie la microscopul optic, fie prin colorare cu Oil Red

Metoda clasica de diferentiere a MSCs in condrocite consta in centrifugarea MSCs, cultivarea micromasei sedimentate in prezenta TGF-β (transforming growth factor-β).

Peletul celular se dezvolta intr-o forma multistratificata, bogata in matrice, motiv

pentru care diferentierea este monitorizata histologic prin colorare cu toluidine blue sau Safranin-O, care indica abundenta glicozaminoglicanilor in matricea extracerlulara si productia colagenului tip II, tipic cartilajului articular (imunocolorare).

tip II, tipic cartilajului articular (imunocolorare). Diferentierea hMSCs in vitro : condro • genica (A) -

Diferentierea hMSCs in vitro: condro

genica (A) - colorare imuno pt colagen

II; osteogenica (B) colorare Kossa;

adipogenica (C-H) colorare Red Oil

Proprietatile diferite ale sistemelor hematopoietic si stromal

Sistemul hematopoietic

Sistemul stromal din BM

Celulele stem ce se reinoiesc continuu

Se formeaza continuu

Celule stem

(nu se reinoiesc continuu in mod necesar)

Se formeaza la anumite perioade de timp

Faza fluida

Faza solida

Viata scurta

Viata lunga

Structuri simple ( unicelulare , fara matrice)

Fenotip inflexibil

Structuri complexe (multicelulara , legate la matrice)

Fenotip plastic

BM bone marrow

•• 10/23/201210/23/2012 • APLICATII

••10/23/201210/23/2012

APLICATII

Utilizarea MSC in terapia umana

• Utilizarea MSC in terapia umana • 10/23/2012 • 10/23/2012

10/23/2012 10/23/2012

Tratamentul chirurgical post-traumatic sau a defectelor osoase

neoplazice - problema majora a practicii ortopedice. Succesul aplicatiei depinde de co-prezenta unor factori osteoinductivi (induc osteogeneza) si osteoconductivi (permit migrarea, atasarea si proliferarea celulelor, diferentierea

celulelor osteoprogenitor)

Defecte extinse la nivelul tesuturilor moi dupa arsuri profunde, rezectii de tumori sau traume sunt probleme inca nerezolvate in chirurgia plastica si reparatorie deoarece nu sunt accesibile inca materiale implant ce pot corec ta cu succes aceste defecte.

materiale implant ce pot corec ta cu succes aceste defecte. • O solutie promitatoare utilizarea celule

O solutie promitatoare utilizarea celule precursor adipogenice, imature, numite preadipocite, implantate pe biomateriale 3D

Leziunile traumatice si maladiile degenerative ale T cartilaginos, corelate cu varsta - problema majora de sanatate a populatiei umane, nerezolvata dat orita capacitatii limitate de auto-regenerare a TC (nevascularizat si neinervat), la care mecanismele normale de reparare tisulara si recrutarea celulelor stem/progenitor la situsul leziunii nu functioneaza. Mai mult densitatea celulara mica din TC reduce probabilitatea participarii condrocitelor locale la auto-regenerare

Mai mult densitatea celulara mica din TC reduce probabilitatea participarii condrocitelor locale la auto-regenerare
• Tratamentul major al sterilitatii De regula sunt creati mai multi embrioni, sunt pastrati numai

Tratamentul major al sterilitatii

De regula sunt creati mai multi embrioni, sunt pastrati numai cei sanatosi”, cei

cu defecte sunt distrusi. Se implanteaza 2-4 embrioni pentru a creste sansa

Embrionii care nu sunt folositi pot fi congelati pentru a fi utilizati in viitor . La dezghetare 50 % din embrioni mor.

Zeci de mii de embrioni sunt distrusi in cursul terapiei unui cuplu , pana la final

Clonarea terapeutica - Somatic cell nuclear transfer (SCNT)

1. De la o persoana cu defect tisular

se preleveaza tesut (piele) din care se separa celule de la care prin soc

electric se izoleaza materialul nuclear

2. De la un ovul uman se indeparteaza

nucleul

denucleat se

introduce materialul nuclear de la 1 rezultand o celula totipotenta ce contine informatia intregului organism

fi

diferentiate la celule specializate ce

Celulele stem rezultate

3.

In

ovulul

pot

pot fi utile in tratamentul unor maladii

severe.

specializate ce Celulele stem rezultate 3. In ovulul pot pot fi utile in tratamentul unor maladii
• 10/23/2012

10/23/2012

• 1996 – Primul mamifer clonat din celule adulte – oaia Dolly • 2001 –

1996 Primul mamifer clonat din celule adulte

oaia Dolly

2001 Primul embrion uman creat (are 6 celule) de Advanced Cell Technology (USA)