CAPITOLUL I 1.

1 CULTURILE IN VITRO: DEFINIIE, CARACTERIZARE I APLICABILITATE

1.1.1 Definiie n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii de asepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturi sau celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n momentul n care explantul crete. Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care se desprinde de pe planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur. Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit. Acesta poate evolua formnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltrii organelor aeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmulirii nedifereniate a celulelor. Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu planta donor. Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma o plant identic cu planta mam. Teoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a observat c nu toate celulele au capacitatea de a-i exprima acest caracter, datorit pe de o parte diferenierii celulare i mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare de specializare al acelor celule. Astfel, s-a demonstrat practic c, ntr-o plant matur, celulele specializate care constituie esuturile, de exemplu: traheidele, fibrele libero-lemnoase, sclereidele, etc, la care lipsete citoplasma i nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este explicat chiar prin faptul c ntreaga informaie genetic a celulei totipotente se afl n cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odat cu naintarea n vrst, o parte din celule i pierd capacitatea de totipoten sau aceasta se reduce foarte mult. Rmn, ns, anumite zone n care activitatea celulelor este intens, avnd loc diviziunea i formarea aproape continu de noi celule. Aceste celule sunt mici n dimensiuni, poligonale, bogate n citoplasm, au vacuol mic i nucleu mare dispus central i prezint o membran celulozic, formnd esutul cu denumirea de meristem. Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creterii n lungime i grosime a plantelor, fiind dispuse terminal att n tulpin ct i n rdcini. 1.1.2 Caracteristicile culturilor in vitro Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari de plant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiii normale de cultur nu ar reui s creasc opunnd rezisten agenilor patogeni i sintetizndu-i singure substanele nutritive necesare. Din acest motiv, pentru reuita culturii de celule i esuturi se cer respectate urmtoarele condiii: -prepararea unui mediu de cretere care s asigure o bun nutriie heterotrof a explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic uor accesibil explantelor; -asigurarea i controlarea factorilor de mediu (temperatur, lumin, umiditate) n limitele optime pentru fiecare specie, soi i faz de cretere, n funcie de cerinele acestora i scopul urmrit;

-stimularea creterii i diferenierii sau dediferenierii organelor prin utilizarea corespunztoare a substanelor stimulatoare de cretere; -asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro, prin dezinfecia materialului vegetal, sterilizarea mediului i a vaselor de cultur, precum i efectuarea tuturor operaiilor n hota cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat prin flambare. 1.1.3 Domenii de aplicare a culturilor in vitro Datorit spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au rspuns afirmativ, sunt utilizate n prezent n agricultur, silvicultur, farmacie, industria alimentar, industria uoar, etc. n agricultur, n general i n horticultur n special, culturile de esuturi i celule sunt folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obinerea de metabolii secundari. Avantajele culturii in vitro sunt multiple, dintre care amintim: -asigur multiplicarea clonal rapid a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase pornind de la cantiti mici de material vegetal. Teoretic, se asigur o multiplicare exponenial, prin care n circa 6 luni se pot obine 1 milion de plante; -se poate produce material sditor liber de viroze i micoplasme, material mai viguros, precoce i productiv; -necesit spaii mici de cultur i se valorific bine spaiul din laborator prin cultura pe vertical pe 3-5 nivele suprapuse; -obinerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de esuturi generative (cu n cromozomi); -d posibilitatea obinerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro, hibrizi care n condiii normale sunt imposibil de obinut; -selecia de plante rezistente la stres, boli i duntori; -se evit efectul sezonier de pepinier; -se pot obine semine artificiale; -se pot obine plante pe rdcini proprii evitnd astfel cheltuielile de altoire; -asigur multiplicarea clonal a portaltoilor care nu nrdcineaz n condiii normale de cultur; -asigur pstrarea materialului n faza de plantul pn la primirea unor comenzi ferme de multiplicare. Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care, deocamdat rmn s fie nmulite tradiional. Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n mas a plantelor, cum ar fi: -necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate indispensabile activitilor de micropropagare, care sunt costisitoare; -necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro; -utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de producie; -nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la metodele cunoscute de multiplicare; -exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii soiurilor; -riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri care se comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentru unele specii.