METODELE DE ÎNMULŢIRE GENERATIVĂ ŞI VEGETATIVE APLICATE PRIN TEHNICI

NECONVENŢIONALE
LA SPECIILE POMICOLE ȘI LA VIȚA DE VIE
Aplicațiile horticole ale culturilor de țesuturi sunt numeroase; însă cu toate
acestea, trei largi clase de aplicare pot fi recunoscute:
propagarea plantelor (micropropagare),
manipularea genetica (transformarea genetică și mutageneza)
și sinteza produsului (enzime, metaboliți secundari, inclusiv produse
farmaceutice, coloranți și parfumuri).
La speciile pomicole, diferitele tehnici in vitro (numite biotehnologii) au găsit
numeroase aspecte practice de aplicații atât pentru propagarea clonală, cât și
pentru îmbunătățirea genetică.
Ca aplicație biotehnologică, micropropagarea este cea mai recentă metodă
utilizată pentru propagarea comercială a plantelor în horticultură și silvicultură.
Înmulţirea pe cale vegetativă neconvenţională prin cultură “in vitro”
 Avantajele şi dezavantajele multiplicării "in vitro"
Microînmulţirea plantelor in vitro prezintă o serie de avantaje (Pierik, 1987)
care au impus-o în faţa celorlalte metode de înmulţire: generativă şi vegetativă
clasică:
-înmulţirea in vitro este mult mai rapidă decât „in vivo”, într-un an dintr-un
explant fiind posibil să se obţină peste 1 milion de exemplare;
-multe specii care nu pot fi înmulţite ‚in vivo” sau care se înmulţesc greu, pot
fi înmulţite in vitro în urma parcurgerii unui proces de juvenilizare;
-creşterea plantelor înmulţite „in vitro” este mai puternică fapt datorat
juvenilizării şi devirozării. Astfel, la căpşun, Cameron şi colab. (1986) au observat o
creştere mai puternică a explantelor obţinute „in vitro”, fapt ce se datorează
modificărilor survenite în schimburile gazoase ale acestora cu mediul ambiental din
interiorul vaselor de cultură;
-este posibilă obţinerea şi înmulţirea plantelor libere de virusuri cu toate
avantajele care decurg de aici;
-plantele cultivate ‚in vitro” pot fi transportate în condiţii de siguranţă
fitosanitară desăvârşite putând fi schimbate, exportate sau importate;
-pentru iniţierea unui culturi „in vitro” este nevoie de o cantitate redusă de
material biologic. Pentru amelioratori acest lucru este foarte important încât se
poate realiza o selecţie drastică a materialului biologic şi în plus, se pot înmulţi
indivizi deosebiţi obţinuţi prin hibridări sau mutante apărute;
-se realizează importante economii de teren, spaţiu, energie şi combustibil;
-oferă posibilitatea controlului total al factorilor de mediu, fapt ce duce la
creşterea productivităţii şi eficienţei culturilor şi la înlăturarea periodicităţii
producţiei determinată de anotimpuri. Se poate, de asemenea planifica producţia
de plante obţinute in vitro în funcţie de necesităţile concrete ale pieţii;
-înmulţirea „in vitro” permite obţinerea plantelor pe rădăcini proprii,
înlăturând altoirea cu toate dezavantajele pe care aceasta le presupune;
-materialul produs „in vitro” poate să fie conservat prin diferite metode şi
folosit în momentul în care este cerut;
Pentru ameliorarea plantelor microînmulţirea „in vitro” oferă avantaje
suplimentare:
•se scurtează timpul necesar producerii şi lansării unui soi;
•se pot obţine şi înmulţi clone homozigote care să fie folosite pentru
producerea hibrizilor F1;
 •prin utilizarea agenţilor mutageni în diferite faze şi tipuri de culturi „in vitro”
se pot obţine şi selecţiona mutante valoroase.
Procedeul este folosit mai ales la cultura de calus şi la regenerarea de lăstari
adventivi din mezofil;
•prin cultura explantelor „in vitro” în condiţii extreme, se poate realiza stres-
selecţia genotipurilor noi (ex. rezistenţa la sărături);
•manipulările genetice de tipul hibridărilor somatice nu se pot concepe fără
folosirea culturilor de celule şi protoplaşti „in vitro”;
•anumite plante necesită înmulţire vegetativă exclusivă: haploizii, mutantele
sterile, liniile mascule sterile folosite la hibridări, aneuploizii sau heterozigoţii
deosebiţi;
•materialul genetic valoros poate fi conservat în bănci de gene sub formă de
explante „in vitro”.
Folosirea microînmulţirii „in vitro” este limitată uneori de anumite
dezavantaje:
o -în anumite situaţii, stabilitatea genetică a materialului înmulţit „in
vitro” este redusă;
o -plantele înmulţite in vitro prezintă uneori defecte caracteristice şi
după ce sunt trecute „in vivo”: juvenilitate accentuată manifestată prin frunze
necaracteristice, prezenţa spinilor etc., lăstărire adventivă, fructificare întârziată,
vigoare exagerată, pierderea caracterului dominant;
o -uneori înrădăcinarea explantelor înmulţite „in vitro” este greoaie sau
imposibilă. De regulă, rădăcinile formate „in vitro” au o funcţionalitate redusă, ele
fiind înlocuite de alte rădăcini în faza de aclimatizare;
 o -aclimatizarea plantelor obţinute „in vitro” este foarte dificilă datorită
unor modificări morfo-anatomice şi fiziologicecare apar pe durata cultivării „in
vitro”.
Pentru realizarea aclimatizării trebuie construite structuri speciale, sere,
solarii dotate cu dispozitive de control al factorilor de mediu;
-clonarea exagerată favorizează creşterea riscurilor de distrugere în masă a
unor clone de către rase virulente de boli şi dăunători apărute ulterior.
Pentru evitarea acestor situaţii se va opta pentru varianta înmulţirii şi plantării
multiclonale;
-capacitatea regenerativă a explantelor poate să se reducă sau să se piardă
prin culturi repetate, după un număr mare de subculturi;
Dificultăți în aplicarea culturilor in vitro
Una dintre dificultǎţile cu care se confruntǎ micropropagarea la scarǎ
comercialǎ a plantelor de interes economic constǎ în procentul ridicat de
vitroplante care nu supravieţuiesc în condiţii „ex vitro” în etapa aclimatizǎrii,
datoritǎ stresului la care acestea sunt supuse în noile condiţii de mediu.
Pentru evitarea pierderilor pe parcursul procesului de aclimatizare, trebuie
avute în vedere o serie de particularitǎţi morfologice şi fiziologice ale plantelor
regenerate „in vitro”, chiar dacǎ acestea pot avea în momentul transplantǎrii o
organizare completǎ în ce priveşte dezvoltarea tulpinii şi a aparatului foliar,
prezenţa meristemelor apicale şi axilare ca şi dezvoltarea sistemului radicular.
Termenul aclimatizare este atribuit adaptǎrii climatice direcţionate a unui
organism, respectiv a unei plante, care este transferatǎ în condiţii de mediu diferite
de cele anterioare.
 Strategiile care vizeazǎ sporirea procentului de supravieţuire al plantelor
micropropagate în etapa aclimatizǎrii acordǎ o atenţie specialǎ factorilor fizici şi
chimici caracteristici mediului „in vitro” care induc o serie de particularitǎţi
morfologice şi fiziologice la plantele regenerate.
Astfel, prezenţa sursei de C în mediul de culturǎ sub formǎ de zaharozǎ face
ca rata fotosintezei sǎ fie redusǎ, pânǎ chiar la o balanţǎ negativǎ a C. Ca urmare a
transferului în mediul natural, plantele sunt obligate sǎ treacǎ de la un tip de
nutriţie heterotrof sau mixotrof la autotrofie, când fotosinteza devine o condiţie a
supravieţuirii. (Rosu, A.,1999)
Totodatǎ, plantele regenerate „in vitro” sunt predispuse stresului hidric
datorat pierderii excesive de apǎ prin frunze datoritǎ unei structuri anormale a
mezofilului, sau absorbţiei deficitare a apei prin rǎdǎcini.
În condiţii normale, ţesuturile foliare sunt protejate la exterior de o cuticulǎ,
constând dintr-o matrice de cutinǎ şi un strat epicuticular de cearǎ. Cuticula are
rolul de a limita pierderea excesivǎ de apǎ prin transpiraţie. Plantele regenerate „in
vitro”, au stratul epicuticular de cearǎ foarte redus sau cu o structurǎ modificatǎ,
datoritǎ umiditǎţii relative foarte ridicate din interiorul vaselor de culturǎ
(atmosfera este aproape saturatǎ cu vapori de apǎ). Datoritǎ faptului cǎ frunzele
sunt lipsite de protecţia stratului de cearǎ, apa este pierdutǎ excesiv prin
transpiraţie, astfel încât plantele se deshidrateazǎ rapid şi ireversibil în condiţii
normale, cu umiditate atmosfericǎ de aproximativ 35%.
În condiţii „in vitro” şi funcţionarea stomatelor este defectuoasǎ, deoarece
umiditatea relativǎ ridicatǎ din vasele de culturǎ face ca stomatele sǎ rǎmânǎ tot
timpul deschise. În consecinţǎ, mecanismul de închidere a stomatelor nu intrǎ în
funcţiune imediat dupǎ transferul plantelor în atmosferǎ normalǎ, fapt ce are ca
rezultat pierderea excesivǎ a apei şi desicarea rapidǎ a ţesuturilor.
O serie de alte particularitǎţi anatomice în special la nivelul aparatului foliar
contribuie de asemenea la instalarea „şocului aclimatizǎrii”. Frunzele plantelor
micropropagate sunt mai subţiri, ţesutul palisadic este slab dezvoltat şi prezintǎ
spaţii intercelulare mari, ţesuturile vasculare din nervuri şi din peţiol sunt mai slab
dezvoltate, iar cloroplastele au o structurǎ modificatǎ şi conţin puţinǎ clorofilǎ.
Se observǎ particularitǎţi structurale şi la nivelul altor organe. De exemplu,
tulpina plantelor „in vitro” este mai subţire, iar ţesuturile de susţinere –
colenchimul şi sclerenchimul – sunt mai puţin reprezentate.
Legǎtura vascularǎ dintre rǎdǎcinile adventive dezvoltate „in vitro” şi tulpinǎ
este incompletǎ la plantele micropropagate, ceea ce face ca transferul apei de la
rǎdǎcini la pǎrţile aeriene sǎ fie ineficient, fapt ce genereazǎ un dezechilibru între
transpiraţie şi transportul vascular. Ţesutul xilematic formeazǎ un sistem închis în
jurul bazei lǎstarului, înaintea dezvoltǎrii rǎdǎcinilor, fapt ce explicǎ conexiunile
defectuoase care se stabilesc între rǎdǎcinile dezvoltate „de novo” cu sistemul
vascular al lǎstarului.
Adesea rǎdǎcinile dezvoltate „in vitro” sunt lipsite de perişori absorbanţi, sunt
groase şi casante.
Aclimatizarea convenţionalǎ s-a axat în special pe asigurarea unei umiditǎţi
relative ridicate la începutul aclimatizarii, prin acoperirea plantelor cu folii de
plastic şi producerea de ceaţǎ artificialǎ intermitentǎ, în condiţii de umbrire, în
scopul evitǎrii fluctuaţiilor de temperaturǎ şi de umiditate relativǎ, care sunt
responsabile de pierderea excesivǎ a apei din ţesuturile vitroplantelor.
 Unitǎţile moderne de aclimatizare, controlate pe computer, oferǎ
posibilitatea dirijǎrii corespunzǎtoare a principalilor parametri ai mediului
(temperatura aerului, umiditatea relativǎ, intensitatea luminii, concentraţia CO2,
circularea aerului, temperatura şi compoziţia soluţiei nutritive), rezultând un
procent ridicat de supravieţuire a plantelor.
În lipsa unei unitǎţi computerizate de aclimatizare se impune alegerea unor
metode alternative bazate pe un control atent al expunerii vitroplantelor la factorii
specifici mediului „ex vitro”, în condiţii de laborator, serǎ şi câmp.
Reuşita aclimatizǎrii este totodatǎ condiţionatǎ de alegerea substratului
potrivit pentru transferul plantelor la ghivece. Substratul trebuie sǎ aibǎ un pH
potrivit, sǎ fie indemn de patogeni şi bine drenat, pentru a se evita necrozele
coletului cauzate de regulǎ de Botrytis şi de Pythium. (Rosu, A.,1999)
Ca urmare, atenţia specialiştilor s-a orientat spre tehnicile moderne de
multiplicare clonală prin culturi de celule şi ţesuturi. Se vizează în primul rând
posibilitatea multiplicării clonale a arborilor maturi la care s-au exprimat deja
fenotipic anumite caractere genetice superioare.
După 1980 s-au elaborat metode "in vitro" pentru clonarea în masă a unor
arbori în vârstă de peste 100 de ani ca Seqnoia sempervirens, ca şi a unor arbori
maturi de Populus, Eucaliptus şi în cazul .majorităţii pomilor fructiferi.
Prin cultura de apexuri meristematice, prin organogeneza adventivă și
embriogeneză somatică s-a realizat regenerarea de plante la peste 70 specii de
angiosperme şi 30 specii de gimnosperme.
Cu toate acestea multiplicarea vegetativă a explantelor mature de elită este
foarte dificilă, speciile lemnoase fiind în cea mai mare parte caracterizate ca
recalcitrante la metodele de regenerare "in vitro" de aceea, cunoaşterea unor
caractere ca juvenilitate, maturitate și rejuvenilizare s-a dovedit obligatorie
pentru elaborarea unor metode eficiente de multiplicare clonală la multe specii
lemnoase.
În ciclul biologic normal al plantelor lemnoase, juvenilitatea, maturitatea şi
rejuvenilizarea sunt fenomene obligatorii, asociate cu particularităţi
morfofiziologice şi biochimice distincte.
Durata fazei juvenile variază de la o specie la alta. La plantele ierboase ea
poate dura doar câteva zile. La speciile lemnoase, care pot atinge dimensiuni
considerabile şi la care procesul maturării este lent, faza juvenilă sa poate extinde
pe decenii, iar unele zone ale plantei pot păstra caractere juvenile pe durata
întregului ciclu de viaţă.
Tranziţia de la starea juvenilă la cea adultă este adesea greu de definit. Aceasta
este asociată cu o serie de modificări progresive de ordin morfologic şi fiziologic ca
de exemplu: diferenţa în ce priveşte forma, grosimea frunzelor și filotaxia
(dispunerea frunzelor), caracteristici ale scoarţei, numărul ramurilor şi tipul de
ramificare, prezenţa sau absenţa spinilor.
Există și diferenţe de ordin fiziologic. De regulă plantele juvenile au o creştere
mai rapidă, au o capacitate superioară de a dezvolta rădăcini adventive, au o
rezistenţă sporită la boli. După o concepţie mai veche, faza juvenilă se
caracterizează, în afară de aceste particularităţi, prin absenţa florilor. S-a
demonstrat însă, că plantele pot realiza capacitatea de a înflori fără ca aceasta să
se exprime. Înflorirea este un proces complex care se exprimă într- un anumit
moment al ciclului biologic, după un program morfogenetic înscris în materialul
ereditar al speciei.
Maturarea ontogenetică nu trebuie confundată cu îmbătrânirea fiziologică sau
senescenţa, care înseamnă un proces distructiv care micşorează vitalitatea unui
organ sau a unui organism și în final îi provoacă moartea.
La plantele lemnoase care au o creştere lentă, procesul maturării se instalează
treptat, diferitele părţi ale plantei se vor afla intr-un anumit moment în etape
diferite ale procesului de maturare.
Totdeauna părţile bazale ale arborelui sunt cele mai tinere, în aceste zone fiind
conservate ţesuturi tinere din punct de vedere fiziologic. Părţile superioare ale
trunchiului și ceroana conţin ţesuturi mature fiziologice chiar dacă sunt tinere din
punct de vedere cronologic.
S-a demonstrat că această capacitate a speciilor lemnoase de a fi propagate
vegetativ este asociată cu gradul de juvenilitate. În general, cu cât este mai tânăr
un individ din punct de vedere ontogenetic, cu atât este mai ușoară propagarea lui
vegetativă.
Maturitatea se caracterizează nu numai prin structuri morfologice noi,care le
înlocuiesc pe cele de tip juvenil, ci şi prin comportamente fiziologice noi, cum este
de exemplu pierderea capacităţii morfogenetice.
Ca urmare, exemplarele mature devin dificil sau chiar imposibil de propagat,
atât prin metode convenţionale de preparare vegetativă cât și prin culturi "in vitro".
Pentru a se putea totuşi realiza propagarea vegetativă a acestor specii
recalcitrante trebuie foarte bine cunoscuţi factori ca: juvenilitatea, maturarea,
determinismul meristemelor și posibilităţi de restaurare a juvenilităţii
(rejuvenilizarea).
Legat de aceasta s-a constatat că pot să reapară unele însuşiri juvenile, inclusiv
capacitatea morfogenetică, în anumite organe, ţesuturi sau celule ale plantei
(rejuvenilizare). Acest proces se poate produce pe cele naturală sau poate fi indus.
 Restaurarea juvenilităţii poate fi parţială sau totală. Rejuvenilizarea parţială
poate conduce la recăpătarea de către ţesuturi și celule a unei capacităţi limitate
de morfogeneză, exprimată prin formare de lăstari sau de rădăcini adventive.
Rejuvenilizarea parțială se realizează atunci când celule și ţesuturi mature își
recapătă capacitatea formării de embrioni somatici.
În propagarea sexuată zigotul este prima celulă a fiecărui nou organism, e o
celulă complet juvenilă, care are capacitatea de a-și exprima toate genele, de a
forma un nou organism. Zigotul este rezultatul fuziunii gameţilor, care sunt celule
juvenilizate pe parcursul meiozei.
În cazul arborilor recalcitranţi la înmulţirea vegetativă, reîntinerirea
meristemelor e indispensabilă. Există unele metode practice de rejuvenilizare. O
tehnică eficace e altoirea mugurilor indivizilor maturi pe portaltoi juvenili. Starea
juvenilă obţinută astfel e de scurtă durată și poate fi accentuată şi prelungită prin
efectuarea în serie a unor astfel de portaltoi juvenili (rezultaţi din germinarea
seminţelor).
O altă meotdă constă în folosirea lăstarilor de cioată.
Se retează arborele la suprafaţa solului iar lăstarii care se dezvoltă în
apropierea rădăcinilor, cu caractere juvenile.
O altă metodă constă în sprayerea plantei parentale cu gibereline sau cu BAP.
tehnică folosită curent pentru a activa celulele arborilor maturi, înainte de iniţierea
culturilor "in vitro".
Cultura "in vitro" prin caracteristicile sale este ea însăşi o tehnică de
rejuvenilizare eficientă, printre altele datorită efectului prelungit al citokininelor
introduse în mediul de cultură şi miniaturizării plantelor, apexul tulpinii aflându-se
în apropierea rădăcinilor. Se presupune că sistemul radicular este cel responsabil
de perpetuarea unor însuşiri juvenile la nivelul ţesuturilor situate la joncţiunea cu
tulpina, ca rezultat al unui factor rejuvenilizator, produs în rădăcină şi transferat
spre lăstari. Se admite că giberelinele au acest efect ele fiind produse la nivelul
sistemului radicular.
Astfel se explică realizarea juvenilizării prin altoire când altoiul matur ajunge
în proximitatea rădăcinilor portaltoiului tânăr, ca şi în cazul plantelor miniaturizate
regenerate "in vitro".