PRINCIPALELE APLICAII ALE BIOTEHNOLOGIEI MODERNE

BIOTEHNOLOGIILE VEGETALE

CERINE ASUPRA TEMEI:

1. s definii termenii de micropropagare in vitro, aclimatizare, dedifereniei, regenerare,
difereniere, organogenz;
2. s cunoatei condiiile de vitrocultur, implicit a modificrilor morfofiziologice i biochimice
suferite de vitroplantule;
3. s descriei metode de realizare a procesului de micropropagare.

Definiii

SCHAEFFER (1990) definea micropropagarea ca fiind o nmulire clonal in vitro a plantelor,

pornind de la diferite explante, n general, cu o proliferare accelerat de lstari.

Dup ZAID i colaboratorii (1999), micropropagarea reprezint multiplicarea miniaturizat in

vitro a plantelor i regenerarea materialului vegetal ntr-un mediu aseptic, controlat, pe medii de
cultur care conin substane de cretere specifice.

n domeniul vitroculturilor vegetale, termenul de aclimatizare are o semnificaie aparte, i

anume: adaptarea plantulelor generate in vitro (vitroplantulelor) la condiiile mediului
septic de via (CONOVER i POOLE, 1984; CACHI, 1987) sau procesul de cretere a
plantelor cultivate in vitro, n condiiile mediului extern de via (ZAID, 1999).

Evoluia culturilor de celule i esuturi

Ideea de clonare a plantelor a luat natere nc ncepnd cu anul 1838, cnd SCHLEIDEN i, n
anul urmtor, SCHWANN (1839) au formulat ipoteza totipotenialitii celulare, potrivit creia
la baza structurii organismelor fiecare celul posed toate informaiile genetice de care aceasta
are nevoie pentru formarea unui nou organism

-1902 - HABERLANDT - celulele plantelor cultivate in vitro, pe medii artificiale adecvate

asigurrii vieii acestora, pot regenera o plant normal.

- dup descoperirea citochininelor de ctre SKOOG i colab., SKOOG i MILLER, n anul 1957,
au observat c formarea de lstari sau de rdcinie este controlat de balana hormonal
auxin/citochinin;

- embriogeneza somatic in vitro a fost descris, pentru prima dat, de ctre STEWARD i
colab., n anul 1958 i de ctre REINERT, n acelai an;

- un prim pas n micropropagarea industrial a plantelor superioare l-a constituit elaborarea

tehnicilor de micropropagare in vitro la Cymbidium (MOREL, 1960).

- cultura de protoplati, fuziunea i dezvoltarea hibrizilor somatici au fost descrise ntre anii
1960-1970, de ctre COCKING (1960),
 - 1962, MURASHIGE i SKOOG au descoperit un mediu de cultur, cu o mare concentraie de
sruri minerale, care s-a dovedit a fi optim pentru creterea in vitro a multor tipuri de
cormofitoinoculi.

- cultura de antere (androgeneza) i producerea de plante haploide a fost realizat de ctre

GUHA i MAHESHWARI, ntre anii 1964-1966 i de ctre BOURGIN i NITSCH, n anul
1967;

- din anul 1966 i pn n prezent se delimiteaz perioada modern a culturilor de esuturi i

celule vegetale, perioad caracterizat prin larga extindere a utilizrii acestor explante ca modele
experimentale n cercetrile fundamentale ntreprinse n diferite domenii ale biologiei vegetale;
pe de alt parte, au luat fiin o multitudine de subramuri de biotehnologie vegetal, i anume:
citofitotehnologiile, ce au ca obiect creterea i valorificarea culturilor celulare, libere sau
imobilizate; n anii 1980, tehnologia AND-ului recombinat i producerea de plante transgenice
au fost realizate de ctre SCHELL (1987) i de ctre SCHELL i VASIL (1989);

Procesele morfofiziologice la nivelul explantelor sau a inoculilor cultivai in vitro

1. Regenerarea capacitatea unor celule vii sau a oricrei pri din acestea de a-i reface oricare
parte distrus, fiind o form de autoconservare

n general, la angiosperme, regenerarea la nivelul inoculilor cultivai in vitroare loc pe trei ci

principale:

depresarea meristemelor caulinare existente n explante;

organizarea de novo de meristeme;

formarea de embrioni somatici.

Regenerarea se finalizeaz prin:

formarea de calus, iniial neorganizat, acesta - la rndul lui - poate genera - n manier
independent - rdcini, mugurai sau embrioni somatici;

formarea de mugurai, fapt care poate conduce la generarea de tulpinie ce, ulterior n poriunea
lor bazal pot s diferenieze rdcini, constituindu-se astfel, n final, la nivelul explantului, o
plantul;

formare de rdcini, care, arareori, pot da natere la mugurai;

formarea de embrioni somatici, care prezint o structur morfoanatomic identic cu cea a

embrionilor zigotici, ei deinnd att rdcini, ct i tulpini i mugura.

Tipuri de regenerare in vitro la plante

2. Dediferenierea
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru ca s i reorganizeze un mod de via, trebuie s
sufere un proces de conversie, respectiv din celule definitivate structural i funcional, acestea s treac la
starea de celule meristematice, apte de multiplicare, proces numit dedifereniere.

1. Prima faz de dedifereniere:

a - amorsarea proceselor de dedifereniere;

b - producerea dediferenierii celulelor, pn la dobndirea caracteristicilor citologice specifice

unui esut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate, asemntoare, ca aspect i structur,
cu cambiul;

2. A doua faz de dedifereniere:

a - dediferenierea n continuare a celulelor pn la stadiul de celule cu caracter de meristem

primar; generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau de meristemoizi (centre
organogene), ori de embrioni somatici, iar din acetia, regenerarea de plante;

b - generarea - prin proliferarea celulelor dedifereniate - a unui calus neorganizat, omogen

structurat. La nivelul acestui esut calusal se pot, apoi, forma meristemoizi sau centri embriogeni.

3. Diferenierea - procesul opus dediferenierii i const dintr-o serie de transformri structurale, pe care
le sufer celulele nedifereniate sau dedifereniate (meristemele), trecnd printr-o specializare morfologic
(ultrastructural) i fiziologic, dobndind caracteristici noi, proprii celulelor adulte.

citodiferenierea in vitro presupune formarea elementelor lemnoase, a xilemului;

histodiferenierea se petrece pe msura constituirii organelor.

Rspunsul celulelor foliare dedifereniate, la ndeprtarea peretelui celular (cu ajutorul

celulazelor) prin dediferenierea nsoit de distrugerea nucleoluluii condensarea clusterelor
genelor ARN ului ribozomal. n acest stadiu, semnalele aditionale pot determina distrugerea
celulelor. Aplicarea de auxine i citochinine conduce la reasamblarea nucleolilor i
decondensarea genelor ARN-ului ribozomal, n consecin conduce la reintrarea n ciclul celular
i proliferarea (Zhao et al., 2001; Williams et al., 2003; Avivi et al., 2004).

4. Morfogeneza

- morfogeneza reprezint procesul de dezvoltare a formei i a structurii organelor, n urma diferenierii

histologice a celulelor;

- n cadrul morfogenezei, prin embriogenez se subnelege procesul de formare a embrionului, iar

organogeneza este procesul de individualizare a organelor.

rizogeneza (formarea de rdcini), ca de altfel toate fenomenele de organogenez, este

declanat de interrelaia dintre efectori i locul de aciune al acestora, respectiv receptorii, adic,
terenul morfogenetic propice pentru ca efectorii s acioneze. Prin efectori se nelege ceva mai
mult dect fitohormonii, eventual acizi nucleici, sinteza proteic etc.
 caulogeneza - formarea de mugurai, respectiv generarea de centri vegetativi. Inducerea
caulogenezei este stimulat de prezena n mediul de cultur a citochininelor, adeseori, n condiiile
asocierii acestora, cu auxinele.

Neoformarea de mugurai la nivelul calusului se afl sub controlul interaciunii celor dou categorii de
fitohormoni.

Procesul de embriogenez somatic la Melia azedarach (Cinvestav, 1998)

(a) Embriogenez somatic indirect din calus.

(b) Diferite stadii ale embrionului somatic.
(c) Germinarea embrionului somatic.
(d) Conversia embrionului somatic.
(e) ntreaga plantul.
(f) Acclimatizarea exvitroplantulelor.

(Electronic Journal of Biotechnology, 2006 by Universidad Catlica de Valparaso Chile)

Bibliografie

1. CACHI, C.D., SAND, C., 2001, Biotehnologie vegetal vol. I Baze teoretice i practice. Ed.
Mira Design, Sibiu.

2. ROU, A., 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n ameliorare, Editura Ametist
92, Bucureti.

BIOTEHNOLOGIE

Curs 6
Embriogeneza somatic

Embriogeneza somatic - Definiii, caracterizare

Embrionul reprezint o entitate distinct, care funcioneaz ca un stadiu intermediar al tranziiei

de la ciclul biologic gametofitic la cel sporofitic.

Embriogeneza somatic la plante este un proces morfogenetic complex prin care o singur celul
somatic se poate divide i transforma n condiii speciale ntr-o structur bipolar care se va
dezvolta genernd n final planta ntreag, printr-un proces asemntor embriogenezei zigotice.

Tipuri de embrioni vegetali

1. -embrioni zigotici generai din zigot (diploizi), format prin fertilizarea ovulului,

2. - embrioni nezigotici formai in vivo (diploizi sau haploizi) sau in vitro, din alte celule
dect zigotul,
- embrioni somatici formai din celulele sporofitului ex. embrionii adventivi (i-au natere din din ali
embrioni, organe sau celule ale sacului embrionar, ale nucelei sau ale integumentelor ovulului)

- embrioni partenogenetici formai din ovule nefertilizate,

- embrioni androgenetici formai din gametofitul masculin,

- embrioni ginogenetici formai din gametofitul feminin

Fazele procesului de embriogenez somatic in vitro

formarea maselor celulare embriogene i a esutului proembrionic

stadiile morfologice caracteristice:

- globular,

- cordiform,

- torpedo,

- cotiledonar.

- embrion matur

Tipuri de embriogenez somatic

Direct - de la celule difereniate, de la plantule i chiar de la embrioni zigotici

Indirect prin iniierea prealabil a calusului

Utilizarea embrionilor somatici n producie.

Semine artificiale.

La morcov, elin, palmierul de ulei, cafea, curmal, arbore de cacao

Semnarea se poate face prin antrenarea embrionilor aflai n suspensie prin conducte i plonjarea
lor pe brazd, prin ncapsularea n alginat de sodiu sau n polimeri biodegradabili

Embriogeneza somatic la Melia azedarach

(CINVESTAV, 1998).

(a) Embriogeneya somatic indirect din calus.

(b)Diferite stadii ale embrionilor somatici.
(c) Germinarea embrionilor somatici.
(d) Conversia embrionilor somatici.
(e) ntreaga plantul.
(f) Aclimatizarea plantulelor.

Electronic Journal of Biotechnology by Universidad Catlica de Valparaso Chile)

Micropropagerea in vitro prin embriogenez somaticla Oroxylum indicum

A. Embriogenz in vitro la culturile de calus

B. Plantule regenerate prin embriogenez somatic

C. nrdcinarea in vitro

D. Plante mature

Sistemul de regenerare in vitro, rapid i foarte eficient (organogenez i embriogenez somatic)

din lstari apicali
(A) Prima zi de la izolarea lstarilor apicali, cu primordii foliare LP = primordii foliare; SM =
meristeme.
(B) Dup prima sptman la nivelul explantelor se pot observa poriuni de meristeme i
extinderea frunyulielor primordiale.
(C) Dup trei sptmani n masa meristematic se disting numeroi lstari i frunzulie iniiale.
(D) Lstari individuai producand 2-8 straturi de tesut translucid.
(E) Fiecare strat de esut a generat mai muli embrioni somatici.
(F) Diferenierea minibutailor din meristeme.
(G) Germinaia embrionilor somatici putandu-se observa apexul lstarilor (SA), nconjurat de
frnzuliele preliminare (PL).
(H) Diferenierea embrionilor somatici in plantule.
(I) Plantule cu rdcinie formate.
(J) Aclimatizatizarea plantulelor.
(K) Plante regenrate n ser.

Embriogeneza somatic la porumb pornind de la embrioni zigotici imaturi, inoculai pe mediu cu

adaos de 1 mg/L 2,4-D, 25 mM Prolin, 100 mg/L Cazein hifdrolizat, 10 mg/L nitrat de argint

Bibliografie

1. CACHI, C.D., SAND, C., 2001, Biotehnologie vegetal vol. I Baze teoretice i practice. Ed.
Mira Design, Sibiu.

2. ROU, A., 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaii n ameliorare, Editura Ametist
92, Bucureti.
Embrion imatur

Cultura de calus friabil

Plantul regenerat pe mediu cu adaos de 1 mg/l ANA

Transferarea ex vitro n amestec de turb cu sol 1:1
Embriogeneza somatic la Melia azedarach

(CINVESTAV, 1998).

(a) Embriogeneza somatic indirect din calus.

(b)Diferite stadii ale embrionilor somatici.
(c) Germinarea embrionilor somatici.
(d) Conversia embrionilor somatici.
(e) ntreaga plantul.
(f) Aclimatizarea plantulelor.

Electronic Journal of Biotechnology by Universidad Catlica de Valparaso Chile)

Micropropagerea in vitro prin embriogenez somatic la Oroxylum indicum

A. Embriogenz in vitro la culturile de calus

B. Plantule regenerate prin embriogenez somatic

C. nrdcinarea in vitro

D. Plante mature
Sistemul de regenerare in vitro, rapid i foarte eficient (organogenez i embriogenez somatic) din
lstari apicali

(A) Prima zi de la izolarea lstarilor apicali, cu primordii foliare LP = primordii foliare; SM = meristeme.
(B) Dup prima sptman la nivelul explantelor se pot observa poriuni de meristeme i extinderea
frunyulielor primordiale.
(C) Dup trei sptmani n masa meristematic se disting numeroi lstari i frunzulie iniiale.
(D) Lstari individuai producand 2-8 straturi de tesut translucid.
(E) Fiecare strat de esut a generat mai muli embrioni somatici.
(F) Diferenierea minibutailor din meristeme.
(G) Germinaia embrionilor somatici putandu-se observa apexul lstarilor (SA), nconjurat de frnzuliele
preliminare (PL).
(H) Diferenierea embrionilor somatici in plantule.
(I) Plantule cu rdcinie formate.
(J) Aclimatizatizarea plantulelor.
(K) Plante regenrate n ser.

Embriogeneza somatic primar n mediu solid (1) sau n suspensii celulare (2) la Coffea arabica

Caracteristici histologice ale embriogenezei

somatice secundare n suspensiile de celule.
a b: Structuri papulare pe epiderma
embrionilor torpedo.
c: embrionii secundari a unor celule.
d: embrioni seundari globulari.
Calibrarea barelor: 200 m pentru a, 100 m
pentru b,c i d.
 Etapele i condiiile de vitrocultur i efectul lor asupra plantulelor regenerate in vitro

1. nfiinarea unei culturi, respectiv obinerea unei culturi in vitro cu capacitate

regenerativ;

2. incubarea i creterea dirijat a cormofitoinoculilor; ceea ce presupune nu numai

amorsarea proceselor regenerative, ci i a celor de morfogenez;

3. subcultivarea (repicarea sau transferarea - pasarea - culturilor);

4. conservarea culturilor;

5. transferarea ex vitro a vitroplantelor i aclimatizarea acestora la regimul de via

septic.

Iniierea culturii in vitro

Selecia inoculului.

Alegerea mediului de cultur.

Selecia recipientelor de vitrocultur.

Prelevarea i asepsizarea materialului vegetal.

Inocularea materialului vegetal.

 Incubarea vitroculturilor.

Creterea vitroculturilor.

Pregtirea i prelucrarea vitroculturii pentru viitoarea cultur.

Conservarea vitroculturilor.

Asepsia i asepsizarea

Dispozitive de sterilizare

Mediul de vitrocultura

Caracteristicile generale ale procesului de micropropagare

De ce sunt vitroplantulele verzi i totui nu se hrnesc fotoautotrof?

Prezena n mediul de vitrocultur a zaharozei (cu excepia culturilor fotoautotrofe) molecule

de amidon blocarea cloroplastelor

CAUZELE APARIIEI UNEI EVAPOTRANSPIRAII EXCESIVE LA NIVELUL

EXVITROPLANTULELOR

1. Stomatele au osteolele n permanen deschise (sisteme de nchidere deschidere

nefuncional);

2. Amfistomatia i densitateas ridicat a stomatelor la nivelul limburilor foliare (la

Cymbidium vitroplantulele pot fi amfistomatice, cu toate c, n condiii naturale de via
frunzele prezin hipostomatie).

3. Lipsa cuticulei pe suprafa frunzelor;

Cercul vicios al reglrii condiiilor de mediu ex vitro n perioada de aclimatizare

1. Umiditatea relativ a atmosferei din recipientele de aclimatizare trebuie meninut

ridicat, pentru a reduce mortalitatea exvitroplantulelor

2. O metod de cretere a umiditii n jurul plantulelor, const n meninerea

exvitroplantulelor sub ceaa artificial, care realizeaz o hidratare a atmosferei dar i o
umbrire a acestora,.

3. Fotosinteza este, ns, inhibat n condiii de umbrire prea puternic

4. Inhibarea fotosintezei (fotoautotrofismului) poate descrete organogeneza, respectiv

rizogeneza i caulogeneza
 5. Absorbia apei i a srurilor minerale este diminuat de insuficienta dezvoltare a
aparatului radicular secundar

6. Absorbia diminuat de ap, pe fondul unei transpiraii excesive la nivelul frunzelor,

poate conduce, n final, la moartea exvitroplantulelor Sau

n momentul transferrii ex vitro a vitroplantulelor, o parte dintre frunzulie pot fi ndeprtate,

pentru a reduce astfel excesul de transpiraie, dar, fotosinteza este inhibat de o suprafa foliar
mic.

INCINTE DE ACLIMATIZARE EX VITRO

TIPURI DE SUBSTRATURI DE EXVITROCULTUR

Bibliografie

1. CACHI, C.D., DELIU, C., RAKOSY TICAN, L., ARDELEAN, A., 2004, Tratat de
biotehnologie vegetal, Vol 1, Editura Dacia, Cluj Napoca.

2. ECONOMOU, A.S., READ, P.E., 2003, Proceedings of the First International

Symposium on Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants, Acta
Horticulturae, 616.

Fig. 1.

A. Arborele de Royal poinciana.

B. B. Detaliu de floare de Royal poinciana.

Caracteristici histologice ale embriogenezei somatice

secundare n suspensiile de celule.
a b: Structuri papulare pe epiderma embrionilor torpedo.
c: embrionii secundari a unor celule.
d: embrioni seundari globulari.
Calibrarea barelor: 200 m pentru a, 100 m pentru b,c i d
 Fig. 2. Etapele sterilizrii:

A. Psti imature dup presterilizare n alcool 96%.

B C. Localizarea seminelor imature n pstaie.

D. Seciuni de pstaie dup sterilizarea n hipoclorit de sodiu, cu adaos de Twen i cltite

cu ap aflate n interiorul hotei cu flux laminar de aer steril (Meiers, A., 2004, Journal of
Undergraduate Research Volume 5, Issue 6).

Tipuri de explante utilizate in experiment: A. Embrion zigotic imatur Bar = 1 mm. B. Smn
imatur. Localizarea embrionului zigotic imatur n smn. Bar = 10 mm. C. Smn imatur
tiat n jumtate Bar = 10

Formarea calusului embriogen (CE). A. Formarea CE n embrionii zigotici imaturi. Bar = 2 mm. B.
Embrioni imaturi localizai n smn, cu calus la capt. Bar = 9 mm. C. Calus produs la
suprafaa semiontelor njumtite Bar = 13 mm.
 Ultrastructura cloroplastelor din celulele mezofilului foliar al frunzulielor plantulelor de
garoafe: A in vitro (6000 X) i B la 24 h dup transferarea ex vitro (12000 X) (ca
canalicule; s strom; g grane; cl cloroplast; am amidon; pc perete celular; sp spaiu
intercelular; M mitocondrie; c citoplasm; V vacuol) (Cachi i Crciun, 1991)

1. Stomatele au osteolele n permanen deschise (sisteme de nchidere deschidere

nefuncional);

2. Amfistomatia i densitateas ridicat a stomatelor la nivelul limburilor foliare (la

Cymbidium vitroplantulele pot fi amfistomatice, cu toate c, n condiii naturale de via
frunzele prezin hipostomatie).

3. Lipsa cuticulei pe suprafa frunzelor;

Formaiuni epidermale la frunzele de violetele africane (Saintpaulia ionantha): I. - cultivate
in vitro: A . Celule epidermale de pe faa superioar; B. Aparat stomatic din epiderma
inferioar i II. cultivate n ser (c.epi.sup. celulele epidermei superioare; c.epi.inf.
celulele epidermei inferioare; st. stomat; ost. osteol; c.a. celule anexe) (Petru
Vancea i colab., 2007)
Aspecte ale stomatelor frunzelor de garoafe: Aspecte ale stomatelor i a cerii epicuticulare
la frunzele de Lycium chilense: A in vitro, B ex vitro,
evideniate la microscopul electronic cu baleaj

(1350 X) (Maseda i colab., 2004)

a ex vitro, b in vitro,

evideniate la microscopul electronic cu baleaj (Taji i Ariel, 1994)

Aspecte ale procesului de aclimatizare al exvitroplantulelor de cartof la Centrul de Agricultur din
Canada
Exvitroplantule de violete africane (Saintpaulia ionantha), la 30 de zile de la transferarea lor ex
vitro, plantate fiind pe variate tipuri de substraturi: V0 Top soil, V1 amestec de zeolit cu
perlit, n raport de 1:2, V2 amestec de zeolit cu Top soil, n raport de 1:1, V3 amestec de
zeolit cu nisip de ru, n raport de 1:2.
Aspecte ale exvitroplantulelor de violete africane (Saintpaulia ionantha), aflate la 30 de zile de la
transferarea ex vitro a acestora i plantarea lor pe variate substraturi de exvitrocultur: V0
perlit; V1 vat mineral; V2 Top soil.

Aspecte ale exvitroplantulelor de crizanteme (Chrysanthemum morifolium Ramat var. Lamet),

aflate la 30 de zile de la transferarea ex vitro a acestora i plantarea lor pe substrat constnd din
rumegu de plop sau rumegu de fag.
Cultur hidroponic de cpuni