Culturi celulare

Cultura de celule si tesuturi

este o metoda de laborator, prin care celule izolate sau fragmente de tesut (animal sau vegetal), sunt
transferate intr-un mediu artificial, controlat, in care acestea isi pastreaza viabilitatea si functii
specifice.

1907 – Ross Harrison (zoolog, America). Prima culturaa de tesut in picatura de plasma coagulata. A
observat cresterea prelungirilor nervoase din fragmentul de tesut.

Aplicatii

• Cercetari fundamentale in biologie si medicina • Obtinerea de vaccinuri si inteferoni • Testarea

medicamentelor si a dispozitivelor medicale • Toxicologie • Terapie celulara si inginerie tisulara •
Analize citogenetice pentru evidentierea aberatiilor cromosomiale

Alte evenimente importante • 1916 – metode de dezintegrare tisulara cu enzime hidrolitice • 1940 –
introducerea antibioticileor in tehnica de lucru • 1952 – transplant de nucleu • 1955 – medii
artificiale complexe • 1964 – celule stem de soarece (pluripotente) • 1966 – primul factor de crestere
(NGF) • 1970 – aparitia primelor hote cu flux laminar • 1976 – medii sintetice, compozitie definita,
fara extracte naturale • 1980 – dezvoltarea tehnicilor de inginerie genetica si inginerie tisulara • 1996
– prima clonare reusita la animale (oaia Dolly) • 1998 – cultura de celule stem umane

Istoric

1881 – Roux a demonstrat viabilitatea celulelor de la embrionul de găină într-o soluţie salină şi în
afara unui organism viu

1907 – Harrison rezolvă controversa „doctrinei neuronale” care susţinea că extensiile neuronale se
dezvoltă prin evoluţia corpului neuronal şi nu prin fuziunea celulelor care înconjură aceste extensii. El
a cultivat fragmente de măduvă spinală de amfibian (ex. broască) pe cheag limfatic şi a demonstrat
că extensiile neuronale se dezvoltă pornind de la corpul neuronal şi invadând suportul nutritiv.

1913 – Carrel demonstrează că unele celule pot creşte şi supravieţui pentru un timp în cultură dacă
sunt alimentate corespunzător şi menţinute într-un mediu aseptic.

1948 – Earle şi colab. izolează celule din linia L şi determină formarea de clone celulare în cultură de
ţesuturi.

1952 – Gey şi colab. stabilizează prima linie celulară din carcinomul cervical uman, linie cunoscută
astăzi sub numele HeLa.

1961 – Hayflick şi Moorehead arată că numeroase fibroblaste mor după un număr determinat de
diviziuni în cultură.

1964 – Littlefield introduce mediul HAT în vederea creşterii selective a hibrizilor de celule somatice.
Odată cu punerea la punct a tehnicilor de hibridare a celulelor a fost deschisă era manipulării
genetice.

1965 – Ham şi colab., a definit un mediu de cultură fără ser pentru celule de la mamifere. Au fost
create primele celule hibrid umane-murine (Harris-Watkins).
1975 – Kohler şi Milstein au produs prima dată anticorpi monoclonali din linii celulare compuse din
hibridoame.

1976 – Sato şi colab., arată că pentru creşterea celulelor în medii fără ser este necesară prezenţa
unor factori de creştere şi hormoni.

Tehnicile de culturi de celule si tesuturi reprezinta un instrument important si necesar in studiul a

numeroase probleme fundamentale din domeniul biologiei celulare normale si patologice, a geneticii
si a altor domenii medicale.

Prin cultura de celule se obtine o multiplicare „in vitro” a celulelor provenite dintr-un fragment de
tesut. Astfel, se poate studia comportamentul celulelor in conditii strict definite, fiind posibila
determinarea efectelor asupra comportamentului celular prin adaugarea sau extragerea de molecule
specifice, ca factori de crestere sau hormoni si obtinerea de populatii omogene de celule pentru
studiul interactiunilor de tip celular sau altul.

Metoda permite studiul caracterelor morfologice si proprietatile biologice ale celulelor din diferite
tesuturi, separate de organism dar si studiul unor probleme de biologie tisulara

Tipuri de culturi celulare se pot clasifica dupa cum urmeaza:

1. Dupa felul substratului :

-culturi pe suport organic nutritiv

-culturi pe suport organic nenutritiv

-culturi in suspensie in mediu lichid

- culturi de suport anorganic sticlă, plastic

2. Dupa modul de initiere a culturii:

a. culturi initiate cu fragmente de tesut:

-pe suport nutritiv: culturi in picatura suspendata, culturi in flacoane, culturi in tuburi rotate

-culturi pe suport nenutritiv

-culturi in suspensie in mediu lichid, cand se obtine numai supravietuirea celulelor

b. culturi initiate cu celule dispersate:

-culturi de celule libere in mod natural, respectiv culturi de leucocite in sangele periferic

-culturi de celule obtinute prin dispersarea celulelor din fragmente de tesut

3.Dupa tipul de material biologic cultivat:

-culturi de organe sau organocultura – metoda ce reprezinta scoaterea din organism a unui
fragment de organ ( intestin, trahee, rinichi) si introducerea acestuia intr-un mediu nutritiv, cu
mentinerea acestora „in vitro”, un timp limitat. Caracteritica acestui tip de cultura celulara este
 formarea in jurul explanantului, respectiv a fragmentului extras dintr-un tesut, a unei „coroane
de celule”

- cultura celulara propriu-zisa – obtinerea prin cultivarea intr-un mediu nutritiv a unei suspensii
de celule si se realizeaza prin dispersare prin metode fizice si chimice, fiind reprezentata prin
asocierea factorilor chimici, cu factori mecanici

Materiale de lucru

Cuprind prepararea culturilor de celule intr-un spatiu steril, special amenajat.

Laboratorul de lucru cuprinde:

-camera de curatire si sterilizarea a instrumentelor si sticlariei de laborator

-camera de crestere a celulelor si tesuturilor ( camera de incubare)

- camera de inoculare si transfer

- camera de prelucrare a materialului biologic

Mediul de cultura trebuie sa asigure celulelor cultivate „in vitro”conditii apropiate de acelea pe
care le ofera organismul viu:

-trebuie sa asigure echilibrul ionic obtinut cu solutii izotonice

-pH optim 7,2-7,4 care sa se mentina cu substante tampon

-temperatura optima 37

-continutul de oxigen si dioxid de carbon favorabil

-elemente nutritive indispensabile metabolismului: hidrati de carbon, glucoza, fructoza, proteine

animale, ser sangvin, aminoacizi esentiali, grasimi, colesterol, vitamine, hormoni, substante
stimulatoare ale cresterii

- - evitarea contaminării cu germeni patogeni – se realizează prin adăugarea de antibiotic la

mediul de cultură;

Clasificarea mediilor de cultura se poate face si astfel:

- Dupa consistenta: lichide, semilichide respectiv mediu nutritiv si agar sau coagulant
plasmatic sangvin
- Dupa compozitie: naturale, semisintetice si sintetice
- Dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit: medii de crestere, ce permit o proliferare
abundenta; medii de mentinere ce pastreaza activitatea celulara fara a le favoriza
proliferarea

Desfasurarea ciclului vital al celulelor cultivate cultivate „in vitro” – dinamica dezvoltarii este
fazica si cuprinde
- Stadiul stationar – 30 minute – se produc adaptari la noile conditii fizico-chimice de mediu
- Stadiul de atasare – 1-2 ore – acest fenomen este rezultatul unui proces de echilibrare a
fortelor ionice intre substratul solid si suprafata celulelor
- Stadiul de etalare sau aplatizare- celulele iau forma aplatizata in plan paralel cu suportul solid
de cultivare, isi maresc suprafata prin procesul de expansiune citoplasmatica
- Stadiul de multiplicare – la fiecare 18-20 ore are loc cate un cilcu celular care va determina
acoperirea suportului solid de cultivare cu celule, numit monostrat
- Stadiul stationar – toata suprafata recipientului in care s-a initiat cultura este acoperit de
monostratul celular iar ciclul celular se opreste in faza G2. Fenomenul mai este cunoscut
drep inhibitie de contact
-

O caracteristica importanta a majoritatii celulelor este aceea ca o singura celula poate creste si
se

poate divide in conditii experimentale, proces numit clonare. O populatie de celule pure dpdv
genetic, perfect identice intre ele si care provin din diviziunea unei singure celule mama,
formeaza o clona celulara

Celulele cultivate, cu originea dintr-o singura celula formeaza colonii vizibile, atasate pe
suportul de cultura (sticla sau plastic), dupa 10-14 zile. Exista insa si celule care cresc in
suspensie, acestea oferind avantaje experimentale considerabile.

Culturile celulare primare - deriva direct dintr-un tesut animal normal, cel mai frecvent provin
din piele sau din embrion. Celulele din asemenea culturi sunt predominant fibroblaste, care se
gasesc in tesuturile conjunctive din orice parte a organismului

Ele cresc bine cand sunt plasate in flacoane de cultura, multiplicandu-se timp de 50-100 de
generatii, dupa care intra in “criza”, cand isi incetinesc cresterea, pentru ca in cele din urma sa
se opreasca din diviziune si sa moara.

Culturi transformate

Toate celulele de mamifere care sunt capabile de creºtere nelimitata in cultura, sunt derivate
ori din celule tumorale, ori din culturi de celule care au suferit unele modificari care le
aseamana cu celulele tumorale.

Culturile de celule transformate se folosesc frecvent ca mediu de infectie virala.

Celulele stem adulte

Celulele stem adulte pluripotente sunt rare si prezente in numar redus: sunt intalnite in special
la nivelul cordonului ombilical. Majoritatea celuleler stem adulte sunt multipotente:
mezenchimale, adipoase, endoteliale

Aplicaţii
Culturile tisulare sunt utilizate pentru:

- studiul celulelor în micromedii reglate fizic şi fiziologic;

- caracterizarea şi validarea unui stoc de celule;

- minimizarea utilizării animalelor de experienţă;

- studii de transfecţie (introducerea ADN exogen în genomul unor celule izolate şi

caracterizate pentru investigarea comportamentului celular şi mutaţiilor);

- inginerie proteică – studiul mecanismelor de semnalizare şi de răspuns celular citotoxic sau

genotoxic, mecanisme sintetice de răspuns la stimuli externi;

Compoziţia mediilor de cultură:

- serul – este un amestec complex de albumine, factori de creştere şi inhibitori ai acestora.

Este un element esenţial al mediilor de cultură pe bază de ser. Cel mai folosit este serul
fetal de viţel
- săruri anorganice: sunt necesare pentru menţinerea echilibrului osmotic şi reglarea
potenţialului de membrană
- sisteme tampon, care sunt necesare pentru menţinerea pH-ului (tampon fosfat, tampon
bicarbonat de sodiu şi CO2 – uşor de obţinut într-un incubator cu CO2, ieftin şi netoxic); în
mediu există şi un indicator al pH-ului (roşu fenol care virează de la galben la roşu aprins
şi apoi la violaceu);
- carbohidraţi: reprezintă sursa principală de energie pentru celule. Se utilizează în special
medii cu glucoză, galactoză dar şi cele cu maltoză sau fructoză;
- vitamine: sunt prezente fie în ser (pentru mediile pe bază de ser) sau sunt adăugate în
mediile artificiale. Cele mai importante vitamine pentru culturi celulare sunt cele din
grupul B, necesare pentru creştere şi proliferare, riboflavina, tiamina şi biotina;
- proteinele şi peptidele sunt importante în mediile artificiale; includ albumina, transferina,
fibronectina;
- lipide şi acizi graşi: importante pentru mediile artificiale, includ colesterolul şi steroizii;
- microelemente: Zn, Cu Se (pentru detoxifiere şi îndepărtarea radicalilor liberi), acizi
tricarboxilici şi intermediari