Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Cluj-Napoca, Str. Mntur, Nr.

3-5, 400372 Cluj- Napoca, Romnia;

Specializarea: Biotehnologii Medical-Veterinare
Nume: Mihon Ioan-Beniamin

CULTURI DE CELULE I ESUTURI ANIMALE IN BIOREACTOARE

Principalul scop al biotehnologiei este obinerea de produse sau servicii utile activitii
umane, cu ajutorul organismelor vii.
Procesul de baz n biotehnologie este procesul biologic", dup cum procesul de baz n
tehnologia chimic este procesul chimic". Spaiul n care se desfoar o reacie sau un proces
chimic se numete reactor chimic". In mod asemntor, spaiul n care se desfoar un proces
biologic se numete bioreactor.
Dei procesul de baz din tehnologia de biosintez este procesul biologic", el aparine,
totui, domeniului ingineriei biochimice, care se ocup de studiul proceselor de fermentaie aerob
i anaerob, al reaciilor enzimatice, precum i de procese specifice industriei fermentative, cum ar
fi: sterilizarea, . pasteurizarea, liofilizarea, uscarea prin atomizare, izolarea i purificarea produselor
extrase din mediile biologice.
Descoperirile succesive i dezvoltarea spectaculoas a biotehnologiei au favorizat att
studiul aprofundat al proceselor implicate, ct i al aparaturii utilizate, n principal, al
bioreactoarelor. S-a nscut astfel bioingineria", care studiaz bioprocesele sub toate aspectele
(modul de desfurare, cinetic, transfer de mas i cldur), oferind soluii de optimizare a
procesului biotehnologie.
 n bioreactor, transformarea materiilor prime este realizat de sistemul enzimatic al
microorganismelor vii, al celulelor animale i vegetale sau de enzimele izolate din acestea. Reuita
experimentului biotehnologie depinde n cea mai mare msur de condiiile optime de cretere a
microorganismelor create n bioreactor. Celulele se lupt continuu cu modificrile din mediul
nconjurtor, astfel nct s obin i s-i menin condiiile optime de cretere. ntr-un bioreactor,
aceast tendin a celulelor este asistat, este controlat n mod continuu. Reactorul trebuie s
asigure aprovizionarea continu a celulelor cu mijloacele necesare creterii sau producerii de
metabolii, asigurnd pe ct este posibil valorile optime pentru pH, temperatur, concentraia
subtratului, concentraiile n sruri minerale, factorii de cretere i pentru concentraia n oxigen.
n legtur cu reactorul n care trebuie s aib loc procesul biologic sau biochimic, apar
urmtoarele probleme importante:
care este cel mai bun reactor pentru o transformare biochimic dat;
cum se calculeaz mrimea i volumul interior util, alte elemente constructive al bioreactorului;
care sunt condiiile optime de operare, astfel nct bioreactorul s realizeze performanele dorite.
Fenomenele care au loc n bioreactor au un caracter complex, datorit interdependenei
fenomenelor de transfer cu cele biochimice. Analiza procesului trebuie s ia n considerare, pe lng
reaciile biochimice propriu-zise, i fenomenele fizice cu care acestea interacioneaz i anume:
curgerea, transferul de mas i transferul de cldur, prezente n orice reactor industrial. Descrierea
cantitativ a acestor fenomene furnizeaz ecuaiile cu ajutorul crora bioreactorul poate fi analizat,
optimizat, dimensionat, reglat.

CONCEPTE DE BAZ N OPERAREA BIOREACTOARELOR

Exist dou sisteme majore de cultivare a microorganismelor care s-au impus cu timpul n
domeniul biotehnologiei:
n sistem submers;
n culturi de suprafa.
n cazul cultivrii microorganismelor n sistem submers, mediul de cultur este lichid, agitat
i aerat; din punct de vedere al continuitii procesului, se disting trei moduri de operare:
discontinuu, semicontinuu i continuu.
Operarea n sistem discontinuu, adic n arje (sistem batch). Cultivarea ncepe la timpul
t = 0 i se termin la timpul t = t'. La nceput, proliferarea celulelor are loc n condiii nelimitative.
Dup ce s-a atins densitatea maxim n celule are loc operarea n condiii limitative de substrat.
Substratul se refer la unul dintre nutrieni (sursa de carbon, sursa de azot etc.) sau la oxigen.
Operarea n sistem continuu (continuous operation"). Aceasta presupune alimentarea
continu cu nutrieni i n acelai timp evacuarea din reactor a unei cantiti echivalente de mediu de
cultur.
Operarea n sistem semicontinuu (extended culture operation"). n acest caz, reactorul
este astfel operat nct concentraia substratului limitativ este pstrat constant prin aprovizionarea
sa continu.

CARACTERIZAREA BIOREACTOARELOR
1. Bioreactorul discontinuu
Bioreactorul discontinuu este caracterizat prin amestecarea ideal a mediului de cultur i
prin operarea n arje: se ncarc componentele mediului, se inoculeaz, iar dup un interval de timp
determinat se descarc mediul de fermentaie coninnd produii de biosintez.

2. Bioreactorul continuu
n cazul cultivrii continue, prelungirea fazei de cretere exponenial un timp nedefinit se
realizeaz prin adugarea continu n reactor a unei soluii de mediu proaspt cu un debit
volumetric i eliminarea continu a biomasei cu acelai debit, astfel nct volumul biomasei din
fermentator s rmn constant.
Pentru stabilirea ecuaiei ce genereaz dezvoltarea microorganismelor, trebuie s se in seama
de faptul c variaia concentraiei biomasei este datorat existenei a dou fenomene antagoniste:
-creterea numrului microorganismelor datorit dezvoltrii populaiei
-scderea cantitii de microorganisme datorit eliminrii lor din sistem.
3. Bioreactorul cu recirculare extern
In unele cazuri, mediul de fermentaie de la ieirea din bioreactor este supus unei operaii de
separare (prin centrifugare, filtrare, sedimentare), iar concentratul coninnd biomasa se recircul
parial n bioreactor.
4. Bioreactorul ideal cu deplasare (D) (curgere tip piston)
Reactoarele cu amestecare, operate discontinuu sau continuu sunt tipurile de bioreactoare cel
mai frecvent ntlnite n biotehnologie.
Exist ns situaii n care se utilizeaz i reactoarele tubulare (cu diametrul mult mai mic
dect lungimea), acestea avnd urmtoarele avantaje: construcie simpl, fr zone stagnante; n
acest caz ridicarea la scar industrial se realizeaz mai uor, fr riscuri; se poate regla durata de
staionare a celulelor n bioreactor, astfel nct conversia substratului s fie mai mare i concentraia
produsului finit mai mare;
-spumarea este mai mic;
-eforturile de forfecare sunt mai mici, deci distrugerea pereilor celulelor este mai mic.
Reactorul cu o curgere tip piston este caracterizat prin existena unui profil plan de viteze n
seciune perpendicular pe direcia de deplasare a fluidului (axa reactorului). Aceasta este o
idealizare, deoarece implic o amestecare radial infinit i lipsa amestecrii axiale.

Celulele utilizate in bioreactoare

Culturile celulare statice sunt cele mai frecvent aplicate metode de cultur celular.
ntre inerea este u oar, ieftin i nu necesit echipamente de laborator specializate.
Plcile Petri sau baloanele de cultur de esut din plastic de unic folosin sunt utilizate
cel mai frecvent. Practic exist dou tipuri de culturi de esut conven ionale: Celule
aderente care cresc n culturi monostrat i celule neaderente care cresc n culturi de
suspensie. n ambele cazuri, culturile de celule conven ionale sunt capabile s men in
celulele la densit i relativ sczute. Problema principal se ridic n ceea ce prive te
culturile celulare statice atunci cnd sunt necesare un numr mare de celule i culturile
conven ionale trebuie s fie scalate pentru a fi adugate bioreactoarelor. n culturile
conven ionale, aportul de nutrien i este men inut prin schimbarea frecvent i periodic a
mediului de cultur, care este consumatoare de timp i implic un risc ridicat de infec ie.
Avantajele mediului dinamic al celulelor bioreactoare includ furnizarea dinamic i
continu de nutrien i i oxigen. Aceste caracteristici fac posibil formarea structurilor de
esut 3D mai mari. Cu toate acestea, disponibilitatea nutrien ilor i a oxigenului n
interiorul unei construc ii de esut 3D este nc problematic. n timp ce n culturile
celulare 3D celulele celulelor celulare directe sporesc comunicarea celular, transportul de
oxigen, substan e nutritive i metaboli i este nc o problem provocatoare. n primul rnd,
oxigenul i substan ele nutritive ar trebui s difuzeze de la mediul static la celul de
suprafa . Aceasta prive te con inutul de oxigen i capacitatea de transport a oxigenului
din mediu. Difuzarea de la celulele de suprafa la structurile mai profunde este, de
asemenea, important. Parametrii critici sunt porozitatea constructului de celule / esuturi
cultivate. n mod evident, grosimea constructului de esut este un parametru critic. n
condi ii statice, grosimea esuturilor nu trebuie s dep easc 100 m. n mediul dinamic
al bioreactoarelor, acest parametru poate fi mrit de mai multe ori.
 Un bioreactor complet automatizat men ine factorii fizico-chimici i biologici la un
nivel optim i men ine celulele n mediu de suspensie. Cel mai potrivit bioreactor folosit
este un bioreactor cu bucl compact format din rotoare marine. Celulele animale, spre
deosebire de celulele bacteriene, cresc foarte ncet. Principalele surse de carbon i energie
sunt glucoza i glutamina. Lactatul i amoniacul sunt produsele lor metabolice care
afecteaz cre terea i productivitatea celulelor. Astfel, monitorizarea on-line a glucozei,
glutamatului i amoniacului se efectueaz prin analiza injectrii fluxului on-line (FIA)
utiliznd cromatografia de gaz (GC), cromatografia lichid de nalt performan (HPLC)
etc.
n culturile lotului, se utilizeaz, n principal, sticle de rol cu bile microcarrier
(pentru celule aderente) i baloane spinare (pentru culturi de suspensie) n procesul de
cultur a celulelor animale.

Ingineria celulelor si esuturilor animale

Ingineria esuturilor se refer la aplicarea principiilor ingineriei la cultura celular
pentru construirea unit ilor func ionale anatomice - esuturi / organe. Scopul ingineriei
tisulare nu este altceva dect s alimenteze diferitele pr i ale corpului pentru repararea
sau nlocuirea esuturilor sau a organelor deteriorate. Acum este posibil s creasc celulele
pielii, celulele sanguine celulele cardiace etc. prin utilizarea capacit ii celulelor stem de a
prolifera i diferen ia.
n ultimul deceniu, activitatea de cultur a esuturilor la animale a demonstrat c
practic orice esut uman sau organ poate fi cultivat n cultur. Acest lucru a devenit posibil
numai dup ce a devenit cunoscut faptul c capacitatea celulelor de cultur de a suferi o
diferen iere poate fi restabilit. "Pielea" a fost primul organ care a fost cultivat n medii
artificiale i ar putea fi utilizat cu succes pentru transplant dup arsuri grave ale pielii. n
ultimii ani, unele companii biotehnologice, cum ar fi ATS (Advanced Tissue Science,
SUA), Biosurface Technology (BTI, Cambridge) i organogenez, dezvolt piele artificial
n stadiul studiilor clinice.
n domeniul nlocuirii esuturilor, aten ia se concentreaz asupra cartilajului
artificial. Deoarece nu este vascularizat, nu este respins datorit rspunsului imunogen.
Acest lucru va avea o mul ime de implica ii n tratamentul leziunilor i bolilor asociate
sportului, cum ar fi artrita.
 Aplica iile culturii celulelor animale

Culturile de celule animale sunt folosite pentru o gam divers de cercetare i

dezvoltare. Aceste domenii sunt:
A) producerea de vaccinuri antivirale, care necesit standardizarea liniilor celulare
pentru multiplicarea i analiza virusurilor.
B) Cercetarea cancerului, care necesit studiul diviziunii celulare necontrolate n
culturi.
C) Tehnici de fuziune celular.
D) manipularea genetic, care este u or de realizat n celule sau culturi de organe.
E) Produc ia de anticorpi monoclonali necesit liniile celulare n cultur.
F) Produc ia de medicamente farmaceutice care utilizeaz linii celulare.
G) analiza cromozomilor celulelor derivate din uter.
H) Studiul efectelor toxinelor i poluan ilor folosind liniile celulare.
I) Utilizarea pielii artificiale.
J) Studia i func ia celulelor nervoase.

BIBLIOGRAFIE

1. Lubiniecki, A.S., ed. (1990) Large-Scale Mammalian Cell Culture Technology, Dekker
2. Chisti, Y. (1993) Animal cell culture in stirred bioreactors: observations on scale-up.
Bioprocess Eng. 9, 191196
3. www.coursera.org
4. www.researchgate.net
5. http://www.sciencedirect.com
6. www.slideshare.net
7. Anderson, K.W., Grulke, E., and Gerhardt, P. (1985) Biotechnol. Bioeng. 27, 917-920
8. http://www.nature.com
9. www.sciencedaily.com
10. nasasearch.nasa.gov
11. http://www.esa.int
12. http://search.sciencemag.org