REFERAT

Ingineria genetică şi biotehnologiile folosite ca metode de

ameliorarea plantelor
 Ingineria genetică şi biotehnologiile folosite
ca metode de ameliorarea plantelor

Ingineria genetică reprezintă una dintre cele mai moderne ramuri ale biologiei, fiind
rezultatul progreselor ştiinţifice şi tehnice înregistrate în epoca contemporană. Apariţia
acestui nou domeniu de activitate a fost determinată în primul rând de aprofundarea
cunoştinţelor de genetică la nivel molecular.
Acest fapt a permis elaborarea unor metode complet noi, cum ar fi cele de izolare şi
de sinteză a genelor, de transfer al acestora de la o specie la alta, etc.
Se poate afirma că ingineria genetică s-a dezvoltat datorită necesităţilor sociale care
au impus găsirea unor modalităţi noi de rezolvare a unor probleme mari ale umanităţii, cum
ar fi: nevoia crescândă de alimente şi în primul rând de proteine.
Ingineria genetică s-a dezvoltat rapid mai ales în ultimele decenii şi poate fi definită
ca un ansamblu de metode şi tehnici prin care este posibilă sinteza artificială şi transferul de
gene de la un organism la altul, sau chiar de la o specie la alta, în vederea obţinerii de
organisme cu o nouă zestre ereditară -genotipuri noi - cu calităţi dorite şi caracteristici
determinate anticipat (P.Raicu,1986).
Apariţia şi dezvoltarea ingineriei genetice s-a bazat pe dezvoltarea ştiinţelor biologice
şi a geneticii, ştiinţe care au elaborat o serie de teorii şi ipoteze de mare valoare ştiinţifică. O
astfel de teorie este teoria celulară, elaborată în 1839 de către Schleiden şi Schwann, teorie
care fundamentează ipoteza totipotenţei celulelor. Această idee avea un suport practic de
lungă durată, omul cunoscând şi exploatând de mult timp capacitatea de regenerare a
diferitelor plante din organe vegetative.
Pe baza dezvoltării ştiinţei s-a reuşit regenerarea unei plante dintr-o singură celulă,
ceea ce de fapt nu este decât o expresie superioară a înmulţirii vegetative a plantelor.
Posibilitatea ca dintr-o singură celulă să se obţină un număr nelimitat de organisme
identice genotipic, a condus la ideea că prin aceste metode se poate scurta durata şi accelera
procesul de ameliorare. În etapa actuală acest lucru reprezintă o cerinţă imperioasă deoarece
durata mare a procesului de ameliorare reprezintă un impediment major.
Pe lângă genetică şi ameliorarea plantelor beneficiează mult de pe urma ingineriei
genetice. Dar tehnicile de inginerie genetică nu au aplicabilitate numai la plante ci şi la
microorganisme şi animale.
Cel mai important rezultat al ingineriei genetice folosit pentru ameliorare este
creşterea variabilităţii genetice. Prin înlăturarea mecanismelor genetice ce împiedică
recombinarea genelor din cromozomii speciilor înrudite s-au creat posibilităţi multiple de a
obţine noi combinaţii de gene.
Pentru încorporarea genelor valoroase de la diferite specii, în organismele hibride s-au
elaborat tehnici noi cum sunt:
 adiția de cromozomi;
 substituţia de cromozomi;
 transferul de cromozomi prin translocaţii;
 transferul de gene valoroase prin intermediul ADN recombinat.
De asemenea, au fost elaborate şi alte metode şi tehnici noi dintre care cele mai
importante sunt:
 cultura în vitro de celule şi ţesuturi vegetale;
 hibridarea somatică;
 androgeneza şi ginogeneza experimentală;
 cultura de embrioni imaturi.
 Cultura în vitro de celule şi ţesuturi vegetale

Culturile în vitro se referă la creşterea de ţesuturi sau a celulelor vegetale pe medii

sintetice, sterile sau a unor fragmente vegetale (rădăcină, meristem frunze, embrion,
endosperm, antere, microspori, etc).
Fragmentul respectiv se numeşte inocul şi creşte, se multiplică şi permite efectuarea
de subculturi.
Metoda se bazează pe capacitatea celulelor de a regenera plante normale. Crescute pe
medii nutritive speciale, celulele somatice se comportă ca un zigot (celulă ou), se divid
continuu formând ţesuturi diferite din care se reconstituie o plantă întreagă.
După cum arată Dorina Cachiţa-Cosma (1987), inoculul constituie o unitate vie,
independentă de locul de origine, care deţine integral informaţia genetică preluată de la planta
donatoare precum şi toate funcţiile pe care le îndeplinesc ţesuturile la locul de origine.
Un aspect important al culturii în vitro îl constituie mediul aseptic de cultură.
Compoziţia chimică a mediului este un element de bază alături de perioada de iluminare, care
dirijează dezvoltarea explantelor. Aceste medii de cultură conţin substanţe anorganice cât şi
organice.
Excesul sau carenţa unui element provoacă modificări la nivel morfologic sau
metabolic.
Pe lângă substanţele chimice din mediul de cultură, foarte important este ca pH-ul să
fie reglat la valorile indicate de metodica de lucru, fapt ce se realizează cu soluţii diluate
(0,1N) de HCL sau KOH.
Pentru ca explantul să se poată dezvolta, după reglarea pH- ului se adaugă un agent
gelifiant - agar agarul. Scopul unor astfel de culturi este următorul:
 multiplicare clonală rapidă a unor elemente vegetale valoroase, pornind de la
meristeme, componente florale, fragmente de inflorescenţe, boboci, etc.;
 obţinerea de material săditor nevirozat atunci când se folosesc meristeme
apicale;
 obţinerea de plante haploide prin folosirea anterelor sau a polenului -
androgeneză;
 culturi de celule în scopuri variate cum ar fi: producerea de biomasă,
selecţionarea de linii celulare rezistente la factori stresanţi, etc.;
 culturi de protoplaşti în vederea obţinerii de hibrizi somatici.
Fenomenul de înmulţire a plantelor prin culturi în vitro se numeşte microînmulţire sau
micropropagare.
Regenerarea plantelor in vitro se poate realiza prin parcurgerea unui ciclu de cultură
în două etape. În prima etapă are loc creşterea calusului şi în a doua diferenţierea şi
organogeneza. Regenerarea plantelor poate avea loc prin organogeneză somatică şi prin
embriogeneză somatică. Prin ambele metode s-au obţinut plante regenerate la un număr
considerabil de specii.
Trebuie subliniat faptul că această tehnică este din ce în ce mai folosită pe plan
mondial, fiind o metodă modernă şi foarte eficace. În prezent ea este practicată cu precădere
la plantele ornamentale, la specii floricole, pomi şi arbuşti fructiferi, căpşun, etc.
Folosirea pe scară largă a noului sistem de înmulţire poate fi explicat în primul rând
prin aceea că numărul de descendenţi obţinuţi de la o plantă este incomparabil mai mare
decât în cazul metodelor clasice. Astfel, la gerberă, o plantă poate da naştere la 30 - 40
descendenţi pe an prin metoda clasică iar prin cultura în vitro la 200 000 descendenţi.
Ca orice metodă, prezintă anumite dezavantaje, dintre care cel mai important este
diminuarea diversităţii genetice, datorită utilizării unui număr mic de indivizi (soiuri). Acest
lucru poate fi înlăturat prin stocarea în bănci de gene a întregului genofond al speciei în
discuţie.

Hibridarea somatică
Hibridarea pe cale somatică, reprezintă o realizare importantă a ingineriei genetice şi
care oferă posibilităţi noi în procesul de ameliorare a plantelor. Acest tip de hibridare se
bazează pe existenţa unor celule vegetale nude, lipsite de peretele celular, ai căror nuclei
fuzionează fără a fi nuclei gametici.
Aceste celule vegetale nude se numesc protoplaşti şi se obţin din meristeme sau alte
ţesuturi ale plantelor (mezofilul frunzei) prin izolarea lor cu ajutorul unor enzime (pectinaza,
celulaza, etc.).
Datorită lipsei peretelui celular, protoplaştii de la diferite specii pot fuziona între ei
spontan sau cu ajutorul unor substanţe chimice (polietilen glicolul-PEG, ionii de calciu în
soluţii cu pH ridicat, etc).
Acest lucru crează posibilitatea de a uni experimental două
organisme superioare, pe altă cale faţă de cea sexuată.
Protoplaştii hibrizi rezultaţi vor avea un număr de cromozomi egal cu suma
cromozomilor de la cei doi protoplaşti iniţiali şi vor conţine un amestec al celor două
citoplasme.
Primii hibrizi somatici între două specii diferite au fost obţinuţi în anul 1972 de către
cercetătorul american P.S. Carlson, între două specii de tutun Nicotiana glauca (2n=24) şi
Nicotiana langsdorfii (2n=18).
Pentru selecţia hibrizilor somatici s-au elaborat sisteme de selecţie bazate pe medii de
cultură selective, care să permită supravieţuirea celulelor fuzionate.
În ameliorarea plantelor se pot folosi atât amphidiploizii rezultaţi din fuzionarea
genomurilor celor două specii, cât şi celulele hibride la care s-a realizat transferul unui mic
segment cromozomial pe care se găsesc anumite gene, cum sunt de pildă cele ce determină
rezistenţa la anumite boli.
De exemplu, se urmăreşte realizarea de hibrizi somatici orz x secară, pentru transferul
rezistenţei la ger, de la secară la orz. La cartof, se speră obţinerea de forme tetraploide, prin
hibridarea somatică a unor linii dihaploide.
Astfel, hibridarea somatică devine o alternativă la hibridarea sexuată, oferind
posibilitatea încrucişării unor specii diferite îndepărtate filogenetic, care nu pot fi încrucişate
pe cale sexuată. Această cale neconvenţională va completa metodele clasice de ameliorare a
plantelor.
Au fost deja obţinute multe rezultate pe această cale, încrucişând specii din genuri sau
chiar familii diferite, rezultând organisme noi, inexistente în natură. De exemplu, hibridul
Pomato - rezultat din încrucişarea dintre cartof (Solanum tuberosum) şi tomate
(Lycopersicum esculentum), unele linii celulare hibride între speciile Vicia faba x Petunia
hybrida, Petunia hybrida x Atropa belladona, Arabidopsis thaliana (2n=40) x Brassica
campestris (2n=20).
Hibrizii parasexuali prezintă o mare instabilitate genetică, de cele mai multe ori
cromozomii uneia dintre specii fiind eliminaţi treptat. Actual sunt folosiţi mai mult în scop
ştiinţific dar se speră în realizarea unor hibrizi stabili care să întrunească o serie de caractere
valoroase.
Pentru ameliorarea plantelor şi animalelor, utilizarea metodei hibridării somatice,
reprezintă o realizare de o inestimabilă valoare teoretică şi practică.

Androgeneza şi ginogeneza experimentală

 S-a observat că la plante apar în mod spontan, din oosferele nefecundate, plante
haploide ce conţin în celulele somatice un număr de cromozomi egal cu cel din gameţi. La
aceste plante toate genele se exteriorizează, deci genotipul este identic cu fenotipul.
Primele încercări de a obţine plante pe cale experimentală au folosit oosferele, dar
tehnica s-a dovedit greoaie şi atunci s-a făcut apel la antere sau grăunciori de polen. Primele
rezultate au fost obţinute încă din 1963 de către Yamada şi colaboratorii săi, pornind de la
antere de Tradescentia. Ulterior au fost elaborate tehnicile de obţinere de plante haploide prin
cultura anterelor la peste 150 specii. Totuşi, nu la toate speciile s-au putut obţine forme
haploide şi chiar în cadrul aceleaşi specii există diferenţe mari între soiuri (Mattingly şi
Collins, 1975).
Haploizii obţinuţi experimental prezintă importanţă în procesul de ameliorare a
plantelor. Astfel, la formele monohaploide se exteriorizează toate genele şi în consecinţă
orice mutaţie poate fi imediat detectată. Dacă aceasta este valoroasă, prin dublarea numărului
de cromozomi se obţine o plantă diploidă homozigotă, posesoare a mutaţiei respective.
Folosirea haploidiei scurtează timpul de obţinere a unor forme total homozigote,
putându-le obţine într-o singură generaţie, ceea ce pe cale clasică la plantele alogame se
realizează în 7-9 generaţii. Utilizarea unor astfel de părinţi la hibridare, determină apariţia
într-o măsură mai mare a fenomenului heterozis, întrucât prin consangvinizare nu se poate
ajunge la o homozigoţie absolută.
În ultimul timp haploizii androgenetici şi ginogenetici sunt tot mai utilizaţi în
ameliorarea unor plante importante, ca urmare a faptului că au fost puse la punct tehnici
eficiente de obţinere a haploizilor şi dihaploizilor.
La plantele autogame (grâu, orz, leguminoase pentru boabe) prin haploizi şi apoi
dihaploidizare se obţin forme mai rezistente la unele boli, forme la care unele caractere de
interes major (capacitate de înfrăţire, număr de seminţe în spic), sunt superioare formelor din
care provin. De asemenea, se poate adăuga faptul că dihaploizii prezintă o puritate genetică
mult mai mare, fenomen foarte important în procesul producerii de sămânţă.

Cultura in vitro de embrioni imaturi

În cazul multor încrucişări sexuate între specii diferite, datorită lipsei de omologie a
cromozomilor şi a incompatibilităţii genetice chiar dacă încrucişarea reuşeşte se obţin
embrioni care supravieţuiesc o perioadă scurtă de timp sau seminţele obţinute au o capacitate
de germinare foarte redusă. La sâmburoasele cu maturare timpurie (cireş, prun, piersic), apar
fenomene de resorbţie a substanţelor de rezervă din embrion, acesta nemaiavând capacitate
germinativă.
Aceşti embrioni pot fi prelevaţi la începutul maturării în pârgă fructelor şi întăririi
endocarpului, apoi trecuţi pe medii artificiale de cultură, după care prin repicări succesive se
obţin plante hibride întregi.
Această tehnică a fost utilizată cu succes la pomii fructiferi, mai ales la obţinerea
soiurilor timpurii de piersic şi nectarine, obţinându-se soiuri valoroase. Plantele astfel
obţinute au fructificat în al doilea an (Botu,I.,1994).
Pentru obţinerea de genotipuri hibride triplu haploide se poate face cultura in vitro de
celule din endosperm. Endospermul este un ţesut specific care nu participă direct la fecundare
şi care la majoritatea angiospermelor este triploid, rezultând din fuziunea a trei nuclei
haploizi.
Plantele triploide nu au seminţe şi sunt în multe cazuri de calitate superioară (ex.
pepenele verde, bananierul, etc). Sporirea garniturii haploide de cromozomi faţă de starea
normală, determină creşterea volumului unor organe şi o mai bună sinteză a metaboliţilor
primari şi secundari.
 Clonarea şi regenerarea plantelor triploide in vitro asigură multiplicarea rapidă a
acestora şi stabilitatea genetică a noilor genotipuri trihaploide.
Datele prezentate succint în acest capitol, demonstrează posibilităţile imense ale
ingineriei genetice de a revoluţiona procesul de ameliorare a plantelor, prin posibilităţile pe
care le oferă de a construi plante noi, cu o arhitectură nouă, cu calităţi implicit superioare
celor existente la ora actuală.
 BIBLIOGRAFIE

1.Marin S., 2006, Ameliorarea plantelor agricole