Temă la obiectul Biotehnologie :

HIBRIDAREA SOMATICĂ
A efectuat:Curbet Ilie
A verificat : Bondari Lidia
 Hibridarea somatică
 Constă în fuzionarea
(contopirea) a doi sau mai mulţi
protoplaşti şi refacerea unei noi
celule care conţine material genetic
(nuclee, cromozomi, organite
citoplasmatice) provenit din celule
care aparţin aceleiaşi specii sau la
specii diferite (fără a recurge la
hibridarea sexuată).

 Cu alte cuvinte, hibridarea

somatică prin fuziunea
protoplaştilor este o metodă de
obţinere a hibrizilor între plante
aparţinând aceleiaşi specii sau unor
specii diferite, imposibil de realizat
prin metode clasice.
 Hibridarea somatică

S-a constatat că protoplaştii izolaţi

enzimatic sunt capabili să fuzioneze
spontan, dar cu o frecvenţă relativ mică
(8% la Datura innoxia şi 11 % la Lilium
longiflorum), deoarece sunt încărcaţi cu
sarcină electrică negativă.
 Hibridarea somatică
Keller şi Melchers (1973) au elaborat prima metodă eficientă de
inducere a fuzionării protoplaştilor prin neutralizarea sarcinilor
electrice, folosind ioni de Ca++ şi K+ cu sarcină electrică pozitivă
(CaCl2, KH2PO4), la temperatura de 37 0C şi pH alcalin (9,5-10,5).
Ulterior, s-a elaborat metoda de fuzionare prin tatament cu
polietilenglicol (care este indicatorul cel mai eficient), aplicat în
concentraţie de 25-40 %. Totuşi, acesta prezintă o oarecare toxicitate
care poate atinge 50% din protoplaşti, ducând în unele cazuri la
formarea de celule multinucleate, prin fuziuni ale mai multor
protoplaşti.
Zimmermann (1981) a elaborat o metodă modernă în care fuziunea
protoplaştilor este indusă într-un câmp electric alternativ discontinuu,
aceasta realizându-se într-un procent de 80 -100%, cu o eficienţă
mult mai mare decât prin tratamentul cu polietilenglicon, deoarece nu
afectează viabilitatea protoplaştilor.
 Hibridarea somatică
Prin fuzionarea protoplaştilor de la diferite specii este
posibilă manipularea informaţiei genetice şi hibridarea celulară
interspecifică, cu rol deosebit în lucrările de ameliorare, oferind
numeroase posibilităţi de combinări genomice pentru a crea
forme cu totul noi.
Se obţin celule hibride,
interspecifice sau intergenerice,
cu o nouă zestre ereditară şi cu
caracteristici noi.
În urma fuzionării
protoplştilor se formează produşi
de fuziune homocariotici (în
cadrul celulelor ce aparţin
aceleiaşi specii) şi heterocariotici
(în cazul fuzionării celulelor ce
aparţin la două specii diferite).
 Hibridarea somatică- faze

Hibridarea somatică între două specii diferite constă din

următoarele faze:
 preluarea materialului iniţial folosind ţesuturi de meristem
foliar;
 izolarea celulelor prin tratamente enzimatice;
 obţinerea de protoplaşti şi fuzionarea lor până la realizarea
heterocarionului;
 începerea diviziunilor mitotice;
 formarea calusului;
 obţinerea plantelor prin culturi de calus selecţionat;
 regenerarea plantelor întregi transplantate la sol.
 Hibridarea somatică
Uneori din hibridarea celulară nu regenerează
plante, ci se obţin numai linii celulare hibride.
Binding şi Nehls (1978) au obţinut astfel de linii
celulare hibride între speciile Vicia faba x Pethunia
hybrida din care a generat un calus, fără a evolua în
formarea de plante întregi.
Alte hibridări somatice, capabile să rupă barielele
interspecifice s-au mai realizat între:
 Pethunia parodii şi Pethunia parviflora,
 Pethunia hybrida şi Atropa belladona,
 Datura innoxia şi Atropa belladona, etc.
 Aplicaţii ale hibridării celulare

Între reproducerea sexuată la plantele superioare şi

fuzionarea protoplaştilor există diferenţe esenţiale.
În cadrul reproducerii sexuate, informaţiile
citoplasmatice sunt transmise în general numai de planta
mamă şi nu există surse de variabilitate citoplasmatică.
De asemenea, nu apar recombinări între diferite
tipuri de formaţiuni cloroplastice sau mitocondriale.
 Aplicaţii ale hibridării celulare

1. Varaţii somaclonale
În cazul hibridării de protoplaşti, prin
combinarea genotipurilor de la speciile
incompatibile apropiate sau îndepărtate din punct
de vedere taxonomic, se obţin varaţii somaclonale
din care pot fi selecţionate noi forme valoroase
sub aspect genetic, utilizate ca material iniţial în
lucrări de ameliorare.
 Aplicaţii ale hibridării celulare
2. Obţinerea de hibrizi celulari (cibrizi)
Când fuziunea de hibrizi de protoplaşti este urmată de o
recombinare genetică, se poate realiza o hibridare atât a
nucleilor, cât şi a organitelor citoplasmatice (cloroplaste,
mitocondrii). Dacă unul dintre nuclei este eliminat în cursul
divizunilor succesive, se obţin hibrizi citoplasmatici numiţi cibrizi
în care apar, cel mai frecvent, recombinări mitocondriale.
Definitie. Cibrizii sunt hibrizi celulari care îmbină genele nucleare ale
unui genitor cu cele extranucleare ale celuilalt.
Din heterocarioni rezultă hibrizi somatici, care înglobează cromozomii
celor 2 specii, sau cibrizi care înglobează cromozomii şi genele nucleare
de la o specie, cu genele extranucleare de la cealaltă. În unele cazuri
apar himere formate din ţesuturi şi celule diferite genetic. De aceea,
selecţia adevăraţilor produşi de hibridare somatică este o problemă
cheie a hibridării parasexuale.
 Aplicaţii ale hibridării celulare

 La plantele superioare, regenerarea de organisme

noi, pornind de la genotipuri îndepărtate genetic şi
protoplaşti transformaţi prin recombinare genetică,
constituie o metodă eficientă de ameliorare. Astfel se
realizează creşterea variabilităţii materialului iniţial de
selecţie şi transformarea fondului genetic.
 Prin fuzionarea de protoplaşti s-au realizat mulţi
hibrzi somatici vegetali şi animali, unii dintre aceştia
dovedindu-se a fi adevărate himere sau aberaţii
biologice.
 În sectorul vegetal pot fi menţionaţi cibrizii: grâu + orz,
tomate + cartofi, Vicia + Petunia, între specii de
Nicotiana, etc.
 Aplicaţii ale hibridării celulare
3. Transferul de material genetic în protoplasti

Elaborarea unor metode eficiente de obţinere a unor cantităţi mari

de protoplaşti a făcut posibilă folosirea acestora în vederea unor
manipulări genetice la plante.
Transferul direct de gene, prin hibridare somatică se poate realiza în
faza de protoplast, protejat la exterior numai de membrana plasmatică
(plasmalema).
Includerea în protoplaste a unor microorganisme, virusuri, organite,
macromolecule exogene se poate realiza pe 3 căi:
 - prin endocitoză – prin străbaterea membranelor plasmatice după
degradarea peretelui celular. Pe această cale au fost incluse în
protoplaşti: alge, virusuri, bacterii, drojdii, nuclei, cloroplaste, mitocondrii,
ADN – exogen, etc. Membrana plasmatică poate fi uşor traversată de
molecule de ADN – extern care va migra până la nucleu şi se va integra în
cromozomi.
 - fuzionarea membranelor;
 - transfer prin intermediul lipozomilor , care sunt vezicule artificiale de
fosfolipide ce pot include diverse materiale, inclusiv ADN, pe care îl pot
transfera în protoplaşti, prin fuzionarea acestor tipuri de celule.
 Aplicaţii ale hibridării celulare

 Tehnologia ADN-ului recombinat, prin fuziunea protoplaştilor a

devenit în prezent o ramură de vârf a biologiei, care va reuşi să
elaboreze produse cu rol esenţial în dezvoltarea economiei
mondiale
Ex. mărirea rezistenţei plantelor la factorii chimici sau fizici
(toxine, erbicide) şi la factori abiotici (ger, secetă, salinitatea
solului)

 Tehnicile de inginerie genetică, moleculară şi celulară pot

contribui la crearea unor noi forme adaptate la stresul biotic şi
osmotic, prin cercetări care vizează funcţionarea sistemelor
enzimatice, reglarea şi transferul informaţiei genetice de la
formele rezistente la cele sensibile.
 Aplicaţii ale hibridării celulare
4. Ameliorarea plantelor şi crearea de soiuri noi

Rezultatele obţinute până în prezent arată că ameliorarea

plantelor şi BTH sunt domenii complementare care pot asigura progrese
remarcabile pentru viitor, prin valorificarea realizărilor ingineriei
genetice privind hibridarea somatică interspecifică şi intergenetică.
 Hibridarea somatică a devenit o sursă importantă de variabilitate, fie la
nivel nuclear (recombinări între genomuri), fie la nivel citoplasmatic
(modificări de ADN – mitocondrial sau ADN - cloroplastic).
 Totodată, este posibilă apariţia unui număr cât mai mare de mutaţii,
precum şi livrarea de hibrizi somatici şi cibrizi. Hibridarea somatică
poate fi un mijloc rapid de introducere a unor gene străine în interiorul
unei specii cultivate.
 Transferul unor caractere de la speciile sălbatice la cele cultivate
asigură mărirea rezistenţei plantelor hibride, atât la factori patogeni, cât
şi la facori abiotici, inclusiv pesticide.
 Aplicaţii ale hibridării celulare la
speciile floricole
Tehnologia hibridării prin fuziuni de protoplaşti este
relativ simplă în comparaţie cu alte tehnici de inginerie
genetică, în mod particular cu tehnologia ADN-recombinat.
Până în anul 1992 au fost regenerate pornind de la
culturi de protoplaşti circa 50 de specii ornamentale, atât
monocotiledonate, cât şi dicotiledonate (Ochatt şi Power -
1992).
Exemple de genuri şi specii regenerate:
Chrysanthemum – Otsuka şi col.-1985;

Gaillardia grandiflora – Binding - 1981;

Pelargonium hortorum – Yarrow şi col. – 1987, etc.

 Aplicaţii ale hibridării celulare
 Cercetările actuale ce se efectuează prin culturi de protoplaşti vizează
numeroase aspecte: introducerea de gene responsabile de fixarea
azotului atmosferic, de sinteza de noi pigmenţi, de rezistenţa la frig,
secetă, poluare etc.
 Protoplaştii sunt izolaţi de obicei din fragmente de limb, acestea sunt
introduse într-o soluţie unde au loc două operaţii simultane:
plasmoliză şi degradarea peretelui celular.
 Plasmoliza se realizează cu ajutorul zahărului din soluţie şi este
necesară pentru a evita spargerea celulelor după dispariţia peretelui
celular şi pentru a detaşa celula de peretele ei scheletic. Degradarea
peretelui pectocelulozic se face cu enzime care se determină pentru
fiecare specie.
 Condiţiile de mediu pentru realizarea acestor operaţii sunt:
temperatură de 22oC, pH = 5,5; lumina: 2000-4000 lux; durata 16-24
ore.