MANIPULAREA GENETICĂ “IN VITRO”

Manipularea genetică este o metodă a geneticii moleculare, care asigură

transferul materialului genetic de la o celulă (protoplast) la altă celulă
(protoplast), excluzând procesul sexual.

1. Hibridarea somatică (hibridarea parasexuală)- se realizează prin

fuziunea completă a nucleilor şi citoplasmelor celor doi
protoplaşti.
2. Hibridarea citoplasmatică (cibridizarea)- presupune fuziunea
nucleului şi citoplsmei unui protoplast cu citoplasma altui
protoplast;
3. Transferul de nuclei, cromosomi, fragmente cromosomiale şi
organite ( cloroplaste şi mitocondrii) la nivelul protoplaştilor.
4. Tehnica ADN-ului recombinant , care presupune utilizarea unui
vector (plasmidă sau virus), ce asigură transferul unor gene
izolate din plante, bacterii sau virusuri, la nivelul protoplaştilor
vegetali.
 Hibridarea somatică şi avantajele utilizării ei în
ameliorarea plantelor

Această tehnică constă în fuziunea spontană sau indusă a unor tipuri diferite de celule din
care rezultă celule hibride.
La plante, hibridarea somatică n-a devenit posibilă decât după ce au fost elaborate
metode eficiente de obţinere a unui tip special de celule, şi anume protoplaştii- celule
lipsite de peretele celular rigid, pecto-celulozic. În jurul anului 1960 a fost elaborată
metoda enzimatică de izolare a protoplaştilor, prin utilizarea celulazei, pectinazei,
macerozimului. În 1971, cercetătorul francez J.P. Nitsch a obţinut primele plante
regenerate la Nicotiana tabacum, pornind de la culturi de protoplaşti.
Din punct de vedere genetic, protoplaştii prezintă o deosebită importanţă pentru:

• Înmulţirea vegetativă foarte rapidă a unor genotipuri valoroase; dintr-un gram de frunze
verzi se pot obţine 2 milioane de protoplaşti, identici din punct de vedere genetic.
• Obţinerea de hibrizi somatici între două sau mai multe specii îndepărtate din punct de
vedere filogenetic.
• Fuziunea protoplaştilor aparţinând aceleaşi specii duce la obţinerea unor forme cu grade
variate de ploidie, care pot fi utilizate direct în ameliorarea plantelor; este vorba despre
multiplicarea numărului de genomuri proprii, caracteristică autopoliploizilor.

• Transferul de gene sau cromosomi în protoplaşti, fapt care permite transferul rezistenţei la
boli şi dăunători de la speciile sălbatice la cele cultivate sau a genelor care determină sinteza
unor proteine animale în celulele vegetale, fapt cu profunde implicaţii în alimentaţia umană.;
în protoplaşti pot fi transferate cele mai diverse gene, responsabile de sinteza aminoacizilor,
vitaminelor, hormonilor, antibioticelor.

• Transferul cloroplastelor în protoplaştii proveniţi de la plantele cu un sistem fotosintetic

ineficient.
În concluzie, putem afirma că protoplaştii sunt cele mai eficiente sisteme celulare folosite în
manipularea genetică, care include hibridarea somatică, transferul de ADN nuclear şi
extranuclear.
 IZOLAREA SI CULTIVAREA PROTOPLASTILOR ȘI SUBPROTOPLAȘTILOR VEGETALI

• Etapele izolării protoplaștilor:

1. Alegerea țesutului care servește ca sursă de protoplaști, sterilizarea pentru plantele
crescute ex vitro (cele mai frecvente surse sunt: mezofilul, hipocotilele, cotiledoanele,
suspensiile celulare).
2. Plasmoliza- se bazează pe o soluție ce conține un stabilizator osmotic (manitol sau
sorbitol)
3. Tratamentul enzimatic-constă în incubarea materialului vegetal într-o soluție de macerare
( celulază, pectinază, macerozim, săruri de calciu, stabilizator osmotic).
4. Purificarea protoplaștilor- se bazează pe filtrare cu filtre de nylon sau metalice ( separarea
protoplaștilor de resturile nedigerate din amestecul enzimatic), apoi protoplaștii sunt spălați
de soluția de macerare prin centrifugări repetate și centrifugarea în gradient de zaharoză
( protoplaștii se vor separa la suprafața soluției)..
 5. Stabilirea numărului și a viabilității protoplaștilor.Numărarea se realizează cu ajutorul
hemocitometrului și se raportează la 1 g țesut. Pentru evidențierea viabilității se pot utiliza
coloranți vitali absorbiți de celulele viabile sau coloranți vitali absorbiți de celulele moarte. Din
prima categorie este diacetatul de fluoresceină, care este un compus nefluorecent care
pătrunde prin membrana plasmatică. Sub acțiunea esterazelor este descompus în
fluoresceină, un compus fluorescent care nu poate trece prin membrana intactă. Protoplaștii
viabili, analizați la microscop cu lumina UV vor prezenta o fluorescență verde, în contrast cu
protoplaștii neviabili. Din cea de a doua categorie fac parte fenosafranina sau albastru Evans,
compuși pentru care membrana celulară intactă nu este permeabilă.

Izolarea subprotoplaștilor reprezintă fragmente celulare înconjurate de plasmalemă, putând

fi izolate fie prin șoc osmotic urmat de izolare mecanică, fie prin centrifugare diferențiată la
turație mare, în gradient de zaharoză și manitol.
Se pot izola următoarele tipuri de subprotoplasti:
• Citoplaști- subprotoplaști bogați în citoplasmă și organite mici, dar lipsiți de nucleu
• Miniprotoplaști sau nucleoplaști- prezintă nucleul înconjurat de un strat subțire de citoplasmă
și membrana plasmatică
• Condrioplaști sau plastoplaști, ce conțin un strat subțire de citoplasmă și preponderent un tip
de organite: mitocondrii, respectiv plastide
• Vacuoplaști- prezintă vacuola înconjurată de un strat subțire de citoplasmă și plasmalema
 Sisteme de cultivare a protoplaștilor

• Cultivarea în mediul lichid- suspensia de protoplaști este pipetată sub formă de micropicături.
• Cultivarea pe mediu solid- este o metodă mai avantajoasă deoarece se poate urmări cu
ușurință dezvoltarea coloniilor,iar agentul de gelificare este agaroza sau alginatul de sodiu.
• Cultura doică sau nurse culture- protoplaștii sunt cultivați într-o picătură de mediu lichid
separat printr-o membrană filtrantă sau hărtie de filtru de un mediu solid în care sunt
imobilizați protoplaștii.
Schema izolării protoplaştilor (după Cocking, 1960)
 Pentru înţelegerea avantajelor oferite de hibridarea somatică, reamintim unele dintre
caracteristicile esenţiale ale hibridării sexuate, precum şi impedimentele care decurg din
acestea:.
• Hibridarea sexuată asigură echilibrul dintre schimbările de ordin genetic limitând variabilitatea
individuală a descendenţei.
• La hibridarea sexuată iau parte gameţii, încrucişarea este simetrică, în sensul că gameţii femeli
şi masculi aduc o contribuţie egală în materialul genetic nuclear al descendenţei.
• În privinţa factorilor genetici citoplasmatici, aceştia se moştenesc uniparental, pe cale
maternă.
 Comparativ cu hibridarea sexuată, hibridarea somatică se realizează doar experimental şi
conferă hibridului unele avantaje, dintre care menţionăm:

• Obţinerea de hibrizi între indivizi care aparţin unor specii îndepărtate filogenetic, asigurându-
se depăşirea barierelor interspecifice.

• Obţinerea hibrizilor între specii, care se înmulţesc doar pe cale vegetativă.

• Obţinerea hibrizilor multiparentali, rezultaţi din fuziunea simultană a mai mult de două celule.
• Fuziunea dintre celulele somatice poate apărea spontan “in vitro” şi “in vivo” sau poate fi
indusă în culturile de protoplaşti cu ajutorul diferiţilor agenţi de fuziune.
Cele trei faze succesive ale fuzionării protoplaştilor sunt:
• Aglutinarea- în timpul căreia plasmalemele celor doi protoplaşti vin în contact.
• Fuziunea plasmalemelor în mici areale localizate, care se extind treptat cu formarea unor
punţi citoplasmatice, stabilindu-se continuitatea între protoplaştii adiacenţi; amestecul
citoplasmatic este complet când fuzionează tonoplaştii.
• Formarea homo-sau heterocarionilor sferici.
 În urma procesului de fuziune pot rezulta două categorii de celule multinucleate (policarioni):
 
• Homocarionii-sunt celule cu nuclei identici din punct de vedere genetic, proveniţi din acelaşi
tip de celule parentale; ei sunt de regulă produşii fuziunilor spontane intraspecifice.
• Heterocarionii- sunt celule cu nuclei diferiţi din punct de vedere genetic,rezultaţi din celule
parentale diferite; aceştia sunt consideraţi adevăraţii hibrizi.
 În cazul în care supravieţuiesc, în urma fuziunii nucleare, heterocarionii devin celule
mononucleate, adică sincarioni. Aceştia se pot menţine şi prolifera pe medii adecvate timp
îndelungat, formând calus, din care pe calea regenerării vor rezulta hibrizii vegetali. Analizele
citologice şi biochimice ale hibrizilor somatici au evidenţiat trei tipuri de hibrizi:

• Hibrizii simetrici- conţin genomurile nucleare ale ambilor parteneri de fuziune ( Helianthus
anuus x Helianthus giganteus).

• Hibrizii asimetrici- conţin în întregime genomul nuclear al unui părinte şi doar o parte din
genomul nuclear al celuilalt părinte. Această situaţie este datorată eliminării treptate a
cromosomilor, pe măsura ciclurilor celulare succesive (Brassica nigra x Brassica napus).

• Cibrizii- sunt hibrizii citoplasmatici, care conţin nucleul şi citoplasma unei celule şi citoplasma
anucleată a altei celule
Ei pot fi obţinuţi prin:
• fuziunea unui protoplast normal cu unul anucleat;
• fuziunea unui protoplast normal cu un protoplast care conţine un nucleu neviabil eliminarea
unuia dintre cei doi nuclei după formarea heterocarionului. 
Izolarea, cultivarea şi fuziunea protoplaştilor foliari (după
Bajaj, 1977)
Etapele hibridării somatice
Etapele hibridării somatice (după Carlson şi colab., !972)
 Metode de inducere a fuziunii protoplaştilor

• Metoda mecanică se bazează pe utilizarea unor micropipete de perfuzie, prin intermediul

cărora protoplaştii sunt aduşi în contact direct şi pot fuziona. Această metodă a fost elaborată
de Mitchel (1937) şi aplicată la Glycine hispida şi Arachis hypogaea.
• Metoda chimică constă în utilizarea unor substanţe ca: nitratul de sodiu, polietilenglicolul,
ionii de Ca la un pH ridicat, substanţe deosebit de eficiente în procesul aglutinării
protoplaştilor şi formării produşilor de fuziune. Este o metodă larg utilizată începând din 1909,
când Küster a obţinut homocarioni în urma fuziunii protoplaştilor de Allium cepa..
În 1972, Carlson a obţinut primele plante hibride pornind de la protoplaştii a două specii de
Nicotiana.
• Metoda imunologică, elaborată de Hartmann în 1973, se bazează pe aglutinarea protoplaştilor
cu ser de iepure, preparat pentru producerea de anticorpi.
 Fuziunea protoplaştilor a devenit în ultimele decenii o tehnică cu un potenţial deosebit
pentru biotehnologia plantelor superioare; totuşi, metodele clasice de fuziune, bazate pe
utilizarea agenţilor fusogeni chimici, rămân în mare parte nesatisfăcătoare.Aceste metode
supun protoplaştii unor condiţii necorespunzătoare din punct de vedere fiziologic( pH alcalin,
concentraţii crescute ale ionilor de Ca), care sunt toxice pentru produşii de fuziune.

Sincronizarea şi urmărirea desfăşurării întregului proces de fuziune sunt dificil de urmărit la

microscopul fotonic. Agenţii fusogeni de natură chimică interacţionează cu plasmalema într-o
manieră greu de controlat, afectând viabilitatea celulelor; randamentul procesului de fuziune
este scăzut, aproximativ 50 %.
• Senta şi colab. (1979), precum şi Zimmermann şi colab. (1981) au elaborat şi dezvoltat o nouă
tehnică de fuziune: electrofuziunea, care elimină multe din neajunsurile metodelor chimice.
Această metodă utilizează ca agent inductor câmpul electric şi constă din aducerea
protoplaştilor în contact intim, prin amplasarea acestora într-un câmp electric alternativ şi
administrarea unor pulsuri de curent direct, având amplitudine ridicată şi durată scurtă de
acţiune
• Tehnica electrofuziunii a fost aplicată celor mai diverse tipuri de celule: de la bacterii la
celulele umane, făcând posibilă fuziunea unor celule aparţinând unor genuri sau chiar regnuri
diferite.În comparaţie cu metodele chimice de fuziune, electrofuziunea presupune o aparatură
relativ simplă şi ieftină, întregul proces poate fi urmărit şi înregistrat prin filmare şi
fotografiere, la microscopul fotonic, fiind posibilă prestabilirea parametrilor optimi de
electrofuziune, precum şi a densităţii optime a suspensiei de protoplaşti pentru favorizarea
fuziunilor binare, terţiare sau multiple. Randamentul procesului de fuziune este cuprins între
60-80 %, uneori chiar 100 %.
Electrofuziunea a fost aplicată la un număr mare de specii: Avena sativa, Triticum aestivum,
Zea mays, Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum.

În experimentele efectuate, viabilitatea produşilor de fuziune s-a reflectat în capacitatea de

regenerare a heterocarionilor, iniţial la planta test Nicotiana tabacum, ulterior şi la alte specii
de cultură de importanţă economică: Zea mays x Glycine max, Pisum sativum x Glycine max,
Hordeum vulgare x Daucus carota.
 Metode de selecţie a hibrizilor somatici
• Selecţia hibrizilor somatici poate avea loc în diferite faze:
• imediat după fuziune, înaintea apariţiei diviziunii;
• după diviziunea homo- sau heterocarionului;
• după apariţia calusului;
• după regenerarea hibrizilor somatici.

În fiecare din aceste faze pot fi aplicate metode diferite, funcţie de produşii de fuziune. În
prima fază, cea de homo- sau de heterocarion sunt efectuate analize electronomicroscopice
pentru evidenţierea cloroplastelor sau a diferitelor tipuri de heterocromatină.
Prezenţa sau absenţa unor organite citoplasmatice favorizează recunoaşterea trăsăturilor
parentale
 În faza următoare, în cazul în care homo-sau heterocarionul a devenit sincarion, placa
metafazică în timpul mitozei va cuprinde cromosomii speciilor parentale, de aceea în această
fază se poate efectua cariotipul celulelor hibride.

După apariţia calusului se aplică atât metode de identificare a celulelor hibride, cât şi de
selecţie, prin utilizarea unor markeri biochimici: mutante rezistente la medicamente, erbicide
sau mutante nutriţionale auxotrofe pentru aminoacizi,

Selecţia şi regenerarea hibridului Nicotiana glauca x Nicotiana langsdorffii (Carlson, 1972) a

fost posibilă prin cultivarea celulelor hibride pe un mediu lipsit de fitohormoni.

Protoplaştii fiecăruia dintre părinţi nu pot creşte pe un mediu fără regulatori de creştere, de
aceea s-au selectat numai celulele fuzionate, care se pot dispensa de substanţele de creştere
respective.
• În 1987, Davey şi Power au obţinut primii hibrizi gametosomatici intergenerici: Nicopetunia
prin electrofuziunea protoplaştilor izolaţi din tetradele polinice de Nicotiana tabacum cu
protoplaştii de Petunia inflata. Incapacitatea de regenerare a protoplaştilor izolaţi din
tetradele polinice a fost folosită ca metodă de selecţie pentru separarea hibrizilor.

• Un alt criteriu în selecţia hibrizilor are la bază faptul că anumiţi agenţi patogeni sau toxinele
lor provoacă o gamă largă de receptivitate la nivelul diferitelor plante. Toxinele produse de
Helmintosporium maydis distrug protoplaştii liniilor sensibile de Zea mays, în timp ce alte linii
sunt rezistente. Folosind linii rezistente la toxine se pot regenera plante imune la respectivul
patogen.