20.03.

2020

Izolarea moleculelor de ARN

În anumite tipuri de experimente în care izolarea genelor direct din moleculele de ADN
nu este posibilă, pentru fragmentele de interes este necesară utilizarea moleculelor de ARN care
sunt apoi convertite, prin reverstranscriere, la molecule de ADN corespunzătoare. Izolarea
moleculelor de ARN este relativ complicată de faătul că RN-aza endogenă este caăabilă să
degradeze cea mai mare parte a ARN celular. Inactivarea acestei enzime termostabile și
rezistente la acțiunea EDTA sau a detergenților este realizată prin folosirea unui inhibitor
specific: dietilpirocarbonat.
De regulă, metodele de izolare a le ARN permit obținerea de ARN total. Pentru
purificarea unui anumit tip de ARN se folosesc metode specifice ce țin cont de anumite
particularități alemoleculelor de interes. Spre exemplu, pentru obținerea ARNm se ține cont de
faptul că acest tip de ARN, izolat din celulele eucariote, prezintă la capătul 3’ o coadă
monocatenară poliA. Pornind de la această caracteristică, pentru purificarea ARNm se utilizează
metoda cromatografiei de afinitate pe o coloană cromatografică ce conține o umplutură specifică
la care sunt legate resturi de poliT sau poliU. Secvențele poliT sau poliU interacționează specific,
pe bază de complementaritate, cu coada poliA a ARNm, legând moleculele respective. Eluarea
moleculelor de interes se realizează cu ajutorul unor soluții tampon specifice, ia apoi ARNm este
concentrat prin precipitare cu etanol si recuperat prin centrifugare.
Tehnicile care urmăresc manipularea directă a ARN prin clonare moleculară se
desfășoarăîn etape succesive, una dintre acestea fiind obținerea genelor de interes. Aceasta se
poate realiza fie prin izolarea genelor naturale, fie prin sinteză chimică a unor molecule de ADN
ce codifică proteinele dorite. În prezent, prin aceste tehnici se poate realiza prelucrarea și
transferul unor secvențe relativ mici, de dimensiuni cuprinse între 1000-20000 pb.
Reușita experimentelor în urma intervențiilor prin diverse procedee este condiționată de
prezența integrală a genei dorite și a unei cantități cât mai mici de ADN contaminant, inutil
pentru buna funcționare a genei de interes. Obținerea fragmentelor de ADN ce servesc pentru
clonare se poate realiza pe mai multe căi: sinteză chimică a genei, sinteza enzimatică AND dublu
catenar complementar, izolarea genelor de AND natural cu ajutorul enzimelor de restricție,
izolarea și amplificarea genelor prin tehnologie PCR. Metodele prezentate mai sus presupun
utilizarea unei game variate de enzime: enzimele de restricție, metilazele, ligaza, nucleaze.