OBTINEREA ADN DE

INTERES PRIN UTILIZAREA

POLIMERAZELOR
Alături de enzimele de restricţie,în tehnologia ADN recombinant sunt
utilizate şi alte tipuri de enzime, fie pentru obţinerea ADN de interes fie
pentru analiza acestuia. Dintre acestea sunt de menţionat ADN
polimerazele, diverse nucleaze, fosfataza alcalină, polinucleotid kinaza etc.
ADN polimerazele sunt enzimele necesare pentru
sinteza ADN în timpul replicării cromosomale sau a
procesului reparator. ADN polimerazele catalizează
formarea de legături fosfodiesterice între nucleotidele
de la capătul 3’OH al catenelor de ADN şi grupul α
fosfat de la nivelul dNTP libere, cu liberarea unei
molecule de pirofosfat:

Caracteristic acestor enzime este faptul că, pentru a

acţiona, ele au nevoie de o secvenţă de tip primer care
să prezinte capătul 3’OH liber, alungirea catenei de
ADN realizându-se în direcţia 5’  3’ prin utilizarea
unei alte catene de ADN drept matriţă. In absenţa
primerului, sinteza de ADN nu este posibilă.
Reprezentarea schematică a procesului de replicare
Unele ADN polimeraze, asa cum este ADN polimeraza I
produsă de E.coli manifestă nu numai activitate
polimerazică ci şi exonucleazică în sensul 5’3’ şi/sau
3’5’ (eliminarea pe rând a nucleotidelor fie de la
capătul 3’ fie 5’).
Activitatea exonucleazică în sensul 3’  5’ este asociată,
in vivo, cu rolul reparator al polimerazei respective:
recunoaşterea şi apoi eliminarea nucleotidei incorect
adăugată (necomplementară). Deseori însă, datorită
activităţii exonucleazice 5'3' a ADN polimerazei I, apar
probleme ce ţin de degradarea capătului 5' al primerilor
şi eliminarea grupărilor 5' fosfat de la capetele
fragmentelor de ADN utilizate ca substrat pentru ligare.
Activitatea exonucleazică 5'3' poate fi eliminată prin
tratament proteolitic, obţinându-se un fragment de
dimensiuni mari, numit fragment Klenow, capabil de
activitate ADN polimerazică şi exonucleazică 3' 5'.
 Tehnologia PCR (“Polymerase
Chain Reaction”)
Elaborarea şi apoi perfecţionarea
tehnologiei PCR a determinat găsirea unor
noi ADN polimeraze cu acţiune mai eficientă
şi, eventual termorezistente. Tehnologia PCR
a fost elaborată în anul 1983 de către un
cercetător american, Kary Mullis care, la
momentul descoperirii lucra în cadrul
companiei biotehnologice Cetus Corporation
din California. Această companie a vândut
apoi tehnologia unei alte companii, Roche
Molecular Systems, pentru suma de 300
milioane dolari.
Pentru descoperirea sa, care a revoluţionat
domeniul biologie moleculare, Karry Mullis a
primit în anul 1993 premiul Nobel pentru
Chimie.
Tehnica PCR utilizează unele trăsături fundamentale ale replicării
ADN: ADN-polimeraza foloseşte ca matriţă ADN monocatenar
pentru a determina sinteza unei catene noi, complementare. Metoda
permite amplificarea "in vitro" a unei secvenţe de ADN, cu o mărime
de aproximativ 10kb, de până la 106 ori; ea poate fi aplicată şi
pentru amplificarea ARN dar, pentru aceasta, mai întâi, se
sintetizează o moleculă de ADNc şi apoi aceasta este multiplicată
(RT-PCR).
In principiu, tehnologia PCR presupune utilizarea unui amestec de
ADN matriță, enzime de polimerizare, amorse pentru declanșarea
polimerizării și nucleotide ce este supus, succesiv, unor variații de
temperatură (30-94oC) utile pentru denaturarea ADN matriță,
alinierea amorselor (primerilor) și realizarea polimerizării propriu-
zise. Pe parcursul acestor etape este necesar ca ADN polimeraza
utilizată să reziste la variațiile de temperatură.
Pentru a se realiza reacţia de amplificare este nevoie de o
serie de componente:
– ADN matriţă care conţine regiunea ce se doreşte a fi
multiplicată. Matriţa de ADN monocatenar este obţinută prin
încălzirea unei soluţii de ADN dublu catenar la o temperatură
apropiată celei de fierbere şi apoi răcire bruscă, astfel încât cele
două catene complementare rămân despărţite (denaturate).
– 1-2 primeri care să fie complementari cu regiunea 5’-3’ a regiunii
de ADN ce va fi amplificată;
– ADN-polimeraza care realizează sinteza noilor molecule de ADN
de interes;
– Cele patru tipuri de deoxiribonucleozid-trifosfaţi (dNTP);
– Ioni bivalenţi de Mg sau Mn. Se preferă în general ionii Mg2+ dar,
pentru anumite tipuri de reacţii PCR (de exemplu pentru
mutageneza mediată de PCR) sunt preferaţi ionii de Mn2+
deoarece, la concentraţii ridicate, ionii de Mn2+ măresc rata de
apariţie a erorilor pe parcursul sintezei ADN de interes;
– Ioni de potasiu care ajută procesul de aliniere a primerilor la
matriţa ADN;
– O soluţie tampon care asigură condiţiile optime de realizare a
activităţii enzimatice a ADN polimerazei.
Primerii folosiţi în tehnologia PCR sunt secvenţe
de 10-30 nucleotide care prezintă, în general un
conţinut de aproximativ 50% G+C, astfel că
temperatura de topire (Tm) este de 55-65oC.
In majoritatea situaţiilor se utilizează o pereche de
primeri diferiţi, complementari cu extremităţile
regiunii ce va fi amplificată, ei servind drept
amorsă pentru iniţierea procesului de
polimerizare şi extensia noii catene de ADN sub
acţiunea ADN-polimerazei.
Primerii, în reacția PCR, sunt fragmente ADN
sintetizate in vitro, spre deosebire de primerii din
procesul de replicare, care sunt mici molecule
de ARN.
Matriţa de ADN monocatenar este obţinută prin încălzirea
unei soluţii de ADN dublu catenar la o temperatură
apropiată celei de fierbere şi apoi răcire bruscă, astfel
încât cele două catene complementare rămân despărţite
(denaturate). La acest ADN denaturat se adaugă un
primer specific, necesar pentru iniţierea reacţiei de
polimerizare catalizată de ADN-polimerază, precum şi
nucleotide.
În tehnica de multiplicare "in vitro", ambele catene ale unui
fragment de ADN pot servi ca matriţă pentru sinteza
catenelor complementare, cu condiţia adăugării unor
primeri oligonucleotidici pentru fiecare dintre cele două
catene.
După un ciclu de replicare, amestecul este încălzit
pentru a se desface catenele nou sintetizate de
cele vechi şi ciclul este reluat. În acest fel, numărul
de molecule de ADN nou sintetizate creşte în
progresie geometrică după fiecare ciclu de
replicare, estimându-se că, spre exemplu, după 32
cicluri de replicare se pot obţine 1.073.741.824
molecule de ADN dublu catenar, pornind de la o
unică moleculă iniţială.
(https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo).
(http://www.nature.com/scitable/topicpage/scientists-can-
make-copies-of-a-gene-6525968)
O etapă critică a acestei tehnici este alegerea
primerilor specifici, dar utilizarea lor nu
mai face necesară izolarea prin alte metode
a secvenţei dorite de ADN dintr-o populaţie
heterogenă de molecule de ADN.
Cantitatea de ADN necesară ca material de
start a reacţiei este foarte mică, sub 1 μg de
ADN genomic total, dar se poate amplifica o
secvenţă de ADN pornind chiar de la o
singură moleculă.
Integritatea ADN matriţă constituie un factor mult mai
important decât cantitatea, deoarece în cazul unui ADN
puternic degradat este puţin probabil ca secvenţa de
interes să fie intactă. De asemenea, s-a dovedit că ADN
linear poate fi amplificat mai eficient decât ADN
plasmidial circular, astfel că în cazul vectorilor de clonare
este necesară mai întâi clivarea lor cu o enzimă de
restricţie şi apoi utilizarea în reacţia PCR.
Pentru realizarea amplificării se poate porni de la aproape
orice tip de material biologic, proaspăt sau chiar
conservat timp de mai mulţi ani (de exemplu, ADN
provenind de la ţesuturi incluse în parafină, pete de
sânge uscat, ţesuturi uscate, mumificate sau îngheţate
etc).
 Etapele reacției PCR
1. Prima etapă a procesului de amplificare
presupune încălzirea soluţiei de ADN la 94-
95oC, timp de 5 minute, pentru a rupe legăturile
de hidrogen, în aşa fel încât ambele catene
complementare separate să poată servi ca
matriţe pentru ADN-polimerază.
2. A doua etapă presupune scăderea temperaturii la 30-
65oC și adăugarea primerilor oligonucleotidici (ce vor fi
folosiţi drept amorsă pentru ADN-polimerază), a ADN
polimerazei şi a amestecului celor patru
deoxiribonucleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
Primerii se vor alinia la secvențele complementare din
ADN matriță.
Etapa a treia presupune începerea procesului de
polimerizare (extensia) după ce temperatura a fost
crescută la 72-75˚C.
La sfârșitul primului ciclu de sinteză se formează 2 molecule
de ADNdc identice ce conțin secvența de interes.
In final are loc creșterea din nou a
temperaturii la 94oC pentru 20 secunde,
astfel încât noile molecule formate să
sufere un proces de denaturare, catenele
să se separe și să reînceapă ciclul de
amplificare. Procesul se reia pentru 30-60
cicluri de sinteză.
Produșii de amplificare sunt
evidențiați prin electroforeză în gel de
agaroză, migrarea realizându-se de
la (-) la (+), iar vizualizarea benzilor
de ADN se face în lumină UV, după
colorare cu bromură de etidiu.
 ADN polimeraze termostabile

În fazele de început ale elaborării tehnicii PCR era necesar să se

adauge, după fiecare ciclu de sinteză, cantităţi noi de ADN
polimerază, deoarece polimeraza de la E.coli, fiind
termosensibilă, era denaturată în momentul creşterii
temperaturii.
In prezent, pentru realizarea reacției de amplificare se utilizează
ADN polimeraze rezistente la variațiile de temperatură, astfel
că nu mai este necesară adăugarea de noi cantități de
enzime pe parcursul derulării ciclurilor de amplificare.
Prima ADN polimerază termostabilă, denumită Taq polimeraza,
a fost izolată de la bacteria Thermus aquaticus, bacterie ce
trăiește în izvoare termale.
Taq polimeraza are o activitate optimă la 75-80°C, cu o reducere
de 50% a activității după incubare 9 minute la 97,5°C, ea
realizând asamblarea a 1000 pb în mai puțin de 10 secunde
la 72°C.
Izvoare termale fierbinți din parcul național Yellowstone –
surse pentru izolarea bacteriilor termofile și hipertermofile
producătoare de enzime termostabile
Dezavantajele Taq polimerazei:
– Nu prezintă suficientă fidelitate în realizarea polimerizării
– Are o rată de producere a greșelilor de incorporare estimată la
aprox. 1 la 9.000 nucleotide. De ex. la o secvență de 400pb,
pe parcursul a 20 cicluri, la 33% dintre moleculele amplificate
poate apărea o greșeală de împerechere.
– nu are activitate exonucleazică 3’ - 5’ astfel că nu poate
corecta erorile de incorporare.
Depășirea problemei s-a realizat prin identificarea și
utilizarea altor polimeraze termostabile așa cum este
Pfu polimeraza. Pfu polimeraza a fost izolată de la o
altă bacterie termofilă, Pyrococcus furiosus, ea
manifestând activitate exonucleazică 3’5’, ceea ce îi
măreşte fidelitatea. Utilizarea unei asemenea enzime
pentru sinteza ADN asigură o fidelitate de 12 ori mai
mare decât cea obţinută prin folosirea Taq polimerazei.
In ultimii ani au fost obţinute ADN polimeraze înalt
termostabile prin modificarea controlată a genelor ce
codifică asemenea enzime la bacterii termofile cum sunt
Thermus thermophilus, Thermotoga maritima sau
Thermococcus litoralis.
Exemplu:
ADN polimeraza recombinată notată Tth, obţinută prin
clonarea în E.coli a unei gene ce codifică una dintre
ADN polimerazele de la T.thermophilus, s-a dovedit
extrem de eficientă în sinteza ADN în anumite condiţii:
adăugarea ionilor de Mg şi chelarea cationilor de Mn.
Dacă însă ionii de mangan sunt prezenţi, la temperaturi
de aproximativ 70oC, enzima recombinată Tth manifestă
activitate de reverstranscriere, ceea ce permite utilizarea
sa în experimentele de amplificare a ADN pornind de la
molecule matriţă de ARN.
Sursele de ADN ce pot fi multiplicate prin PCR sunt foarte
variate. In primul rând, poate fi utilizat ADNc obţinut prin
reverstranscrierea ARNm introdus într-un vector de
clonare, metoda numindu-se în acest caz revers-PCR
(RT-PCR).
Condiţia ca reacţia de polimerizare să se desfăşoare este
existenţa primerilor oligonucleotidici complementari
pentru anumite secvenţe din vector (de obicei,
secvenţele ce flanchează situsurile de clonare). În
această situaţie se pot studia mai multe tipuri de
fragmente de ADN clonate într-un anumit vector la
nivelul situsului corespunzător (cu secvenţa cunoscută).
Metoda poate fi aplicată şi pentru identificarea secvenţelor
de ADN ai căror primeri nu sunt stabiliţi: selecţia
fragmentelor obţinute prin clonare şi apoi amplificare se
face cu ajutorul unor metode variate (de exemplu,
Southern blotting). Ulterior, acest ADN poate servi
pentru subclonare în diverse gazde sau se poate realiza
secvenţierea sa.
 APLICATIILE TEHNOLOGIEI PCR

Aplicaţiile tehnologiei PCR sunt foarte diverse, pornind de

la cele ce vizează identificare, caracterizarea sau
modificarea controlată a unor gene utilizând ca matriţă
fie direct molecule de ADN purificate din diverse surse,
fie molecule de ADNc provenite din transcrierea inversă
a ARNm de interes.
Aplicaţiile s-au extins şi în practică, în special în domeniul
biomedical, pentru diagnosticarea unor boli
infecțioase prin detectarea agenților patogeni care le
produc, fără a mai fi necesară cultivarea lor in vitro (de
ex. Mycobacterium tuberculosis ce determină
tuberculoza, virusul HIV, virusul hepatitei B etc).
Alte utilizări:
- diagnosticul genetic al unor boli ereditare, așa cum sunt fibroza
chistică, distrofia musculară, hemofilia A sau B, anemia falciformă
etc
- diagnosticul anumitor forme de cancer (prin identificarea genelor
mutante responsabile de apariţia bolii (ca în cazul retinoblastomei –
formă de cancer la ochi, sau al cancerului de sân sau ovarian – se
detectează forma mutantă a genelor BRCA1 sau BRCA2);
- identificarea de precizie a grupelor sanguine
- diagnosticarea prenatală a unor eventuale deficienţe. Astfel, prin
intermediul tehnologie PCR se poate stabili existenţa unor boli
ereditare la nou-născuţi, de exemplu a fenilcetonuriei
- determinarea eficienţei tratamentului unor tipuri de cancer cu
citostatice sau radiaţii, testul PCR permiţând să se stabilească dacă
celulele maligne au fost sau nu distruse (prin detectarea sau nu a
genelor mutante responsabile de malignizare).
Tot cu ajutorul tehnicii PCR se pot amplifica secvenţe
specifice din genom, cum este cazul secvenţelor
repetitive Alu din genomul uman (regiuni ce conţin
aproximativ 106 copii ale unei secvenţe de 300 pb,
dispersate în întreg genomul uman), secvenţe ce pot
servi pentru aşa numita „amprentare genetică”.
O altă utilizare este legată de determinarea sexului fătului
înainte de naştere, prin utilizarea unor celule fetale. În
acest caz se folosesc primeri pentru anumite secvenţe
de ADN conţinute doar de cromosomul Y. Asemenea
analize se fac în special la familii cu risc mare de a avea
urmaşi cu boli genetice X linkate (boli grave ce se
manifestă în principal la băieți).
Tehnica PCR este utilizată şi pentru studii moleculare asupra înrudirii
filogenetice a unor specii. Prin acurateţe şi sensibilitate, metoda a putut
fi folosită chiar şi pentru multiplicarea unor probe de ADN aparţinând
unor organisme care au dispărut, pornind de la resturi fosilizate ale
acestora.
Tehnica PCR poate fi utilizată pentru identificarea rapidă a contaminării unor
produse alimentare sau a unor materii prime cu anumite microorganisme
patogene (de ex. E. coli O157:H7). In acest caz se utilizează tulpini de referință,
de colecție, patogene și nepatogene drept markeri precum și primeri specifici
pentru acestea.
Tehnici de analiză moleculară bazate pe PCR

In ultimii ani, tehnica PCR a servit ca punct de start pentru

dezvoltarea unor tehnici speciale de caracterizare a
fragmentelor de ADN:
– Tehnica RAPD („randomic amplified polymorphic DNA” =
„amplificare randomizată a ADN polimorf”),
– AFLP („amplified fragment length polymorphisms” =
polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate”),
– Evidențierea microsateliţilor (secvenţe de TG sau CA
repetate de 10-60 ori)
– Nested PCR etc.
Tehnica RAPD a fost descrisă pentru prima dată în anul 1990 de către Welsh şi
McClelland, ea presupunând utilizarea unor primeri arbitrari (cu lungimea de 10
nucleotide) pentru amplificarea unor fragmente de ADN faţă de care manifestă
complementaritate, chiar dacă nu perfectă.

Schema tehnicii RAPD pentru analiza variantelor A şi B

Markerii RAPD pot fi utilizati în determinarea distanţei
genetice dintre indivizii înrudiţi. În timp ce nici un sistem
de markeri nu poate fi considerat ideal pentru toate
aplicaţiile, metoda RAPD constituie un instrument
valoros în analizele biologiei moleculare, mai ales pentru
cartarea şi amprentarea genetică.
Tehnica RAPD prezintă următoarele avantaje în
comparaţie cu alţi markeri ADN:
– detecţia neradioactivă;
– nu necesită informaţii despre secvenţa de nucleotide din genom;
– sunt utilizaţi ca markeri universali pentru orice genom;
– utilizează o cantitate mică de ADN genomic;
– detectarea multiplă a polimorfismului molecular;
– simplitate experimentală;
– nu necesită echipamente scumpe.
Nested PCR este o tehnică ce măreşte specificitatea
amplificării prin reducerea riscului de apariţie a unor
produşi deamplificare nedoriţi, ca urmare a amplificării
nespecifice. Reacția necesită două seturi de primeri pe
parcursul a două reacții de amplificare succesive. In
prima reacție, o pereche de primeri este folosită pentru a
genera produși de amplificare care, pe lângă fragmentul
de interes pot prezenta și fragmente nedorite.
Produșii de amplificare rezultați în urma primei reacții sunt
utilizați pentru o a doua reacție de amplificare împreună
cu o nouă pereche de primeri a căror situsuri de legare
sunt total sau doar parțial diferite de cele pentru primii
primeri. Reacția de tip „nested PCR” este mult mai utilă
pentru obținerea de produși de amplificare lungi
comparativ cu reacția PCR convențională dar necesită o
cunoaștere mai detaliată a secvențelor țintă.
Microsateliţii (SSR- Simple Sequence Repeats = secvenţe simple repetate)
reprezintă o clasă de elemente ADN repetitive. Aceste secvenţe scurte formate
din 2 – 6 nucleotide repetate în tandem, compunându-se din 5-50 copii, ca
(AT)29, (CAC)16 sau (GACA)32. Microsateliţii sunt abundenţi în plante, fiind
întâlniți, în medie, la fiecare 6-7 kb. Aceste module repetate sunt flancate de
secvenţe nucleotidice conservate, pe baza cărora se vor sintetiza primerii
(„forward” şi „reverse”) ce vor fi utilizaţi în reacţia PCR de amplificarea a ADN.
Variabilitatea alelică este rezultatul numărului diferit de copii ale repetiţiilor în
tandem. Această variaţie este uşor de detectat ca diferenţă în polimorfismul
produşilor PCR. Tehnicile care utilizează microsateliţii în diferite analize ale
genomului la plante sunt:
– SSR (simple sequence repeat)
– STM (sequence tagged microsatelitte site).
Tehnica AFLP (amplified fragment length polymorphism =
polimorfismul lungimii fragmentelor amplificate) se bazează
pe amplificarea selectivă a unor fragmente de restricţie
provenite prin clivarea ADN genomic cu o anumită enzimă
de restricţie.
Într-o primă fază a analizei AFLP, ADN genomic este clivat cu
enzime de restricţie apoi, la fragmentele de digestie cu
capetele coezive (complementare monocatenare) se leagă
adaptori specifici formaţi din oligonucleotide cunoscute (câte
16 baze de o parte şi de alta a fragmentelor). Această primă
fază evidenţiază polimorfismul situsului de restricţie.
În a doua fază, fragmentele sunt amplificate prin PCR utilizând
ca primeri o secvență nucleotidică ce corespunde secvenţei
adaptorului, prelungită în direcţia 3’ (spre interiorul
fragmentului de amplificat) cu trei baze alese în mod arbitrar.
După electroforeza în gel de poliacrilamidă sunt evidenţiate
mai multe zeci de fragmente al căror polimorfism provine de
la situsurile de restricţie şi de la bazele arbitrare.
Reacția Q-PCR („quantitative-PCR”) este folosită pentru a măsura
cantitatea de produs/produși de amplificare, de preferință în timp
real (qRT-PCR = „quantitative real time PCR”), pornind de la
anumite cantități de ADN, ADNc sau ARN. După o fază inițială când
amplificarea nu este detectabilă, reacția PCR se realizează
exponențial, produșii de amplificare dublându-se la fiecare rundă de
multiplicare. dacă numărul de molecule țintă este mare în proba
inițială (de start) atunci pentru atingerea fazei exponențiale sunt
necesare mai puține runde de amplificare decât în cazul în care se
pornește de la un număr mic de molecule țintă.
Compararea numărului de cicluri necesare pentru a atinge faza
exponențială permite determinarea concentrației matriței (țintei) din
proba inițială. In analizele realizate în timp real, cantitatea de produs
sintetizat în cursul reacției PCR este estimată direct prin măsurarea
fluorescenței dezvoltate pe parcursul desfășurării acestei reacții. In
prezent sunt disponibile mai multe tipuri de sonde (probe) de
hibridizare care emit lumină fluorescentă corespunzător cu
cantitatea de ADN sintetizat. De asemenea, cantitatea de produs
sintetizat mai poate fi estimată cu ajutorul unor coloranți fluorescenți,
cum ar fi SYBR Green I, care se intercalează la nivelul ADN dublu
catenar, sau a probelor de ADN ce conțin fluorofori, așa cum este
TaqMan. In acest caz nu se poate face deosebirea între ampliconii
specifici și produșii nespecifici, astfel că este necesară folosirea
unor sonde moleculare caracteristice.
Real Time PCR
Real-time PCR este o metodă destul de utilizată pentru
analiza cantitativă a ADN. În acest tip de sistem PCR,
reacţia este cuplată cu un semnal de emisie
fluorescentă, fiind proporţional cu cantitatea de produs
PCR rezultat. Acest semnal creşte proporţional cu
cantitatea de produs PCR generat în fiecare ciclu
succesiv de reacţie. În acest mod se poate monitoriza
reacţia PCR în timpul fazei exponenţiale.
Realizarea unei analize de tip real-time PCR trebuie să
includă următoarele componente:
– un sistem PCR pentru determinarea secvenţelor specifice ale
ADN ţintă modificat;
– un sistem PCR pentru determinarea secvenţei de referinţă
endogene, care poate fi specifică speciei dar şi aptă pentru a fi
utilizată marker în calcularea concentraţiei relative de organisme
modificate genetic;
– curbe standard atât pentru probele ţintă cât şi pentru probele de
referinţă;
– probă de control negativ.
In analizele realizate în timp real, cantitatea de produs sintetizat în cursul
reacţiei PCR este estimată direct prin măsurarea fluorescenţei
dezvoltate pe parcursul desfăşurării acestei reacţii. In prezent sunt
disponibile mai multe tipuri de sonde (probe) de hibridizare care emit
lumină fluorescentă corespunzător cu cantitatea de ADN sintetizat.
Cantitatea de produs sintetizat mai poate fi estimată cu ajutorul unor
coloranţi fluorescenţi, cum ar fi SYBR Green I care se intercalează la
nivelul ADN dublu catenar, fiind eliberat în momentul în care se
realizează amplificarea devenind cuantificabil, sau a probelor de ADN ce
conţin fluorofori, aşa cum este TaqMan.
In cazul sondei TaqMan se utilizează două tipuri de fluorofori (porțiunile
fluorescente ale unor proteine de referință, de ex. GFP): fluoroforul Q
(„quencher”)(de obicei un colorant cu o lungime de undă mare, de
ex.roșu), atașat la extremitatea 3’ a sondei și fluoroforul R („reporter”)
(de obicei un colorant cu o lungime de undă scurtă, de ex.verde), atașat
la extremitatea 5’ a sondei .
In cazul în care sonda moleculară este atașată la secvența țintă sau
când ea este în stare liberă, fluoroforul Q maschează („stinge”)
fluorescența emisă de fluoroforul R, aspect care poate fi detectat
și cuantificat. De îndată ce sonda TaqMan se leagă la nivelul
zonei complementare din ADN, primerul se atașează și el iar ADN
polimeraza începe reacția de polimerizare. Deoarece ADN
polimeraza utilizată în qRT-PCR are și activitate exonucleazică în
sensul 5’-3’, atunci când ajunge la nivelul sondei detașează
fluoroforul R care, devenind liber și scăpând de acțiunea
fluoroforului Q, poate fi cuantificat spectrofotometric.
 Aplicațiile qRT-PCR

• Cuantificarea exprimării unor gene (prin combinarea

tehnicii reverstranscription PCR cu qRT-PCR)
• Detectarea unor patogeni – de ex. virusuri
• Detectarea și cuatificarea unor gene țintă din materii
prime sau din probe naturale
• Cuantificarea unor virusuri
• Evaluarea eficienției unor medicamente
• Măsurarea gradului de degradare al ADN
• Controlul calității și validarea testelor
• Genotiparea
Reprezentarea schematică a procesului de transcriere şi traducere la eucariote, cu
evidenţierea structurii discontinue a genelor
 REVERSTRANSCRIEREA

• Obţinerea şi clonarea directă a ADN genomic de origine eucariotă

este tehnic mai dificilă şi, în consecinţă, s-a recurs la o tehnică
indirectă de sinteză a genei sub forma de ADN complementar,
pornind de la ARNm (conține doar secvențe informaționale).
Tehnica a fost denumită reverstranscriere şi se bazează pe
utilizarea unei enzime specifice, reverstranscriptază, de origine
virală.

• Reverstranscriptaza realizează sinteza de ADN pornind de la o

matriţă ARN (este o ADN polimeraza dependentă de ARN),
obţinându-se molecule de ADNc (complementar). Reacţia de
polimerizare depinde de existenţa celor patru deoxiribonucleotide
trifosforilate în concentraţie mare pentru a obţine un ADN
complementar cu lungime mare. Omiterea unui dNTP din amestecul
de reacţie duce la oprirea polimerizării.
Pentru obținerea ADNc, ARNm este izolat din ţesutul în care
gena dorită se exprimă la maximum. În anumite condiţii
fiziologice favorabile, un anumit tip de ARNm poate
reprezenta între 0,1 şi 10% din cantitatea de ARNm celular
total. În alte cazuri el este prezent în cantităţi foarte mici.
Izolarea ARNm şi identificarea tipului dorit presupune anumite
dificultăţi. În general, alegerea unui anumit tip de ARNm se
poate face prin determinarea capacităţii de a controla sinteza
unei proteine specifice în sisteme acelulare sau prin hibridare
cu oligonucleotide sintetice.

Deoarece la eucariote ARNm matur prezintă la capătul 3'OH o

extremitate lungă de până la 150 nucleotide (capăt
poliadenilat), pentru a se iniţia sinteza ADN complementar se
foloseşte un primer oligo dT, lung de aproximativ 10
nucleotide (resturi de timină), care va fi cuplat cu extremitatea
poliadenilată. Această secvenţă constituie de fapt primerul de
la care va începe polimerizarea nucleotidelor de către o ADN
polimerază dependentă de ARN, denumită
reverstranscriptază.
Toate variantele de clonare a ADN complementar dublu catenar
pornesc de la sinteza unei copii ADN pe matriţa de ARNm cu
ajutorul reverstrancriptazei.

Copia monocatenară de ADN este convertită la forma dublu

catenară cu ajutorul unei ADN-polimeraze "normale", după ce
mai întâi se îndepărtează ARNm matriţă prin tratament cu
RN-aza H (enzimă ce degradează în mod specific ARN din
duplexul ARN-ADN).

ADNc monocatenar obţinut prin reverstranscriere are la capătul

3' o buclă în "ac de păr", formată prin interacţiunea
intramoleculară a bazelor componente şi, pornind de la acest
capăt, se iniţiază sinteza catenei complementare (bucla
funcţionând ca "primer").

După încheierea sintezei catenei complementare (legată

covalent de catena matriţă) se elimină bucla monocatenară
prin folosirea unei nucleaze (nucleaza S1)
Etapele procesul de obţinerea ADN de interes prin reverstranscriere
In anumite situații este necesară nu
numai obținerea unei copii a genei de
interes prin reverstranscriere ci o
cantitate suficientă din acea genă pentru
a putea fi folosită în experimente variate.
In acest scop a fost optimizată o metodă
denumită RT-PCR care combină
reverstrancrierea cu tehnologia PCR.
Metoda permite si evaluarea gradului de
exprimare a unor gene de interes în
anumite tipuri de celule/țesuturi.
 TERMINAL-TRANSFERAZA

Un tip special de ADN polimerază este terminal transferaza (TT) care

adaugă mononucleotide la capătul 3’ OH liber al ADN monocatenar,
ADN dublu catenar sau chiar al ARN; acţiunea enzimatică de
polimerizare a nucleotidelor nu este dependentă de existenţa
unei matriţe ADN.
Terminal transferaza este folosită în practică pentru adăugarea de
extremităţi homopolimere, de obicei la nivelul unor fragmente de
ADN sau, în anumite situaţii, pentru adăugarea unei singure
nucleotide modificate de tipul dideoxinucleotidelor (in cazul
experimentelor de secvenţiere).
Activitatea enzimatică este condiţionată de prezenţa în amestecul de
reacţie a ionilor de Co2+ (preferaţi în cazul în care se doreşte
adăugarea purinelor) sau Mg2+ (preferaţi pentru adăugarea
pirimidinelor)
Terminal transferaza se utilizează pentru adăugarea
extremităților monocatenare atunci când se dorește
clonarea cu mai mare eficiență a fragmentelor de ADN cu
extremități drepte (pentru generarea de extremități
monocatenare complementare unor secvențe de la
nivelul vectorilor de clonare)
 Alte polimeraze
In anumite situații, pentru clonare
este necesară conversia
fragmentelor de restricție cu
extremități monocatenare în
fragmente cu extremități drepte.
Acest lucru se face cu ajutorul
ADN polimerazei Klenow (care
prezintă activitate polimerazică
3’ 5’ și exonucleazică 3’5’).
Dacă extremitatea monocatenară
este de tip 5‘ (ca în cazul EcoRI)
are loc acțiunea de umplere prin
activitatea polimerazică 3’ 5’.
Dacă extremitatea monocatenară
este de tip 3’ (ca în cazul PstI) are
loc acțiunea de eliminare a
acesteia prin activitate
exonucleazică 3’ 5’
Obţinerea ADN de interes prin sinteză chimică
Strategia adoptată pentru sinteza chimică a unor gene a
implicat realizarea a două etape fundamentale, şi
anume:
– sinteza chimică a unor segmente oligodeoxinucleotidice cu
lungimea medie de 8-12 unităţi;
– legarea „cap-coadă” a segmentelor respective, într-o ordine
identică celei din gena naturală, cu ajutorul ADN-ligazei;
Prima sinteză chimică a unei gene (ARNt pentru alanină),
efectuată de Khorana şi colab. (1970), a fost considerată
ca marcând debutul ingineriei genelor ca domeniu de
activitate. Sinteza s-a făcut sub forma unor mici
fragmente oligonucleotidice, pornind de la fosfodiesteri.
Dacă în cazul sintezei enzimatice a ADN direcția de sinteză
este 5'  3‘, în cazul sintezei chimice adăugarea de noi
nucleotide se face în direcție opusă (3‘ 5‘) și nu
necesită existența unui primer sau a unei matrițe.
Itakura şi colab. (1970) au realizat o altă metodă, mai rapidă, pentru sinteza de
ADN. Aceasta presupune parcurgerea mai multor etape:
– sinteza unor trimeri cu secvenţa bazelor prestabilită;
– cuplarea trimerilor între ei pentru obţinerea de oligonucleotide cu secvenţa bazelor dorită;
– legarea oligonucleotidelor între ele cu ajutorul ADN-ligazei, pentru a obţine genele de interes.

În prezent există adevărate "maşini de fabricat gene" care, asistate de un

microprocesor, sunt capabile să sintetizeze ADN monocatenar pe baza unei
secvenţe date (introdusă în computer), cu o lungime de aprox.60-80
nucleotide. Sinteza chimică a ADN are o serie de avantaje:
– permite producerea de gene funcţionale, chiar dacă nu se cunoaşte secvenţa bazelor din
ADN natural. Sinteza se realizează pe baza secvenţei de aminoacizi din proteina dorită, care
este mai uşor de determinat. Deoarece prezenţa intronilor blochează exprimarea unei gene
de tip eucariot în E.coli, sinteza chimică, ca de altfel şi ADNc sintetizat pe baza ARNm
matur, furnizează o versiune scurtată a genei respective (ce conţine doar secvenţe exonice),
funcţională în E.coli;
– deoarece bacteriile şi celulele animale tind să utilizeze anumiţi codoni în mod preferenţial
pentru un anumit aminoacid, în sinteza chimică pot fi utilizaţi codonii cei mai potriviţi pentru
gazda în care se doreşte exprimarea genei;
– în cursul sintezei chimice pot fi introduse substituiri de aminoacizi care modifică avantajos
proprietăţile biologice ale proteinelor codificate de gena sintetică.

Principalul dezavantaj ține de faptul că lungimea fragmentului de ADN sintetizat

este în general mic, la lungimi mai mari rata de eroare crescând
semnificativ (o eroare la aprox.300 nucleotide).
Cea mai cunoscută aplicație a metodei sintezei chimice este obținerea
primerilor necesari în tehnologia PCR și a metodelor derivate de la aceasta.
 Alte enzime utilizate în tehnologia ADN
recombinant
ADN-ligazele – enzime esențiale în procesul de replicare, asigurând
restabilirea continuității moleculelor de ADN nou sintetizate
După descoperirea ligazelor din E.coli neinfectate cu bacteriofagi, activităţi
similare acestei ligaze au fost observate şi într-o mare varietate de ţesuturi
provenite de la organisme eucariote (în splina şi măduva osoasă de iepure, în
microsporocitele de crin că şi în celulele infectate cu virusul sarcomului Rous,
în mieloame murine etc.). Aceste date demonstrează existenţa ADN ligazelor la
toate organismele vii, ele fiind esenţiale pentru replicarea materialului genetic şi
pentru menţinerea integrităţii sale.
Pentru a se putea realiza legarea fragmentelor de ADN, este necesar că în
amestecul de reacţie să existe o serie de elemente:
– cofactorii specifici ai ligazei (NAD pentru ligaza de E.coli şi ATP
pentru ligaza de fag T4)
– ioni de magneziu, în concentraţie optimă de 10mM
– ditiotreitol; în absenţa sa activitatea enzimei se reduce la 25%.
Înlocuirea ditiotreitolului cu β-mercaptoetanol duce, de asemenea, la
scăderea cu 60% a activităţii enzimei.
In experimentele de inginerie
genetică este preferată ADN-
ligaza de fag T4, datorită
proprietăţilor sale. Ligaza de fag
T4 este capabilă de a lega atât
fragmentele de ADN cu
extremităţi coezive cât şi
fragmente cu extremităţi drepte.
 Fosfataza alcalină
• este o enzimă care catalizează îndepărtarea
grupării fosfat de la capătul 5' al ADN sau ARN,
ceea ce determină defosforilarea fragmentelor
respective. Enzima poate fi de origine
bacteriană sau poate fi izolată din intestin de
viţel
• fosfataza alcalină este utilizată pentru
îndepărtarea grupării fosfat de la capătul 5' al
ADN, în scopul prevenirii autocircularizării
plasmidelor sau „autolegarea” fragmentelor
obţinute prin acţiunea unor enzime de restricţie
care generează capete coezive (monocatenare
complementare)
Polinucleotid-kinaza de fag T4 este utilizată pentru
transferul unui grup fosfat de la ATP la capătul 5' al ADN
sau ARN, ea având o acţiune inversă fosfatazei alcaline.
Datorită acestei acţiuni, enzima poate fi utilizată pentru
marcarea radioactivă a capetelor 5' ale ADN în
experimentele de secvenţiere prin metoda Maxam şi
Gilbert sau pentru analiză cu nucleaza S1 şi pentru
fosforilarea linkerilor sintetici sau a altor fragmente de
ADN la care lipsesc grupările 5' fosfat necesare pentru
legare.
Nucleaza S1 este o enzimă izolată din Aspergillus oryzae,
care determină degradarea ADN sau ARN monocatenar
generând mono- sau oligonucleotide 5’ fosfat. De regulă,
ADN sau ARN dublu-catenar precum şi hibrizii ADN-
ARN prezintă rezistenţă la acţiunea acestei enzime. Cu
toate acestea, acizii nucleici dublu-catenari sunt digeraţi
complet în prezenţa unor cantităţi mari de nuclează S1.