De la ROCHE:

Amplificare acizi nucleici

Reactivi pentru genomica Marcare, mapare i clonare Microarrays

Datorit PCR (Polymerase Chain Reaction), cantitatea de acizi nucleici de studiat, orict de mic ar fi, nu mai reprezint o limitare n cercetare i nici n multe dintre procedeele de diagnostic. Roche Applied Science v ofer o bogat selecie de reactivi de calitate premium pentru amplificarea acizilor nucleici, de folosit n aplicaiile de tip PCR, din care urmeaz doar o selecie n continuare:

Detecia i analiz n timp real cu instrumentaie automat (de ex., LightCycler cu carusel, LightCycler 480 i COBAS TaqMan 48) Amplificarea clonal a ADN genomic n emulsie (emPCR) pentru secventarea ultra-rapida (de ex., GS FLX i GS Junior) Introducerea etichetelor moleculare (tags), cum sunt biotina i digoxigenina, n produii PCR pe durata amplificrii, astfel nct aceti produi s poat fi utilizai c sonde de hibridizare sensibile n testele medicale de diagnostic sau de cercetare Amplificarea simultan a mai multor secvene ntr-o singur reacie (PCR multiplex), pentru identificarea, de exemplu, a SNP n ADN genomic uman Studiul variabilitii genetice pentru descifrarea bazelor genetice ale bolilor Amplificarea ADN pentru testarea identitii (fingerprinting) Studiul mecanismelor epigenetice (cum sunt metilarea ADN, acetilarea histonelor, ARN de interferen) implicate n activarea i inactivarea genelor Crearea de ADN nou, prin mutageneza n vitro

Explorarea relaiilor evolutive, prin examinarea ADN fosil.

Reactivi pentru PCR i RT-PCR n 2 pai

Expand Reverse Transcriptase, trusa ideal pentru RT-PCR, pentru inte de pn la 13,5 kb.

First trand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV), o trus de sintez a ADNc i PCR n dou etape, ce conine toi reactivii necesari, incluznd 2 primeri (oligo-dT i random primer) i reaciile de control. Temperatura crescut de reacie a AMV, prin comparaie cu revers-transcriptaza M-MuLV, permite reacia la 42C, cu o mai mare specificitate i o rezoluie crescut a structurilor secundare, fa de reaciile la 37C. Reverse Transcriptase M-MuLV, enzima folosit la sintez n vitro a ADNc transcris dup secvene specifice ARN, prepararea librriilor ADNc, sau sinteza primei catene ADNc pentru RT-PCR. Reverse Transcriptase AMV, enzima potrivit pentru sinteza primei i celei de-a dou catene ADNc, precum i pentru sinteza dideoxi-ADN n vederea secventarii. Enzima mai poate fi folosit i la extensia primerilor, secventarea ARN, marcarea 3'-ADN, generarea sondelor monocatenare pentru hibridizare i experimentele de footprint genomic*. cDNA Synthesis System este un procedeu ntr-o singur etap, bazat pe metoda lui Gubler i Hoffmann, optimizat pentru sinteza ADNc dublu catenar pornind de la ARN total sau ARNm. ADNc dublu catenar poate fi folosit la construcia librriilor non-directionale, ca punct de pornire n hibridizarea substractiv**, precum i pentru transcrierea n vitro a populaiilor ADNc integrale pentru generarea ARNc marcat, n vederea hibridizrii pe microarrays. Hibridizarea substractiv de supresie a fost folosit cu succes la identificarea secventelor ADN specifice de tulpina sau de specie dintr-o varietate larg de bacterii. 5/3 RACE Kit, 2nd Generation amplifica secvenele ADN pornind de la o matri de ARNm, definit ntre un sit intern i secvene necunoscute de la capetele 3 sau 5. Trusa conine toate componentele necesare pentru RACE (rapid amplification of cDNA-ends), incluznd revers-transcriptaza, dNTP, tampoane, controale, primeri i High Pure PCR Product Purification Kit. Transcriptor Reverse Transcriptase este o revers-transcriptaza nou, recombinata n E. coli, ce include o ADN polimeraza dependenta de ARN, o ADN polimeraza dependenta de ADN, cu activitate RNaza H i relaxaza. Se accept c matrie ADN monocatenar i ARN monocatenar n prezena unui primer. Enzima transcrie ARN lung, fiind foarte sensibil i termostabila. Enzima mai este recomandat pentru inte bogate n GC i reacii de marcare n cursul sintezei ADNc. Transcriptor First trand cDNA Synthesis Kit este o trus ce ofer revers-transcrierea robust i sensibil a ARN din surse diverse, n combinaie cu thermal cyclers convenionale i instrumente de PCR n timp real. Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit combina activitatea proofreading oferit de trusa Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit, cu rezultatele mai precise i mai sensibile ale RT-PCR n 2 pai. Se elimin posibilitatea schimbului de baze sau modificarea cadrelor de lectur, mpiedicndu-se propagarea acestora n continuare prin PCR de ctre ADN polimeraze. Trusa conine toi reactivii pentru RT-PCR n 2 pai, incluznd 2 primeri (oligo(dT)-ancorati i random primer) precum i reacii de control. Transcriptor Universal cDNA Master este un amestec de reacie gata de utilizare pentru qRT-PCR n 2 pai, pentru toate sistemele de PCR n timp real. Protector RNase Inhibitor inactiveaz un spectru larg de RNaze (incluznd RNaza A, RNaza B, i RNaza T2). Aceasta enzim este termostabila, fiind complet activa pe durata sintezei ADNc. Protector RNase Inhibitor este activ la pH 5,0-9,0 i temperaturi ntre +25C/+55C.

Reactivi pentru RT-PCR ntr-un pas

Tth DNA Polymerase este o enzim recombinat ce prezint ambele activiti intrinseci transcriptaza i ADN polimeraza termostabila. Tth tolereaz temperaturi de 50C70C n reacia RT i de pn la 95C n PCR, rezolvnd astfel problemele structurii secundare a ARN. Tth se preteaz procedeului de eliminare a contaminrii prin incorporarea dUTP/tratament ulterior cu UNG (Uracil N-Glucozidaza).

Titan One Tube RT-PCR System i Titan One Tube RT-PCR Kit conin reactivi (plus controale, primeri de control, nucleotide, RNase inhibitor i apa PCR-grade) pentru analiza RT-PCR rapid, sensibil i de mare fidelitate a ARN. Se folosesc enzimele AMV Reverse Transcriptase i Expand High Fidelity PCR System. n funcie de primerii selectai, se

vor amplifica mesageri specifici, sau ntreaga populaie de transcrii. Aceast metod permite i clonarea mesagerilor rari, fr necesitatea construirii librriilor ADNc.

Transcriptor One-Step RT-PCR Kit asigura analiza rapid, sensibil i specific, endpoint de tip RT-PCR, a ARN (total, mesager, transcris n vitro sau viral), folosind primeri genici specifici. Trusa conine un tampon de inovaie, combinnd totodat revers-transcrierea sensibil i productiv cu un sistem hot start de nalt fidelitate i randament de amplificare crescut, inclusiv cu inte ARN bogate n GC. Transcriii pot fi de pn la 6,5 kb i se vor folosi la determinarea calitativ, semi-cantitativa sau cantitativ a nivelurilor transcriptionale, determinarea prezenei/absenei matrielor ARN, cuantificarea expresiei genice i clonarea ARN de pn la 6,5 kb. Primer for cDNA Synthesis leag terminaia 3-polyA a unui ARNm pentru iniierea sintezei unei copii de ADNc, fiind folosit pentru RT-PCR, librarii ADNc i sinteza primei catene de ADNc. Primer random conine 2 mg de primer, random pd(N)6, sare de potasiu, pentru 400 de reacii.

Amestecuri Master i truse pentru PCR

PCR Core KitPLUS se folosete n laboratoarele PCR n care se execut un numr mare de reacii cu perechi identice de primeri i n care exist un risc semnificativ de rezultate fals-pozitive datorate contaminrii. Gradul de reducere a contaminrii este de cel puin 107 copii. Produii PCR coninnd dU vor servi ca inte de hibridizare, matrie pentru secventarea cu terminatori dideoxi i pot fi clonai direct dac sunt transfectati ntr -o gazd bacterian UNG (Uracil-N-Glucozidaza, o enzim ce utilizeaz dU). Digestia cu endonucleaze de restricie nu este afectat (Eco RI i Bam HI) sau este uor redus (Hpa I, Hind II, Hind III). Pentru celelalte enzime de restricie se va evalua individual efectul substituiei dT cu dU asupra activitii enzimatice. Trusa nu este recomandat pentru studii de legare a proteinelor sau studii de interacie cu ADN.

FastStart PCR Master este un amestec de reacie hot start gata de utilizare, livrat n form concentrat 2x, ce conine toi reactivii (cu excepia primerilor PCR i a intei) necesari rulrii PCR standard i RT-PCR n 2 pai. High Fidelity PCR Master se folosete n locul sistemului Expand High Fidelity System sau a reactivilor separai, n cele mai multe aplicaii PCR. Singura limitare este c volumul probei s nu depeasc jumtate din volumul total de reacie. High Fidelity PCR Master este stabil la +2/+8C, permind pornirea imediat a PCR, fr consum de timp pentru dezghearea reactivilor. Se amplific fragmente de ADN i ADNc de pn la 5 kb. Amestecul are fidelitate de ~3x mai bun fat de polimeraza Taq. Apa pur PCR-grade este prevzut n trusa. Pwo Master conine toi reactivii necesari pentru High Fidelity PCR (cu excepia primerilor PCR i a intei), livrai n formula concentrat 2x, gata de utilizare. Trusa este potrivit pentru amplificarea cu mare fidelitate (de 18x mai precis fa de polimeraza Taq) a fragmentelor ADN de lungime moderat (3 kb), amplificarea ADN pentru aplicaii critice i PCR de mare capacitate. Nu este nevoie s determinai condiiile ionice optime pentru o determinare anume, sau s ajustai concentraiile componentelor. Concentraia ionilor bivaleni de Mg din amestec i sistemul tampon cu formula special permit amplificarea excelent a celor mai multe inte 3 kb. Produsul se pstreaz la 2- 8C i poate fi utilizat imediat. PCR Master se utilizeaz n locul PCR Core Kit, sau a reactivilor individuali, n aproape toate aplicaiile PCR, cu singura limitare c volumul probei s nu depeasc jumtate din volumul total de reacie. Stabil la +2/+8C, PCR Master conine MgCl2 n concentraie fix de 1,5 mM.

Optimizarea reaciei PCR

PCR Optimization Kit Uracil-DNA Glycosylase recombinant din E. coli K 12 Uracil-DNA Glycosylase, heat-labile recombinant din bacteria marina BMTU 3346 T4 Gene 32 Protein Strip PCR Tubes and Caps (fie cte 8 sau 12 per strip) sunt destinate thermal cyclers pentru transfer termic rapid i optim n PCR, RT-PCR, sinteza ADNc i secventare. Ali reactivi generici sunt MgCl2 Stock Solution, PCR Buffer Set, PCR Buffer fr MgCl2, 10x i Apa PCR Grade, precum i o gam larg de enzime pentru PCR.

Reactivi pentru PCR n timp real

Roche va pune la dispoziie reactivi potrivii pentru siteme tere de PCR n timp real, ce nu necesit normalizare cu ROX.

FastStart TaqMan Probe Master, amestec de reacie hot start, pentru sonde, gata de utilizare, fr ROX, pentru qPCR i qRT-PCR*** cu alte sisteme dect LightCycler FastStart SYBR Green Master, amestec de reacie hot start cu SYBR Green I, gata de utilizare, fr ROX, pentru qPCR i qRT-PCR cu alte sisteme dect LightCycler n cazul n care deinei un instrument ce necesit normalizare cu ROX, putei selecta din lista de reactivi oferii de Roche Applied Science acei reactivi necesari pentru a amplifica (pn la 500 pb) i detecta inte ADN i ADNc, indiferent de coninutul GC/AT al acestora. Amestecurile sunt stabile timp de peste 24 de ore la temperatura camerei, fiind ideale pentru aparatele de pipetare robotizate. Beneficiai de noul colorant universal de referin, special proiectat i inclus n amestecul de reacie, ce permite evitarea pipetarilor suplimentare de ajustare a concentraiei.

FastStart TaqMan Probe Master (Rox) i FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) i ROX Reference Dye sunt destinate sistemelor de qPCR care necesit normalizare cu ROX. FastStart Universal Probe Master (Rox) i FastStart SYBR Green Master (Rox) idem. Pe pagina de web Roche Applied Science avei la dispoziie un ghid interactiv pentru selecia produselor de care avei nevoie. Petru aceasta, copiai n browser adresa https://www.roche-applied-science.com/sis/campaigns/dntp/index.jsp?id=DN030000. De asemenea, putei consulta acest document.

Reactivi pentru PCR n timp real cu sistemele Roche LightCycler

Reactivi i truse generice pentru LightCycler cu carusel Sistemele LightCycler cu carusel ofer i amestecuri de reacie i truse speciale, optimizate pentru detecia i cuantificarea sensibil i specific a intei, cu evitarea acumulrii produilor secundari i a artefactelor i prevenirea formrii dimerilor de primeri. Acestea sunt combinaii unice de mixuri FastStart cu formaturi de detecie variate, incluznd sonde de hidroliza.

Pentru reaciile RT PCR ntr-un pas, folosii amestecurile de reacie hot start, gata de utilizare LightCycler RNA Master HybProbe, ori LightCycler RNA Master SYBR Green I, ce conin Tth n combinaie cu aptameri. Aptamerii sunt oligonucleotide dedicate ce se leag la centrul activ al polimerazei Tth i previn ataarea acesteia la int, la temperaturi situate sub cea optim de reacie. Aptamerii sunt desprini din centrul activ la temperaturi nalte, activnd astfel reacia hot-start. Pentru reaciile RT-PCR n doi pai, folosii Transcriptor Reverse Transcriptase combinat cu LightCycler FastStart DNA MasterPLUS HybProbe, ori LightCycler Multiplex DNA Master HybProbe * Aptamerii sunt oligonucleotide sau oligopeptide capabile s se lege la o molecul tinta specific. Aptamerii sunt creai de obicei prin selecie dintr-un pool mare de secvene aleatoare, dar exist i aptameri naturali, n aa-numiii ribo-comutatori(a). Aptamerii se pot folosi ca remedii macromoleculare, att n cercetare ct i n scopuri clinice. Dac se combin cu ribozimele(b), aptamerii sunt capabili de autoscindare, n prezena propriei molecule inta.
(a)

Ribo-comutatorul este o parte dintr-o molecul de ARNm ce poate lega direct o molecul inta de dimensiuni mici, n urma creia activitatea genic este afectat. Prin urmare, un ARNm ce conine un ribo -comutator este direct implicat n autoreglarea propriei activiti, ca rspuns la diferite concentraii ale moleculei inta.
(b)

Ribozima (denumit i enzima ARN sau ARN catalitic) este o molecul de ARN cu structura teriara bine definit ce i permite cataliza unei reacii chimice. Multe ribozime naturale catalizeaz fie hidroliza uneia din propriile legturi fosfodiesterice, fie activitatea aminotransferazica a ribozomilor. Ribozimele produse n laborator sunt capabile, n condiii stricte, s-i catalizeze propria sintez. Truse specifice de parametru pentru LightCycler cu carusel Consultai documentul Sistemele LightCycler cu carusel Alte companii furnizoare de truse specifice de parametru i seturi pentru LightCycler cu carusel

Genes-4U (Neftenbach, Elveia) Search-LC (Heidelberg, Germania) Companii posesoare de licen pentru oligonucleotide marcate compatibile cu Roche Applied Science LightCycler

TIB MOLBIOL (Berlin, Germania) Metabion (Martinsried, Germania) Idaho Technology (Salt Lake City, UA) Integrated DNA Technologies (UA) Reactivi i truse generice pentru LightCycler 480 Consultai i seciunea dedicat pe portalul LightCycler 480. Instrumentele LightCycler sunt concepute pentru date de omogenitate excepional, fr necesitatea normalizrii cu colorani de referin.

LightCycler 480 RNA Master Hydrolysis probes LightCycler 480 RNA Pre-Amplification Kit LightCycler 480 High Resolution Melting Master LightCycler 480 ResoLight Dye LightCycler 480 SYBR Green I Master LightCycler 480 Probes Master LightCycler 480 Genotyping Master LightCycler 480 Control Kit SimpleProbe 519 Labeling Reagent LightCycler 480 CYAN 500 Labeling Reagent NOU ! RealTime ready Cell Lysis Kit, pentru studii rapide i de mare performana de expresie genic n celule cultivate, de tip qRT-PCR n doi pai. Trusa folosete un protocol avansat cu o singur etap de liza a 3 -30.000 celule n 5 minute la temeperatura camerei, apoi lizatul se folosete direct la sinteza ADNc, eliminnd etap de purificare a ARN. ADNc este apoi analizat cu LightCycler 480 de orice capacitate. Truse speciale pentru LightCycler 480 Informaii referitoare la Universal ProbeLibrary, RealTime Ready i miRCURY LNA vei gsi consultnd paragraful "Aplicaii" din seciunea PCR n timp real. * Footprint genetic de mare capacitate, n care se folosete o librrie de transpozoni pentru a insera mutaii destinate inactivrii genelor n celule. Se determina profilul transcripional (prin microarray ADN sau secventare ARN) dup selecie (pentru rezistena, cretere etc.) i semapeaza inactivrile mutaie/gena asociate cu selecia vizat. ** Hibridizarea substractiv este o tehnic foarte folositoare de studiu al expresiei genice n esuturi sau tipuri celulare specifice, sau aflate ntr-un anumit stadiu. Tehnica permite amplificarea prin PCR numai a fragmentelor ADNc ce difer ntre transcriptomul experimental i cel de control. De semenea, pot fi evideniate diferenele de abundent relativ a transcriilor c diferene genetice ntre specii. Tehnica se bazeaz pe ndeprtarea ADNdc format prin hibridizare ntre o prob de control i una de cercetat, eliminndu-se astfel ADNc sau ADNg abundente similar, i reinndu-se numai transcriii/secvenele genomice exprimate diferenial, sau cu secvene variabile. *** Prin convenie internaional, RT nseamn revers-transcriere, iar PCR n timp real (Real-Time PCR), contrar ateptrilor, se prescurteaz cu qPCR (de la quantitative PCR)