Introducere în PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION sau PCR este una din cele mai utilizate tehnici
în biologia moleculară. PCR reprezintă o metodă de amplificare in vitro a unei secevenţe
specifice de ADN, pornind de la o cantitate oarecare de ADN matriţă (template) care, cel puţin
teoretic, poate fi de ordinul una/câteva molecule. Numele acestei tehnici derivă de la una din
componentele de bază ale sale, ADN-polimeraza, utilizată pentru a amplifica un fragment de
ADN prin replicare enzimatică in vitro. Pe măsură ce PCR progresează, ADN-ul nou generat este
utilizat pe post de matriţă (template) pentru replicare, ceea ce duce la o reacţie în lanţ, în care
ADN-ul matriţă este amplificat exponenţial. Astfel, PCR permite amplificarea de milioane de ori
a unor secvenţe de ADN (inclusiv gene) specifice. Tehnica PCR a fost introdusă de Karry Mullis
în 1984 (premiul Nobel în 1993).

Dezvoltarea tehnicii PCR a fost posibilă datorită următoarelor:

1) Descoperirea ADN polimerazelor termorezistente.
2) Posibilitatea de a sintetiza oligonucleotide cu orice secvenţă dorită, la un preţ relativ scazut.

Majoritatea metodelor PCR sunt aplicate pentru amplificarea unor secvenţe de maximum 10 kb1,
dar există şi tehnici (long PCR) care permit amplificarea unor secvenţe de până la 40 kb.

Tehnica PCR necesită următoarele componente:

1) O matriţă ADN (DNA template) care conţine regiunea ce urmează a fi amplificată.

2) O ADN polimerază termostabilă (Taq polimeraza, Pfu polimeraza, etc.) necesară pentru
a sintetiza noile fragmente de ADN; temperatura optimă de acţiune a acestor enzime este
de regulă 70-72ºC.
3) dNTP (amestec echimolecular de cei patru 2’-deoxi-nucleozid trifosfaţi: dATP, dCTP,
dGTP și dTTP), “cărămizile” necesare sintezei noilor fragmente de ADN.
4) Primerii ADN (oligonucleotide necesare iniţierii sintezei ADN, numite şi amorse).
Primerii sunt secvenţe de ADN monocatenar complementare cu regiunile care flanchează
secvenţa ce urmează a fi amplificată. Într-o reacţie tipică de amplificare se utilizează doi
primeri: direct (forward primer) şi revers (reverse primer).
5) O soluţie tampon care să asigure enzimei un mediu corespunzător unei activităţi şi
stabilităţi optime.
6) PCR Thermocycler, un aparat care permite încălzirea şi răcirea rapidă a tuburilor de
reacţie.

PCR polimerazele folosite în prezent provin din câteva surse nu tocmai obişnuite. Cea
mai utilizata este Taq polimeraza obţinută din bacteria termofilă Thermus aquaticus, izolată din
gheizerele din Parcul Naţional Yellowstone (SUA). O altă polimerază numită Vent polimeraza,
a fost izolată din bacteria Thermococcus litoralis, bacterie întâlnită în zonele termale de pe

1
kb = kilobază (corespunzător la 1000 nucleotide/baze)

1
fundul oceanelor. Pfu polimeraza provine din bacteria termofilă Pyrococcus furiosus, izolată
pentru prima dată din sedimentele marine de lângă vulcanii din Italia. Aceste enzime sunt stabile
la temepraturi de peste 95ºC, temperatură la care ADN-ul este complet denaturat.

Faze pre-mergătoare PCR

Faza 1. Proiectarea secvenţelor primer. Pentru a replica fragmente de ADN, este
necesară cunoaşterea secvenţelor care marginesc regiunea de interes (se obţin de regulă din baze
de date accesibile pe Internet).
Faza 2. Izolarea ADN matriţă (template) ce include fragmentul care trebuie amplificat.
Ca matriţă poate fi utilizat ADN-ul total (genomic sau cromozomial), ADNc (cDNA obţinut prin
copierea mARN cu ajutorul unei revers-transcriptaze), sau chiar clone specifice, fragmente de
ADN, etc. Este necesară o cantitate foarte mica de ADN matriţă, astfel încât pot fi analizate
probe foarte mici (uneori sunt suficiente câteva celule).
Faza 3. Prepararea amestecului de reacţie. In această etapă, sunt adăugate peste ADN-
ul matriţă un exces de primeri (oligonucleotide), ADN polimeraza şi cei patru 2’-deoxinucleozid-
trifosfataţi (dNTP).

Etapele PCR

Ciclul 1. Denaturarea ADN-ului matriţă. Amestecul este incălzit la 94-95ºC pentru a

denatura ADN, care se separă în cele două catene complementare.

Ciclul 2
Etapa 2.1. Hibridizarea (annealing). Amestecul de ADN este răcit la 50-55ºC. Aceasta
permite amorselor (primerilor) să se lege specific de secvenţele complentare de pe ADN-ul
matriţă: un primer pentru fiecare catena de ADN. Polimeraza detectează oligonucleotidele
anelate (hibridizate) şi le foloseşte ca primeri pentru a converti ssADN (single stranded DNA,
monocatenar) în forma dublu catenara (dsDNA, double stranded DNA). Temperatura de anelare
depinde de Tm (temperatura de “topire”) al primerilor.
Etapa 2.2. Elongarea. Se ridică temperatura la 70-72ºC, temperatura optimă pentru
polimerazele termo-rezistente. Temperaturi mai stringente permit doar reacţiile primerilor ataşaţi
corect (primerii nelegati foarte bine de situsuri mai putin complementare sunt denaturati).
Timpul de elongare se stabileşte în funcţie de lungimea fragmentului de amplificat (1 min/1000
bp2).
Etapa 2.3. După formarea dsADN, temperatura de reacţie este crescută din nou la 95ºC.
ADN polimeraza este stopată, iar noul dsADN este denaturat.

Ciclul se repetă de 25-30 de ori. În 20 de cicluri complete ADN se poate amplifica

teoretic de până la 1 milion de ori, considerând că fiecare ciclu are un randamnet de 90%.

Ciclul 3. Elongarea finală. Această etapă permite elongarea completă a fragmentelor

monocatenare. Are loc la 72ºC, 7-10 min.

Ciclul 4. Stadiul final. Se păstrează la 4ºC până la scoaterea din aparat.

2
bp, pereche de baze (base pair)

2
 Set de 8 amestecuri de reacţii PCR

Nu există un maxim al numarului de cicluri de replicare. Totuşi, la un număr foarte mare

de cicluri pot apărea erori. De regulă se utilizează protocoale cu 20-30 cicluri de amplificare.

Schema amplificării unui fragment de ADN prin PCR

3
Clonarea unei gene fungice

I. Izolarea ADN-ului total (ADN-ul genomic) din celule de Saccharomyces

cerevisiae

Mod de lucru:

1) Inoculaţi celule de Saccharomyces cerevisiae în 5 ml mediu de cultură (YPD) şi incubaţi peste

noapte cu agitare la 28-30ºC.
2) Colectaţi celulele prin centrifugare şi aruncaţi supernatatul.
3) Adăugaţi peste celule100 µl STETşi vortexaţi până obţineţi o suspensie celulară omogenă.
4) Adăugaţi aproximativ 100 µl nisip de cuarţ (sterilizat prin autoclavare) şi vortexaţi 5 min la
temperatura camerei.
5) Adăugaţi încă 100 µl STET şi vortexaţi scurt.
6) Încălziţi 3 min la 95ºC
7) Răciţi pe gheaţă 1-2 min, după care transferaţi faza lichidă într-un tub eppendorf nou (aruncaţi
nisipul de cuarţ).
8) Centrifugaţi 10 min la 4oC.
9) Transferaţi 100 µl supernatant într-un tub eppendorf nou.
10) Adăugaţi 10 µl AcONa 3 M (1/10 din volumul total).
11) Adăugaţi 2 volume EtOH 99% şi incubaţi 5-10 min la temperatura camerei.
12) Centrifugaţi la 10.000 rpm, 5 min la temperatura camerei (se va vedea un sediment albicios,
care este ADN-ul izolat).
13) Aruncaţi supernatantul şi spălaţi cu 200 µl EtOH 70% rece.
14) Centrifugaţi 5 min la temperatura camerei şi îndepărtaţi complet supernartantul.
15) Resuspendaţi ADN-ul obţinut în 20µl of TE şi stocaţi-l la 4ºC (sau la -20 ºC atunci când se
păstrază mai mult timp).

Tampon STET (tampon de liză celulară):

• 8% sucroză (zaharoză) în 50mM Tris-HCl, pH 8.0

• 5% Triton X-100 (v/v)
• 50 mM EDTA

Tampon TE:

• 10 mM Tris-HCl, pH 8
• 1 mM EDTA, pH 8

Observaţii
- Precipitarea ADN-ului dintr-o soluţie apoasă se face cu 2 volume EtOH 99% sau cu 1 volum
izopropanol. Pentru o precipitare completă, soluţia iniţială se trateaă cu 1/10 vol. AcO-Na+ (3 M)
sau AcO-NH4+ (10 M).
- Toate soluţiile trebuie să fie sterile.

4
II. Amplificarea unei gene fungice prin tehnica PCR

Reactivi şi echipamente necesare pentru PCR standard

Primeri (amorse)-fiecare primer trebuie să aibă 20-30 nucleotide în lungime şi să

conţină un numar aproximativ egal din cele 4 baze azotate, cu o o distribuţie echilibrată a
resturilor G-C şi cu o tendinţă scăzută de a forma structuri secundare stabile. Acolo unde este
necesar, se pot adăuga situsuri de restricţie.
Primerii sunt sintetizati cu ajutorul unui sintetizator automat de ADN şi pot fi în general
utilizaţi pentru PCR fără prealabile purificări. Totuşi, amplificarea este adesea mai eficientă dacă
oligonuclotidele sunt purificate prin cromatografie pe răşini comerciale sau prin electroforeza în
gel de poliacrilamidă.

ADN matriţă - Matriţa poate fi un fragment de ADN, un preparat de ADN genomic, o plasmidă
recombinantă sau orice altă probă care conţine ADN. Matriţa de ADN se păstrează în 10 mM
TRIS-HCl (pH = 7,6) care conţine o concentraţie mică de EDTA (< 0,1 mM) (Tampon TE).

ADN polimeraza termostabilă- Taq ADN polimeraza este o enzimă standard utilizată pentru
faza de amplificare în majoritatea tehnicilor PCR. Taq ADN polimeraza este livrată în tampon
de stocare ce contine 50% glicerol. Deoarece această soluţie este foarte vâscoasă şi dificil de
pipetat cu erori minime, cea mai bună metodă este centrifugarea tubului care conţine enzima la
viteza maximă (10 s la 4ºC) şi apoi colectarea cantităţii de enzimă cu o pipetă adecvată.

Sisteme de pipetare- Sunt indicate sisteme automate de micropipetare echipate cu vârfuri cu

barieră. Astfel de vârfuri sunt prevazute cu o barieră hidrofobă pentru a preveni trecerea
accidentală a lichidului în sistemul de pipetare. Acestă metodă reduce riscul de contaminare a
reactivilor PCR şi a probelor de ADN.

Pipete- Pentru a transfera lichidele cu vâscozitate mare este necesar un sistem de pipetare în care
pistonul pipetei nu se află în contact direct cu lichidul.

Tuburi PCR - pentru amplificare sunt necesate tuburi din plastic cu pereţii subţiri care să se
fixeze perfect în blocul Termocycler-ului şi care să permită un transfer rapid de căldură.

Termocycler programat cu protocolul de amplificare dorit.

Important: pentru a reduce riscul de contaminare, se prepară un set de recativi şi soluţii doar
pentru PCR.

Tampoane şi soluţii:
 10X tampon de aplificare
 Cloroform

5
  Amestec dNTP (20mM) ce contine toţi patru dNTP în raport echimolar (pH=8)
 ADN polimeraza termostabilă
 Primerii (direct şi invers) dizolvaţi în apă
 Matriţa ADN

Se utilizeaza urmatoarea formulă pentru a calcula masa moleculară a oligonucleotidelor:

Mr = (nC x 289) + (nA x 313) + (nT x 304) + (nG x 329),

unde nC, nA, nT, nG sunt numarul de resturi de C, A, T, respectiv G din oligonucleotidă. Masa
moleculară a unei oligonucleotide de 20 de meri va fi aprox. 6000 Daltoni, iar 100 pmoli de
oligonucleotidă sunt echivalenţi cu aprox 0,6 μg.

Se dizolvă matriţa de ADN in TE, la urmatoarele concentraţii:

1) ADN genomic de mamifere, 100 μg/ mL
2) ADN genomic fungic, 1 μg/ mL
3) ADN genomic bacterian, 0.1 μg/ mL
4) Plasmide ADN, 1-5 ng/ mL

Echipamente speciale:
 Vârfuri cu barieră pentru sistemele de micropipetare
 Tuburi de centrifugă cu pereţi subţiri pentru reacţiile de amplificare (0,2 mL) sau
plăci de microtitrare
 Pipete
 Termocycler programat cu protocolul de amplificare dorit

Dacă termocycler-ul nu este prevăzut cu capac cu încălzire, se va folosi ulei mineral sau
ceară de parafină pentru a preveni evaporarea lichidului din amestetecul de reacţie în timpul
PCR. Parafina previne nu doar evapoararea, dar în acelasi timp menţine şi componentele de
reacţie separate (ex. primerii şi matriţa) până când amestecul de reacţie este încălzit. Această
separare previne legarea nespecifică a primerilor în timpul fazei iniţiale a reacţiei.

Mod de lucru:
Pentru fiecare reacţie PCR se amestecă urmatoarele componente, în ordine:

5 x tampon de amplificare 5 μL
20 mM sol. de 4 dNTPS (pH=8) 1 μL
20 μM primer direct (forward primer) 1 μL
20 μM primer invers (reverse primer) 1 μL
Taq polimeraza 1-2 unitati
Apă până la 23 μL
Matriţa ADN 2 μL
Volum total 25 μL

6
Fiecare set de reacţii PCR trebuie să includă control pozitiv şi negativ. Controalele pozitive sunt
necesare pentru a monitoriza eficienţa PCR, în timp ce controalele negative sunt necesare pentru
a monitoriza eventualele contaminări cu ADN străin.

Programul PCR standard

1) Denaturarea ADN matriţă, 95ºC, 2 min (1 ciclu)

2) Denaturare Hibridizare amorse Polimerizare

30 s la 95ºC 30 s la 55ºC 2 min la 72ºC
(25 cicluri)

3) Extensie
30 s la 95ºC 30 s la 55ºC 10 min la 72ºC
(1 ciclu)

4) 4ºC

Observaţii
- Timpii de reacţie şi temperaturile se adaptează în funcţie de tipul de echipament, volumele de
reacţie şi lungimea fragmentului de amplificat.
- În medie, polimerizarea durează cca 1 min pentru fiecare 1000 bp a ADN ţintă.
- Majoritatea aparatelor au un sfârşit de program în care probele amplificate sunt incubate la 4ºC
până sunt scoase din aparat. Probele pot fi lăsate peste noapte la acestă temperatură, dar este de
preferat stocarea lor la -20ºC.

Se prelevează o probă (2-5 μL) din amestecul de reactie şi se analizează prin electroforeză pe gel
de agaroză. O reacţie de amplificare decurge în bune condiţii dacă se poate detecta un fragment
ADN de mărimea aşteptată. Identitatea benzii poate fi confirmată prin secvenţializare ADN,
hibridizare Southern sau/şi realizarea unei hărţi de restricţie.

7
III. Introducerea într-un vector ADN a genei obţinute prin amplificarea PCR

Clonarea ADN este o tehnică prin care sunt amplificate şi replicate fragmente de ADN. Poate fi
realizată în două moduri: a) clonarea in vitro, prin PCR; a) clonarea în sistem celular.
Pentru clonarea unui fragment ADN în celule este necesar un vector de clonare utilizat pentru a
introduce fragnmentul de ADN respectiv în celule.

Procedură tipică de clonare, care utilizează ca vector de clonare o plasmidă