UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GR. T.

POPA IASI FACULTATEA DE FARMACIE CERCETRI PRIVIND PREZENA ACRILAMIDEI N ALIMENTELE PRELUCRATE TERMIC REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT Conductor tiinific, PROF. UNIV. DR. RODICA CUCIUREANU Doctorand, FARM. ANCA-IRINA BURLACU PRISCARU IAI 2009 CUPRINS INTRODUCERE...1 Motivaia cercetrii.......2 Obiectivele tezei de doctorat.....3 PARTE GENERAL........4 PARTE PERSONAL.6 CAPITOLUL VII. ANALIZA CANTITATIV A ACRILAMIDEI N PRODUSELE ALIMENTARE. VALIDAREA METODEI GAZ CROMATOGRAFICE.......6 VII.1 Instrumente analitice i condiii cromatografice..6 VII.2 Validarea metodei....6 VII.3 Concluzii...7 CAPITOLUL VIII. ANALIZA CANTITATIV A ACRILAMIDEI N PRODUSELE ALIMENTARE. APLICAII8 VIII.1 Prelucrarea probelor.8 VIII.2 Analiza cantitativ a acrilamidei n probele de chips-uri..8 VIII.3 Analiza cantitativ a acrilamidei n probele de cartofi prjii..9 VIII.4 Analiza gaz cromatografic a acrilamidei n probele de pine prjit9 VIII.5 Analiza gaz cromatografic a acrilamidei n probele de biscuii.9 VIII.6 Analiza gaz cromatografic a probelor de popcorn...10 VIII.7 Concluzii...10 CAPITOLUL IX. CORELAIA DINTRE CONINUTUL N ZAHR SOLUBIL I NIVELUL DE ACRILAMID16 IX.1 Determinarea concentraiei de zahr direct reductor i zahr total solubil prin metoda Luff-Schoorl..16 IX.2 Determinarea concentraiei de acrilamid din produsele alimentare...17 IX.3 Concluzii..19 CAPITOLUL X. INFLUENA PROCESULUI CULINAR ASUPRA CONINUTULUI N ACRILAMID. STUDIU

COMPARATIV...20 X.1 Implicaiile intervalului de prelucrare culinar i a temperaturii procesului culinar n procesul de formare al acrilamidei20 X.2 Influena modului de prelucrare culinar asupra coninutului n acrilamid..21 X.3 Concluzii...22 CAPITOLUL XI. STUDIUL MODIFICRILOR BIOCHIMICE, HEMATOLOGICE I HISTOPATOLOGICE N INTOXICAA CRONIC CU ACRILAMID23 XI.1 Modelul experimental 23 XI.2 Interpretarea statistic...24 XI.3 Investigaia biochimic..24 XI.4 Investigarea hematologic..29 XI.5 Investigaia histopatologic ...30 XI.6 Concluzii..32 CAPITOLUL XII. EVALUAREA POTENIALULUI PROTECTOR AL ACIDULUI ASCORBIC N INTOXICAIA SUBACUT CU ACRILAMID LA ANIMALELE DE LABORATOR...32 XII.1 Model experimental..32 XII.2 Investigaia biochimic.33 XII.3 Concluzii.38 CAPITOLUL XIII. POTENIALUL PROTECTOR AL FTALIDELOR DIN APIUM GRAVEOLENS N INTOXICAIA CU ACRILAMID.39 XIII.1 Modelul experimental..39 XIII.2 Investigaia biochimic39 XIII.3 Concluzii...46 CAPITOLUL XIV. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE.48 XIV.1 Concluzii generale48 XIV.2 Contribuii originale50 XIV.3 Perspective privind noi direcii de cercetare a problematicii acrilamidei51 Bibliografie...52 1 INTRODUCERE Acrilamida, compus sintetizat pentru prima dat de ctre Moureu, n Germania, prin adiia apei la acrilonitril, este utilizat n procesul de tratare al apei n scop potabil, n tratarea apelor reziduale, n obinerea gelurilor pentru electroforez, prelucrarea hrtiei i celulozei, prelucrarea minereurilor, fabricarea maselor plastice i a unor ambalaje pentru produsele alimentare, n industria cosmetic, n tratamentul solului, n industria textil, n obinerea agenilor de etanare utilizai n construcii .a. (1, 2). Acrilamida prezint o structur chimic posesoare a doi centri

de nesaturare: dubla legtur i gruparea amidic, ceea ce i confer un grad nalt de reactivitate i st la originea mecanismului toxicologic. Toxicitatea acrilamidei este cunoscut nc din primii ani de producie i utilizare. Agenia Internaional pentru Cercetare a Cancerului a clasificat acrilamida n categoria 2 de carcinogenitate i mutagenicitate, respectiv categoria 3 de toxicitate asupra reproducerii i dezvoltrii. De asemenea, amida acrilic este incriminat pentru potenialul neurotoxic. Efectele asupra sistemului nervos central apar dup cteva ore pn la cteva zile de la intoxicaie i presupun: confuzie, probleme de memorie i concentrare, oboseal, vorbire incoerent, halucinaii. Neuropatiile periferice se dezvolt n urma unei perioade de laten care poate dura de la cteva zile pn la cteva sptmni: parestezii, amoreal, slbiciune muscular, reflexe sczute ale tendonului. Tremorul i tulburrile de mers se pot dezvolta ca urmare a afeciunilor la nivelul cerebelului si creierului mijlociu (3, 4, 5, 6). Prezena acrilamidei n alimentele bogate n amidon i prelucrate termic prin prjire sau coacere a fost decelat n anul 2002 de ctre cercettorii suedezi (2). Astfel, acrilamida devine preocuparea principal a cercetrilor analitice i toxicologice din punct de vedere al mecanismului de formare n alimentele prelucrate termic prin prjire sau coacere, al dezvoltrii unor metode de analiz sensibile, al evalurii coninutului n acrilamid al alimentelor, al estimrii aportului de acrilamid prin consum de alimente, precum i al mecanismului responsabil de inducerea genotoxicitii, 2 carcinogenitii i a toxicitii asupra aparatului de reproducere (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15). Motivaia cercetrii n Romnia, problematica acrilamidei nu s-a bucurat de aceeai atenie din partea autoritilor n domeniu sau a industriei alimentare. Pn n prezent, cercetrile privind evaluarea aportului de acrilamid prin consum de alimente n Romnia sunt reduse, att sub aspect analitic ct i toxicologic (16). Prin urmare, necesitatea abordrii problematicii acrilamidei n context naional devine evident, att din punct de vedere analitic, ct i prin prisma expunerii populaiei la toxicitatea acrilamidei prin consumul de alimente cu un coninut bogat n aceast nox alimentar. Mai mult, incidena crescut a acrilamidei n produse alimentare i riscul expunerii organismului uman la impactul cu doze zilnice de acrilamid impun necesitatea acionrii pe variate direcii de cercetare, cum ar fi: gsirea unor ci de prevenire a expunerii la dozele de toxic, prin educaia conduitei alimentare, prevalent la tineret, categorie atras de gustul alimentelor cu un coninut ridicat de acrilamid; prentmpinarea procesului de formare al acrilamidei

n produsele alimentare prin controlul reaciilor sintetizatoare de amid acrilic n cursul prelucrrii termice; reducerea toxicitii acrilamidei prin metode fitoterapeutice, chemopreventive sau de inducie enzimatic, metode care s accelereze excretarea metaboliilor toxici ai acrilamidei sau s prentmpine formarea de aduci chimici, precursori ai leziunii biochimice. Prin urmare, modelele experimentale pe animale de laborator, realizate n cadul acestei teze de doctorat, ce i-au propus evaluarea potenialelor antitoxice i protectoare ale acidului ascorbic i a ftalidelor din uleiul volatil, respectiv soluiile extractive de Apii folium, Apii radix i Apii semen i justific necesitatea cercetrii. 3 Obiectivele tezei de doctorat Cercetrile din cadrul tezei de doctorat au fost orientate spre urmtoarele obiective: validarea unei metode gaz cromatografice de determinare cantitativ a acrilamidei n alimente; evaluarea coninutului n acrilamid al unor produse alimentare disponibile pe piaa comercial din Romnia; influena procesului culinar asupra concentraiei de acrilamid n produse pe baz de cereale (pine feliat prjit i neprjit) i produse pe baz de cartofi (cartofi prjii, cartofi copi, cartofi prjii sub abur); estimarea corelaiei existente ntre coninutul n zahr direct reductor i concentraia n acrilamid n produsele alimentare pe baz de cartofi (cartofi prjii) i cereale (pop-corn); evidenierea modificrilor biochimice, hematologice i histopatologice pe animale de laborator expuse aportului cronic de acrilamid prin consum de cartofi prjii, pine prjit, respectiv soluie apoas de acrilamid 0,1 g/L timp de 90 de zile; aprecierea modificrilor biochimice n intoxicaia subacut cu acrilamid i evaluarea unei posibile aciuni antitoxice a acidului ascorbic; determinarea modificrilor biochimice n intoxicaia cronic cu acrilamid survenit prin administrarea unei doze de 25 g/kg timp de 11 sptmni i estimarea efectului protector al preparatelor de Apium graveolens (Apii aetheroleum, Apii folium, Apii radix, Apii semen). *** Teza de doctorat este structurat pe 14 capitole, cuprinde 295 de pagini (parte general 83 pagini), 175 de figuri i 86 de tabele. 4 PARTE GENERAL STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII Stadiul actual al cunoaterii problematicii acrilamidei este structurat pe 6 capitole. Capitolul I prezint aspecte generale privind caracteristicile

fizico-chimice ale amidei acrilice, obinerea monomerului pe cale sintetic i utilizrile sale n industrie (1, 2, 17, 18). Capitolul II al tezei expune cercetrile realizate pn n prezent pe plan internaional privind elucidarea mecanismului de formare al acrilamidei n alimente. O prim ipotez susine c precursorii toxicului rezultat n urma prelucrrii termice a alimentului sunt diferii aminoacizi (alanina, glutamina, asparagina, metionina) (19). A doua ipotez consider acroleina ca fiind implicat n mecanismul de formare al acrilamidei (17, 19). O a treia posibilitate de exprimare a procesului de formare al acrilamidei n alimente vizeaz acidul acrilic, compus rezultat din acrolein sau acizi policarboxilici (19). A patra ipotez, considerat a sta la baza mecanismului principal de formare al amidei acrilice n alimente, consider compuii Maillard ca fiind veritabilii precursori ai toxicului alimentar (7, 20, 21, 22). Capitolul III prezint o imagine sintetic a metodelor de analiz cantitativ a acrilamidei n alimente. Metodele de evideniere i cuantificare ale amidei acrilice sunt variate, fiecare adaptndu-se tipului de produs analizat i caracteristicilor acestuia, caracteristici ce se refer la consisten, coninutul n grsimi, aminoacizi, proteine etc. Stadiile procesului analitic sunt comune tuturor metodelor de dozare a acrilamidei i constau n: omogenizarea produsului alimentar i adaosul standardului intern, extracia analitului fie n ap, fie n solveni organici, purificarea extractului, etape urmate fie de analiza direct a amidei toxice (prin cromatografie lichid de nalt performan n tandem cu spectrometria de mas sau prin gaz cromatografie cuplat cu detecia spectrometric), fie de un pas suplimentar ce const n derivatizarea acrilamidei prin brominare, etap ce conduce la creterea sensibilitii metodei (23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31; 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38). 5 Capitolul IV abordeaz sistematic i gradual factorii care influeneaz procesul de formare al acrilamidei n alimente i modalitile de reducere ale concentraiei noxei alimentare n produsele alimentare pe baz de cereale i cartofi. Coninutul n acrilamid al produselor alimentare este influenat de o serie de parametri, parametri dependeni de materia prim (tipul de sol, amplasamentul culturilor, tratamentul cu fertilizatori organici, momentul recoltrii, coninutul n precursori al materiei prime, prezena aminoacizilor i proteinelor, coninutul n umiditate al materiei prime, condiii de depozitare) (21, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45) i parametri dependeni de procesul culinar (blanizare, pre-prjire, condimente avnd caracter antioxidant, utilizarea carbonatului de amoniu n obinerea produselor de panificaie, utilizarea ndulcitorilor, timp i temperatur de prelucrare culinar) (46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57). Capitolul V al tezei de doctorat prezint cile de expunere

ale populaiei la agresivitatea acrilamidei, precum i modaliti de estimare ale aportului de acrilamid prin consum de alimente cu un coninut bogat n aceast nox alimentar (3, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68). Capitolul VI reprezint o trecere n revist a datelor din literatura de specialitate privind toxicocinetica i toxicitatea acrilamidei la animalele de laborator i la om. Acrilamida este incriminat a avea aciune cancerigen, genotoxic, mutagen, neurotoxic i toxic asupra reproducerii. Cu toate acestea, concluzii certe privind potenialul carcinogen al acrilamidei n urma consumului ndelungat de alimente cu un coninut bogat n acest compus nu pot fi susinute de studiile epidemiologice efectuate. Efectele genotoxice i cancerigene ale acrilamidei au fost demonstrate doar pe culturile de celule embrionare de hamster sirian i la animalele de laborator (4, 5, 70, 71, 72, 73). 6 PARTE PERSONAL CAPITOLUL VII ANALIZA CANTITATIV A ACRILAMIDEI N PRODUSELE ALIMENTARE - VALIDAREA METODEI GAZ CROMATOGRAFICE Prezentul capitol i propune elaborarea i validarea unei metode simple de determinare cantitativ a acrilamidei, bazat pe tehnica cromatografiei gazoase cu detecie de ionizare n flacr, urmrind parametrii: liniaritate, precizie, acuratee, stabilitate, randament de recuperare, limit de detecie, limit de cuantificare. VII.1 Instrumente analitice i condiii cromatografice Experimentele au fost efectuate pe un gaz cromatograf Agilent Technologies (6890N, Network GC System US10337042 USA), cu detector de ionizare n flacr, folosind ca gaz purttor azotul, cu debit de 2,0 ml/min. VII.2 Validarea metodei Metoda de validare i procedura de analiz a probelor s-a realizat n conformitate cu normele de validare pentru metodele analitice ale FDA (75). Validarea metodei a fost realizat prin stabilirea urmtorilor parametri: liniaritate, precizie, acuratee, stabilitate, randament de recuperare, limit de detecie, limit de cuantificare. a) Determinarea domeniului de liniaritate Rspunsul acrilamidei este liniar peste un interval de concentraie de 0,5 5,0 mg/L, avnd un coeficient de determinare (R2 ) de 0,9999 . b) Determinarea preciziei Determinarea repetabilitii Pentru repetabilitate, cte cinci determinri pentru trei soluii standard (0,5 mg/L, 1,0 mg/L i 5,0 mg/L) au fost realizate n aceeai

zi, de ctre acelai analist, cu aceeai aparatur, i cu aceiai reactivi, n aceleai condiii experimentale. Rezultatele demonstreaz o bun repetabilitate a metodei. 7 Determinarea preciziei intermediare Precizia intermediar a fost verificat prin realizarea a cte 5 injecii pe zi, n trei zile diferite, pentru cele trei soluii standard (0,5 mg/L, 1,0 mg/L i 5,0 mg/L). Rezultatele evideniaz o bun precizie intermediar a metodei. n concluzie, pe baza rezultatelor obinute, se poate aprecia faptul c metoda este precis. c) Determinarea exactitii Exactitatea metodei a fost determinat prin analiza a trei puncte din curba de calibrare i compararea valorii msurate cu valoarea real. Rezultatele demonstreaz faptul c metoda prezentat este exact. d) Evaluarea stabilitii Stabilitatea a fost verificat pe trei soluii standard (0,5 mg/L, 1,0 mg/L, 5,0 mg/L) dup o lun, respectiv 2 luni de la preparare. n acest timp, soluiile au fost pstrate la ntuneric, n tuburi de hemoliz, la temperatura de 4C, fiind scoase doar n perioada injectrilor. Dup o lun de la preparare, n urma analizei gaz cromatografice a celor trei soluii standard, nu s-au observat modificri n ceea ce privete structura cromatogramei sau aria picului pentru acrilamid. Dup dou luni de la prepararea celor trei soluii standard, intervin modificri att n structura cromatogramei, prin apariia unor picuri noi, dar i n ceea ce privete aria picului pentru acrilamid, observndu-se o scdere a acesteia. e) Determinarea randamentului de recuperare Randamentul de recuperare se caracterizeaz prin obinerea unor valori optime n cazul tuturor categoriilor de produse analizate (cartofi prjii, chips-uri, pine prjit, biscuii, pop-corn). VII.3 Concluzii Metoda de determinare cantitativ a acrilamidei prezentat n acest capitol este o metod gaz cromatografic cu detecie de ionizare n flacr, care se caracterizeaz prin precizie, exactitate, stabilitate i un randament de recuperare corespunztor. Aceast metod prezint ca avantaje simplitatea i rapiditatea protocolului de prelucrare a probelor, precum i un cost redus de achiziionare a echipamentului analitic n comparaie cu alte metode de analiz cantitativ a acrilamidei. 8 CAPITOLUL VIII ANALIZA CANTITATIV A ACRILAMIDEI N PRODUSELE ALIMENTARE - APLICAII Obiectivul prezentului capitol const n evaluarea coninutului n acrilamid al produselor alimentare disponibile pe piaa comercial din Romnia (chips-uri, cartofi prjii, pine, pine

prjit, biscuii, pop-corn), utiliznd metoda gaz cromatografic a crei validare este prezentat n capitolul VII. VIII.1 Prelucrarea probelor Probele de chips-uri, cartofi prjii, pine prjit au fost mrunite prin mojarare i cntrite la balana analitic (n jur de 3 g pentru fiecare prob) n flacoane Erlenmeyer cu dop rodat. S-au adugat cte 10 ml metanol HPLC i 100 L soluie dimetilftalat 1,014 g/L (standard intern) n fiecare prob. n continuare, probele au fost meninute la 60C, pe plita magnetic, 3000 rpm, timp de 20 minute. Supernatantele au fost recuperate n eprubete de centrifug, meninute la temperatur sczut (4C) pentru 2 ore, supuse centrifugrii 20 minute la 3500 rpm i concentrate la aproximativ 1 mL. n final, s-au injectat n gaz cromatograf cte 0,2 L. Celelalte probe au fost supuse acelorai etape de prelucrare, cu excepia faptului c n cazul probelor de pop-corn i biscuii s-au utilizat pentru extracie 50 mL metanol, respectiv 20 mL metanol. VIII.2 Analiza cantitativ a acrilamidei n probele de chips-uri n scopul evalurii coninutului n acrilamid al probelor de chips-uri, s-au analizat 56 de probe diferite, fiecare rezultat reprezentnd media a 4 determinri. Domeniul valorilor medii ale concentraiilor se ntinde de la o valoare aflat sub limita de detecie a metodei i pn la 4,94 mg/kg (fig. VIII.1). n unele cazuri, pentru probe de chips-uri provenite din arje diferite, s-au obinut variaii considerabile n ceea ce privete coninutul n acrilamid. Aceste variaii ale concentraiilor de acrilamid pentru aceeai prob se pot explica prin faptul c, 9 provenind din arje diferite, materiile prime utilizate pot varia din punct de vedere al nivelurilor de precursori (asparagin i zaharuri reductoare) i al prezenei aminoacizilor i proteinelor (76, 77). De asemenea, parametrii procesului culinar pot fi diferii (temperatur i timp de prjire, tipul de ulei folosit la prjire i gradul de peroxidare, cantitatea de condimente ce pot interveni prin caracterul antioxidant, prezena clorurii de sodiu i a srurilor de calciu) (78, 79). VIII.3 Analiza cantitativ a acrilamidei n probele de cartofi prjii Pentru a evalua coninutul n acrilamid al probelor de cartofi prjii s-au analizat 16 probe procurate din diverse puncte de distribuie din oraele Iai, Bucureti, Cluj, Galai, Timioara. Probele de cartofi prjii prezint valori uor superioare probelor de chips-uri n ceea ce privete coninutul n acrilamid, cuprinse n intervalul 1,5 5,03 mg/kg (fig. VIII.2). VIII.4 Analiza gaz cromatografic a acrilamidei n probele de pine prjit Rezultatele privind concentraia de acrilamid n probele de pine prjit procurate din reeaua comercial din Romnia sunt

redate n figura VIII.3 i reprezint media a 3 determinri. Valorile sunt inferioare probelor de cartofi prjii i chips-uri, fapt explicabil printr-o concentraie mai sczut a aminoacidului precursor (asparagina) n cereale fa de cartofi. Aproximativ jumtate din probele de pine prjit analizate n acest experiment (47,62%) conin acrilamid n cantiti situate sub limita de cuantificare a metodei. Concentraia maxim n cadrul probelor analizate este de 1,60 mg/kg. VIII.5 Analiza gaz cromatografic a acrilamidei n probele de biscuii Probele analizate n vederea determinrii cantitative a acrilamidei sunt reprezentate de 39 de probe de biscuii procurate din diverse puncte comerciale de pe teritoriul Romniei. Rezultatele privind concentraia acrilamidei n probele de biscuii sunt prezentate n figura VIII.4 i reprezint media a 3 determinri. Valorile sunt asemntoare rezultatelor obinute pentru probele de pine prjit, excepie fcnd probele 4, 27 i 28, cu un coninut n acrilamid de 3,40 mg/kg, 3,89 mg/kg, respectiv 3,95 10 mg/kg. Un procent de 33,33% dintre probele analizate conin acrilamid n cantiti aflate sub limita de cuantificare a metodei gaz cromatografice. Rezultatele se caracterizeaz printr-o valoare a deviaiei standard de 2,149523, respectiv a deviaiei standard relative 1,523099 i reprezint consecina unui ntreg ansamblu de factori. Astfel, coninutul n acrilamid al biscuiilor este influenat nu numai de caracteristicile materiei prime (gradul de extracie al finii, soiul de cereale utilizat, proveniena culturilor de cereale), dar i de ingredientele folosite pe parcursul procesului industrial de preparare a biscuiilor (80). VIII.6 Analiza gaz cromatografic a probelor de pop-corn Rezultatele privind concentraia acrilamidei n probele de pop-corn analizate sunt ilustrate n figura VIII.5 i reprezint media a 3 determinri. Rezultatele prezint o bun distribuie a valorilor (SD = 0,8818, RSD = 0,8768). Dou dintre cele 14 probe analizate conin acrilamid n concentraii aflate sub limita de cuantificare (proba 12), respectiv de detecie (proba 9) a metodei gaz cromatografice. Restul probelor prezint valori ale concentraiei de acrilamid cuprinse n intervalul 0,12 3,40 mg/kg. Spre deosebire de celelalte probe, n cazul probelor de popcorn, pe lng factorul de variabilitate al materiei prime, intervine ca factor limitant procesul de prelucrare culinar prin intermediul microundelor. Cercetrile n domeniu confirm formarea acrilamidei att n produsele alimentare ct i n modelele experimentale n care sunt implicate microundele. VIII.7 Concluzii Analiznd valorile msurate pe categorie de produs, cele mai mari concentraii de acrilamid se gsesc n probele de cartofi prjii

(media = 6,0058 mg/kg), fiind urmate de probele de chips-uri (media = 1,5578 mg/kg), biscuii (media = 1,4113 mg/kg), pop-corn (media = 1,0057 mg/kg) i pine (media = 0,5112 mg/kg). 11 0,45 0,91 1,8 0,71 0,42 0,76 1,17 000 4,22 4,94 4,34 1,9 1,58 0,3 2,13 1,33 0,77 0,3 1,26 0,97 0,72 2,07 1,33 0,75 2,18 4,85 1,37 0 2,05 0,42 0 1,15 3,23 0 3,53 2,21 3,61 000 4,9 0,32 1,45 1,28 0,74

4,06 3,85 0 1 2 3 4 5 6 P1 P 4 P 5 P 6 P 7 P 9 P 10 P 11 P 13 P 14 P 15 P 16 P 17 P 20 P 21 P 22 P 23 P 24 P 25 P 27 P 28 P 29 P 30 P 31 P

32 P 33 P 34 P 35 P 36 P 37 P 38 P 39 P 40 P 41 P 42 P 43 P 44 P 45 P 46 P 47 P 48 P 49 P 50 P 51 P 52 P 53 P 54 P

55 P 56 Probe chips-uri Concentraia acrilamidei (mg/kg) Fig VIII.1. Concentraia acrilamidei n probele de chips-uri (rezultatele sunt media a 4 determinri) 12 3,56 4,27 2,03 1,99 2 5,03 1,5 2,39 2,65 2,03 2,55 3,02 3 3,5 3 2,55 0 1 2 3 4 5 6 Concentraia n acrilamid (mg/kg) Proba 1 Proba 3 Proba 5 Proba 7 Proba 9 Proba 11 Proba 13 Proba 15 Probe cartofi prjii

Fig. VIII.2. Coninutul n acrilamid al probelor de cartofi prjii 13 Concentraiile de acrilamid n probele de pine prjit 0 1,6 1,23 1 00 0 000 1,15 1,47 1,31 000 0,99 000 0,56 0,63 1,2 000 1 0,92 0 0,6 0,76 000 0,7 1,12 0,99 0,9 0,91 0,65 0,9 0,88 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Proba 1 Proba 3 Proba 5 Proba 7 Proba 9

Proba 11 Proba 13 Proba 15 Proba 17 Proba 19 Proba 21 Proba 23 Proba 25 Proba 27 Proba 29 Proba 31 Proba 33 Proba 35 Proba 37 Proba 39 Proba 41 Probe pine prjit Concentraia n acrilamid (mg/kg) Fig. VIII.3. Concentraia de acrilamid n probele de pine prjit 14 0 0,74 0 1,33 000 0 0,67 0 2,05 1,33 00 1,9 0,650,72 0,99 2 2,5 1,05 0,48 3,893,95 7,97 10,51 00 0,85 0,8 1,03 0,7 0 0,73 0

1,59 1,58 1,63 3,4 0 2 4 6 8 10 12 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Proba 4 Proba 5 Proba 6 Proba 7 Proba 8 Proba 9 Proba 1 Proba 11 Proba 12 Proba 13 Proba 14 Proba 15 Proba 16 Proba 17 Proba 18 Proba 19 Proba 20 Proba 21 Proba 22 Proba 23 Proba 24 Proba 25 Proba 26 Proba 27 Proba 28 Proba 29 Proba 30 Proba 31 Proba 32 Proba 33 Proba 34 Proba 35 Proba 36 Proba 37

Proba 38 Proba 39 Probe biscuii Concentraia n acrilamid (mg/kg Fig. VIII.4. Concentraiile de acrilamid n probele de biscuii 15 0,91 1,55 1,06 0,86 1,84 1,32 0,17 0 0,77 0,12 0 0,67 3,24 1,57 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Probe pop-corn Concentraia de acrilamid (mg/kg) Fig. VIII.5. Concentraia de acrilamid n probele de pop - corn Diferena de valori pe categorie de produs se explic att prin coninutului superior n asparagin i zaharuri reductoare al probelor de cartofi n comparaie cu cerealele, dar i prin parametrii procesului culinar specific obinerii fiecrui produs alimentar (prjire n ulei, n cazul chips-urilor i al cartofilor prjii; prjire n cazul pinii prjite i al biscuiilor; microunde n cazul probelor de pop-corn) (80). Concentraiile superioare de acrilamid determinate n probele de cartofi comparativ cu probele de chips-uri se pot explica fie prin diferena dintre materiile prime privind coninutul n precursori ai acrilamidei, fie prin tratarea probelor de chips-uri naintea procesului de prelucrare termic, cu condimente avnd proprieti antioxidante, cu un rezultat inhibitor asupra procesului de formare al acrilamidei (57, 79, 80). Variaia concentraiilor de acrilamid n cazul produselor pe baz de cereale (pine prjit, biscuii, pop-corn) poate avea drept

cauz, pe lng variaia precursorilor n materiile prime, diferenele din cadrul procesului culinar aplicat: umiditate, timp i temperatur de prjire, intervenia microundelor, utilizarea ndulcitorilor sau a altor ingrediente cu coninut bogat n zaharuri, utilizarea aditivilor precum acidul citric, acidul ascorbic, srurile de sodiu i potasiu (80). 16 CAPITOLUL IX CORELAIA DINTRE CONINUTUL N ZAHR SOLUBIL I NIVELUL DE ACRILAMID Capitolul prezent i propune corelarea concentraiei acrilamidei din preparate culinare precum cartofi prjii i pop-corn cu nivelurile de zahr direct reductor i zahr total solubil din materia prim neprelucrat termic (cartofi, porumb). IX.1 Determinarea concentraiei de zahr direct reductor i zahr total solubil prin metoda Luff-Schoorl Probele analizate n vederea evalurii coninutului n zahr direct reductor, respectiv zahr total solubil prin metoda LuffSchoorl sunt reprezentate de probe de cartofi i porumb pentru popcorn, procurate din reeaua comercial a judeului Iai. Rezultatele evideniaz faptul c probele de cartofi conin cantiti superioare de zahr direct reductor (valoare medie pentru zahr direct reductor de 1,2310 mg % glucoz), n comparaie cu probele de porumb pentru pop-corn (0,1345 mg % glucoz), fapt susinut experimental de cercetrile de specialitate (81, 82) (fig. IX.1). Media valorilor determinate experimental pentru coninutul n zahr total solubil urmeaz aceeai variaie, cu diferene mai subtile ns (2,6981 mg % glucoz pentru probele de porumb i 3,4958 mg % glucoz pentru probele de cartofi) (fig. IX.2). 0,376 1,37571,5344 0,1517 0,0713 0,1627 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Coninutul n ZDR (m g glucoz) Cartofi Porumb pop-corn Proba 1 Proba 2 Proba 3 Fig. IX.1. Coninutul n zahr direct reductor al probelor de cartofi

i porumb 17 2,6953 4,2247 3,5675 4,007 0,6778 3,4096 0 1 2 3 4 5 Coninutul n ZTS (mg glucoz) Cartofi Porumb pop-corn Proba 1 Proba 2 Proba 3 Fig. IX.2. Coninutul n zahr total solubil al probelor de cartofi i porumb IX.2 Determinarea concentraiei de acrilamid din produsele alimentare Probele analizate prin metoda gaz cromatografic n vederea decelrii acrilamidei sunt reprezentate de probe de cartofi prjii i pop-corn, obinute prin prelucrarea culinar a probelor de cartofi i porumb pentru pop-corn, al cror coninut n zahr direct reductor i zahr total solubil a fost analizat anterior. Experimentele au fost efectuate pe un gaz cromatograf Agilent Technologies cu detector de ionizare n flacr, folosind condiiile cromatografice prezentate n capitolul VII. n urma analizei comparative a concentraiilor de acrilamid din cele dou categorii de alimente, putem observa c cele mai ridicate concentraii de toxic se gsesc n probele de cartofi prjii (concentraie medie de 10,5078 mg acrilamid/kg prob cartofi prjii), fiind urmate de probele de pop-corn (2,6981 mg acrilamid/kg prob pop-corn) (fig. IX.3). Putem observa, de asemenea, existena corelaiei ntre coninutul de zahr direct reductor, respectiv de zahr total solubil din probele de cartofi i concentraia de acrilamid din probele de cartofi prjii, obinute prin prelucrarea termic a cartofilor analizai (fig. IX.4). 18 6,51 12,08 12,94 0,88 0,58 1

0 2 4 6 8 10 12 14 Coninutul n acrilamid (mg/kg) Cartofi Porumb pop-corn Proba 1 Proba 2 Proba 3 Fig. IX.3. Coninutul n acrilamid al probelor de cartofi prjii i pop-corn Astfel, pentru proba 1, avnd coninutul cel mai redus n zahr direct reductor (0,376 mg % glucoz), se obine cea mai sczut concentraie de acrilamid (6,51 mg/kg produs). Un nivel mai ridicat al zahrului direct reductor pentru proba 2 (1,3757 mg % glucoz) conduce, de asemenea, la concentraii superioare de acrilamid (12,08 mg/kg produs). Pentru proba 3, ce deine valoarea maxim privind coninutul n zahr direct reductor (1,5344 mg % glucoz), se obine concentraia maxim de acrilamid (12,94 mg/kg produs). Se observ i n cazul probelor de porumb pentru pop-corn, dependena concentraiei de acrilamid de coninutul n zahr direct reductor i zahr total solubil (fig. IX.5). 1,5344 6,51 12,94 0,376 1,3757 12,08 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Coninutul n zahr direct reductor (mg glucoz) Concentraia de acrilamid (mg/kg) ZDR ACR Fig. IX.4. Evoluia concentraiei de acrilamid n probele de cartofi

prjii n funcie de coninutul n ZDR al materiei prime 19 0,1627 0,88 0,0713 0,1517 0,58 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Proba 1 Proba 2 Proba 3 Coninut n zahr direct reductor (mg glucoz) Concentraia de acrilamid (mg/kg produs) ZDR ACR Fig. IX.5. Evoluia concentraiei de acrilamid n probele de popcorn n funcie coninutul n ZDR al materiei prime IX.3 Concluzii Se observ variaia nivelurilor de zahr direct reductor i zahr total solubil n cadrul materiilor prime analizate (cartofi, porumb pentru pop-corn), pentru aceeai prob, dependent de arja de provenien. Variaia nivelurilor de zahr direct reductor i zahr total solubil se regsete i n cadrul aceluiai produs, pentru probe diferite. Se observ dependena concentraiei de acrilamid de coninutul n zahr direct reductor i zahr total solubil, pentru toate cele trei probe analizate. n urma analizei comparative a concentraiilor de acrilamid din cele dou categorii de alimente, putem observa c cele mai ridicate concentraii de toxic se gsesc n probele de cartofi prjii, fiind urmate de probele de pop-corn. 20 CAPITOLUL X INFLUENA PROCESULUI CULINAR ASUPRA CONINUTULUI N ACRILAMID - STUDIU COMPARATIV Capitolul X al tezei de doctorat i propune: evaluarea influenei timpului, respectiv a temperaturii de prelucrare culinar asupra concentraiei de acrilamid format n probe de pine feliat supuse procesului de prelucrare termic prin prjire. studiul experimental privind influena soiurilor de cartofi i implicaiile modului de prelucrare culinar asupra coninutului n

acrilamid. X.1 Implicaiile intervalului de prelucrare culinar i a temperaturii procesului culinar n procesul de formare al acrilamidei Probele analizate prin metoda gaz cromatografic prezentat n capitolul VII n vederea decelrii amidei toxice sunt reprezentate de trei probe de pine feliat: o prob de pine feliat alb (1), o prob de pine integral (2) i o prob de pine feliat Graham (3). Pentru fiecare tip de pine feliat, s-au luat n lucru cte trei probe (1a, 1b, 1c; 2a, 2b, 2c; 3a, 3b, 3c), rezultnd, n final, nou probe. Astfel, rezultatele vor reprezenta media a trei determinri. Probele au fost procurate din reeaua comercial a judeului Iai. Fiecare din cele nou probe au fost prelucrate termic prin prjire astfel: 0 - pine feliat neprjit, 1- pine feliat prjit 1 minut, 3- pine feliat prjit 3 minute, 5- pine feliat prjit 5 minute. Rezultatele denot faptul c nivelul acrilamidei n toate cele 3 probe de pine feliat neprjit sunt semnificativ sczute, fiind situate sub limita de cuantificare a metodei. De asemenea, rezultatele pun n eviden o cretere a nivelului de acrilamid n probele de pine prjit dependent de timpul de prelucrare termic i, implicit, de temperatura procesului de prjire, dependen ilustrat n figura X.1. 21 00 0,391 0 0,252 0,329 0,461 0,278 0,567 0,379 0,57 0,474 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1234 Probe pine feliat prjite pentru intervale diferite de timp: 1. pine feliat neprjit; 2. pine feliat prjit 1 minut; 3. pine feliat prjit 3 minute; 4. pine feliat prjit 5 minute. Concentraia n acrilamid (mg/kg Fig.X.1. Concentraia n acrilamid a probelor de pine feliat prjite

Valorile maxime privind concentraia de acrilamid n probele de pine feliat prjit s-au obinut n cazul probei 3 (0,379 mg/kg), pine Graham, ce conine n compoziia sa tre de gru. Experimental, a fost demonstrat faptul c utilizarea finii cu grad mic de extracie, prin coninutul sczut de asparagin, conduce la obinerea unor produse de panificaie cu un coninut redus de acrilamid. Spre deosebire de aceasta, trele conin concentraia cea mai ridicat de asparagin i, prin urmare, va conduce, n urma procesului de prelucrare termic, la un coninut maxim al amidei toxice (81). X.2 Influena modului de prelucrare culinar asupra coninutului n acrilamid Probele analizate prin metoda gaz cromatografic n vederea determinrii cantitative a acrilamidei sunt reprezentate de trei soiuri diferite de cartofi timpurii (Solanum tuberosum Ostara, Solanum tuberosum Desiree, Solanum tuberosum Sante). Experimentele au fost efectuate pe un gaz cromatograf Agilent Technologies cu detector de ionizare n flacr, folosind condiiile cromatografice prezentate n capitolul VII. 22 Rezultatele demonstreaz faptul c nivelul acrilamidei n produsele alimentare pe baz de cartofi variaz dependent de soiul de cartof utilizat n procesul de prelucrare culinar, datele obinute fiind n concordan cu datele din literatur (83, 84). Astfel, se observ c valoarea cea mai ridicat privind concentraia n acrilamid s-a obinut pentru proba 3 - Solanum tuberosum Sante, urmat de proba 2 - Solanum tuberosum Desiree, concentraiile cele mai reduse obinndu-se pentru proba 1 - Solanum tuberosum Ostara. Rezultatele demonstreaz, de asemenea, variaia coninutului n acrilamid funcie de procedeul culinar aplicat. Astfel, valorile cele mai ridicate pentru acrilamid s-au obinut pentru cartofii prjii n ulei (30,95 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Ostara, 31,40 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Desiree, 31,76 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Sante). Valori mai sczute s-au obinut n cazul cartofilor copi la cuptorul clasic (30,10 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Ostara, 31,40 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Desiree, 31,76 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Sante). Valorile cele mai reduse au fost determinate n cazul cartofilor prelucrai termic prin prjire n abur (24,15 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Ostara, 27,12 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Desiree i 27,15 mg acrilamid/kg pentru Solanum tuberosum Sante). X.3 Concluzii Nivelul acrilamidei n toate cele 3 probe de pine feliat neprjit sunt semnificativ reduse, fiind situate sub limita de cuantificare a metodei. Rezultatele evideniaz o cretere a concentraiei de

acrilamid n probele de pine prjit dependent de timpul de prelucrare termic i, implicit, de temperatura procesului de prjire. Valorile maxime privind concentraia de amid toxic n probele de pine feliat prjit s-au obinut n cazul probei 3, pine Graham, ce conine n compoziia sa tre de gru. Rezultatele demonstreaz faptul c nivelul acrilamidei n produsele alimentare pe baz de cartofi variaz dependent de soiul de cartof utilizat n procesul de prelucrare culinar. Rezultatele relev variaia coninutului n acrilamid funcie de procedeul culinar aplicat. Astfel, valorile cele mai ridicate pentru 23 acrilamid s-au obinut pentru cartofii prjii n ulei, valori mai sczute s-au obinut n cazul cartofilor copi la cuptorul clasic, iar valorile cele mai reduse au fost determinate n cazul cartofilor prelucrai termic prin prjire n abur. CAPITOLUL XI STUDIUL MODIFICRILOR BIOCHIMICE, HEMATOLOGICE I HISTOPATOLOGICE N INTOXICAA CRONIC CU ACRILAMID Prezentul capitol i propune ca obiectiv monitorizarea modificrilor biochimice, hematologice i histopatologice ulterior aportului de acrilamid prin consum de alimente prelucrate termic (cartofi prjii i pine prjit) la animalele de laborator, respectiv prin consumul ad libitum al unei soluii de acrilamid 0,1 g/L (limita maxim admisibil privind prezena acrilamidei n apa potabil, conform legislaiei Uniunii Europene). XI.1 Modelul experimental Toate procedeele experimentale realizate n acest studiu au fost n strict concordan cu reglementrile etice internaionale i au primit aprobarea Comisiei de Etic a Universitii de Medicin i Farmacie Gr.T. Popa, Iai. Experimentul s-a desfurat pe 4 loturi de obolani (6 obolani pe lot), linia Wistar, cu mase ponderale cuprinse ntre 180 220 g, dup modelul experimental din tabelul XI.1 Experimentul s-a derulat pe perioada a 90 de zile. La finalul experimentului, animalele de experien au fost anesteziate cu ketamin (i.p., 75mg/kg). La constatarea absenei semnelor vitale (micri respiratorii, btile cordului, reflexe), s-au recoltat probe de snge din plexul retroorbitar n scopul efecturii analizelor biochimice i hematologice. Ulterior, animalele au fost sacrificate pentru recoltarea fragmentelor de organe: creier, ficat, rinichi, pancreas, splin, considerate posibile organe-int. 24 Tabel XI.1. Modelul experimental referitor la aportul de alimente bogate in acrilamid Loturi Denumire Acrilamid soluie 0,1g/l Cartofi

prjii Pine prjit Lot 1 Lot de referin - - Lot 2 Lot de control Ad libitum - Lot 3 Lot CP - Ad libitum Lot 4 Lot PP - - Ad libitum XI.2 Interpretarea statistic n interpretarea statistic a datelor au fost utilizate o serie de metode statistice de analiz a factorilor de variabilitate n experimentul biologic (ANOVA). Datele statistice au fost prelucrate de programul StatsDirect versiunea 2.7.2 (2008). Rezultatele au fost exprimate ca medie deviaie standard. A fost considerat semnificativ valoarea p<0,05. XI.3 Investigaia biochimic Determinrile biochimice s-au efectuat sub forma unei baterii de teste care urmeaz cinci direcii principale: a) Testarea integritii celulare n sensul decelrii modificrii patologice a permeabilitii membranei hepatocitului; b) Controlul capacitii de sintez a ficatului n sensul depistrii insuficienei funciei proteosintetice; c) Depistarea unei eventuale inducii enzimatice sau a unui virtual fenomen de oncogenez; d) Evaluarea stresului oxidativ; e) Evaluarea funciei de detoxifiere a ficatului. Determinrile cantitative ale parametrilor biochimici vizai de experimentul n curs s-au efectuat pe analizorul semiautomat EOS 880 PLUS n sistem deschis. a) Testarea integritii celulare Determinarea aspartat aminotransferazei Evoluia AST evideniaz creteri semnificative ale activitii sale n serul animalelor ce au fost tratate cu soluie de acrilamid, cartofi prjii i pine prjit, ceea ce sugereaz apariia unor leziuni la nivelul membranei hepatocitului; activitatea cea mai crescut a 25 enzimei se nregistreaz n serul animalelor hrnite cu cartofi prjii (fig. XI.1). Determinarea alanil aminotransferazei Activitatea ALT nregistrez o ascensiune semnificativ pentru lotul ce a consumat acrilamid n apa de but, pentru loturile hrnite cu pine prjit, respectiv cartofi prjii, valoarea cea mai crescut fiind atins de lotul hrnit cu cartofi prjii (fig. XI.2). 35,526 69,908 54,284 84,02 63,47

49,98 65,19 65,32 33,16 75,612 80,63 41,16 3,2831 6,2557 7,7026 5,6686 0,0895 0,1019 0,0924 0,1044 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Loturi experimentale Activitatea aspartat aminotransferazei Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.1. Activitatea aspartat aminotransferazei Determinarea lactat dehidrogenazei Activitatea lactat dehidrogenazei diminueaz spectaculos pentru loturile hrnite cu cartofi prjii i pine prjit, necorelnduse cu ceilali doi indicatori de citoliz hepatic (fig. XI.3). b) Controlul capacitii de sintez a ficatului Determinarea proteinelor totale Studiul proteinemiei totale pentru loturile din experiment evideniaz o scdere semnificativ pentru lotul de control i pentru lotul hrnit cu pine prjit, scdere ce se poate asocia cu o deprimare a proteosintezei hepatice la aceste loturi (fig. XI.4). Determinarea albuminelor Variaia albuminemiei loturilor din experiment dei pare neconcludent pentru evaluarea funciei proteosintetice a ficatului, poate fi corelat cu existena unui sindrom nefrotic. 26 23,7 40,34 27,986 46,276 60,906 60,592 35,51 73,89 54,77 59,63 63 48,21

4,70806 3,7842 8,1433 8,3831 0,1682 0,1337 0,1384 0,0818 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Loturi experimentale Activitatea alanin aminotransferazei Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.2. Evoluia alanil aminotransferazei 5,5 5,22 3,39 3,63 6,692 6,2 4,412 4,438 7,99 7,19 5,32 5,61 1,0976 0,9215 0,6903 0,7336 0,164 0,1486 0,1565 0,1653 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Activitatea lactat dehidrogenazei Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.3. Activitatea lactat dehidrogenazei Determinarea colinesterazei Evoluia colinesterazei surprinde prin apariia de valori crescute la animalele tratate cu acrilamid, fie sub form de soluie apoas fie sub form de alimente tratate termic, cretere ce nu poate fi corelat cu deprimarea funciei proteosintetice a ficatului, dar care se coreleaz cu existena unui sindrom nefrotic, fenomen semnalat n

cazul intoxicaiei cu acrilamid. 27 c) Depistarea unei eventuale inducii enzimatice sau a unui virtual fenomen de oncogenez Determinarea activitii -glutamil transferazei Activitatea gamma-glutamil transpeptidazei nregistreaz o cretere pentru lotul de control, ceea ce se coreleaz cu evoluia indicatorilor de citoliz hepatic la acest lot. Activitatea enzimei atinge apogeul valoric n serul animalelor hrnite cu cartofi prjii, aceast accentuare a activitii enzimei fiind caracteristic leziunilor cronice ale hepatocitului de etiologie toxic (fig. XI.5). 8,7412 7,7602 8,637 7,9254 7,613 8,503 7,322 8,616 8,019 8,703 8,066 8,898 0,1089 0,2781 0,0873 0,1749 0,0125 0,03584 0,0101 0,0221 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Loturi experimentale Valoarea proteinemiei Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.4. Concentraiile serice de proteine totale (g/dL) d) Evaluarea stresului oxidativ Determinarea activitii catalazei serice Variaiile observate n analiza stresului oxidativ prin prisma catalazei, dei nesemnificative din punct de vedere statistic, denot implicarea sa n inhibarea speciilor reactive ale oxigenului prin reducerea concentraiei sale plasmatice pentru loturile expuse aportului cronic de acrilamid, fie prin consumul soluiei apoase de toxic, fie prin consumul de alimente cu un coninut bogat n amida

acrilic (fig. XI.6). 28 8,3 8,85 10,83 9,66 11,666 12,066 10,86 10,762 14,24 12,1 9,78 14,86 1,3969 2,514 1,8527 1,054 0,1446 0,2155 0,1535 0,0979 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Activitatea gama glutamil transpeptidazei Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.5. Activitatea -glutamil transpeptidazei Determinarea superoxid dismutazei Cel de al doilea parametru evaluator al stresului oxidativ, superoxid dismutaza, metaloenzim ce folosete ca substrat radicalul supeoxid (O2 .-), nregistreaz modificri valorice revelatoare pentru implicaiile sale n eradicarea stresului oxidativ cu pn la 27-30 uniti pentru toate loturile experimentale (fig. XI.7). 531,625 496,2 495,64 509,24 593,6 493,9 483,01 478 498,16 522 521 513,5 10,799 14,9315 8,5492 46,7711 0,0218 0,0301 0,0168 0,088 0 100 200

300 400 500 600 700 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Loturi experimentale Activitatea catalazei (U/L) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.6. Activitatea catalazei (U/L)29 362,18 353,2 349,7 415,63 388,61 388,84 383,12 409,5 421 420 409 421,7 28,01 0,0120247 0,050479376 0,062615638 4,9979 19,617 24,3473 0,073110962 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Activitatea superoxid dismutazei (U/mL) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.7. Activitatea superoxid dismutazei (U/L) Determinarea gruprilor sulfhidrice libere Analiza valorilor gruprilor sulfhidrice libere susin experimental dublul rol al glutationului (cel de antioxidant i detoxifiant), prin reducerea marcant a valorilor plasmatice, n special pentru lotul expus aportului cronic de acrilamid prin consumul soluiei apoase de toxic alimentar (fig. XI.8). 210 282,78 212,02 299 295,7 263,5 224 195 254,23 254,78

295 225 32,687 0,052834808 0,09798706 0,128293423 24,9116 11,2019 11,1065 0 0,039276716 50 100 150 200 250 300 350 Lot ref Lot control Lot CP Lot PP Loturi experimentale Grupari sulfhidrice libere Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XI.8. Nivelul plasmatic al gruprilor sulfhidrice libere XI.4 Investigarea hematologic Determinrile hematologice au urmrit modificrile aprute la nivelul urmtorilor parametri: numrul de eritrocite, hematocritul, 30 hemoglobina, concentraia medie de hemoglobin, hemoglobina eritrocitar medie, volumul eritrocitar mediu, lrgimea distribuiei eritrocitare, numrul de trombocite, volumul trombocitar mediu, limfocite, monocite, numrul de leucocite, neutrofile. n comparaie cu valorile lotului de referin, celelalte 3 loturi experimentale au prezentat o scdere semnificativ din punct de vedere statistic a numrului de eritrocite, a hemoglobinei i a hematocritului. Modificrile valorilor volumului mediu eritrocitar sunt semnificative statistic doar pentru loturile expuse aportului de acrilamid prin consum de cartofi prjii i pine prjit. Creterea gradului de anizocitoz pentru loturile expuse aportului de acrilamid este semnificativ din punct de vedere statistic (p<0,05) i este in corelaie cu valoarea volumului eritrocitar mediu, ntrind posibilitatea existenei unei anemii microcitare. n ceea ce privete numrul de trombocite, singurul lot care prezint o scdere semnificativ din punct de vedere statistic este lotul de control, cruia i s-a administrat ad libitum soluia de acrilamid 0,1 g/L. Valori superioare ale numrului de leucocite n comparaie cu lotul de referin s-au obinut pentru lotul de control (p<0,05). XI.5 Investigaia histopatologic Examenul histopatologic a urmrit evidenierea unor modificri morfologice consecutive administrrii unei diete cu un coninut bogat n acrilamid, respectiv consecutive administrrii unei

soluii apoase de acrilamid 0,1g/L la nivelul creierului, ficatului, rinichiului, pancreasului i splinei. Rezultatele examenului histopatologic la nivelul creierului (fig. XI.9, fig. XI.10), ficatului (fig. XI.11, fig. XI.12), rinichiului (fig. XI.13, fig. XI.14) i pancreasului (fig. XI.15, fig. XI.16) evideniaz toxicitatea acrilamidei administrate sub forma soluiei apoase 0,1 g/L timp de 90 de zile, excepie fcnd splina, la nivelul creia micrografiile nu relev modificri morfologice. Aportul de acrilamid n urma consumului alimentelor cu un coninut bogat n aceast nox alimentar (cartofi prjii i pine prjit) nu este att de semnificativ nct s produc modificri histopatologice la nivelul organelor examinate. 31 Fig. XI.9. Creier lot ref (HEx10) Fig. XI.10. Creier lot control (HEx10) Fig. XI.11. Ficat - lot ref (HEx10) Fig. XI.12. Ficat lot control (HEx10) Fig.XI.13. Rinichi - lot ref (HEx10) Fig. XI.14. Rinichi lot control(HEx10) Fig. XI.15. Pancreas - lot ref (HEx10) Fig. XI.16. Pancreas lot control (HEx10) 32 XI.6 Concluzii Aciunea hepatotoxic a acrilamidei este susinut de rezultatele investigaiei biochimice prin creterea lizei celulelor hepatice i scdere funciei proteosintetice a ficatului, dar i de modificrile histopatologice observate la nivelul acestui organ int. Existena unui posibil sindrom nefrotic este sugerat att de variaiile albuminemiei, dar i de rezultatele histopatologice la nivelul rinichiului. Evaluarea stresului oxidativ prin prisma catalazei, superoxid dismutazei i gruprilor tiolice libere denot implicarea acrilamidei, posibil n special prin intermediul metabolitului su epoxidic, glicidamida, n creterea speciilor reactive ale oxigenului. n ceea ce privete parametrii hematologici, intoxicaia cronic cu acrilamid conduce la scderea numrului de eritrocite, a valorilor hemoglobinei, hematocritului i trombocitelor, precum i creterea formulei leucocitare. CAPITOLUL XII EVALUAREA POTENIALULUI PROTECTOR AL ACIDULUI ASCORBIC N INTOXICAIA SUBACUT CU ACRILAMID LA ANIMALELE DE LABORATOR Capitolul XII i propune ca obiective: evaluarea modificrilor biochimice survenite n intoxicaia provocat de administrarea unei doze de 50 mg/kg mas corporal, respectiv 100 mg/kg mas corporal de acrilamid la fiecare dou zile la animalele de laborator; aprecierea posibilului efect protector al vitaminei C pe fundalul intoxicaiei subacute cu acrilamid la cele dou doze. XII.1 Model experimental Toate procedeele experimentale realizate n acest studiu au fost n strict concordan cu reglementrile etice internaionale i au primit aprobarea Comisiei de Etic a Universitii de Medicin i

Farmacie Gr.T. Popa, Iai. 33 Experimentul a fost realizat pe 5 loturi de obolani masculi (5 animale pe lot), linia Wistar, cu mase corporale cuprinse ntre 240 g i 390 g (tabel XII.1). Experimentul a fost derulat pe perioada a dou sptmni pentru loturile 4 i 5 i pentru trei sptmni pentru loturile 1, 2 i 3. Pe toat perioada experimentului s-au urmrit evoluia greutii corporale a animalelor i alterrile comportamentului animal. La sfritul experimentului, s-a recurs la anestezia obolanilor cu ketamin (75mg/kg i.p.). n urma constatrii absenei semnelor vitale (micri respiratorii, btile cordului, reflexe) s-au recoltat probe de snge din plexul retroorbitar n scopul efecturii analizelor biochimice. XII.2 Investigaia biochimic Determinrile biochimice s-au efectuat sub forma unei baterii de teste care urmeaz cinci direcii principale: a) Testarea integritii celulare n sensul decelrii modificrii patologice a permeabilitii membranei hepatocitului: - activitatea aspartat-aminotransferazei (AST sau GOT); - activitatea alanin-aminotransferazei (ALT sau GPT); - activitatea lactat-dehidrogenazei (LDH); - testul de Ritis (AST /GPT sau GOT /ALT). Tabel XII.1. Model experimental Loturi Denumire ACR (50 mg/kg) ACR (100 mg/kg) Acid ascorbic (100 mg/kg) Lot 1 Lot ref - - Lot 2 Lot ACR 50 + - Lot 3 Lot ACR 50/C 100 + - + Lot 4 Lot ACR 100 - + Lot 5 Lot ACR 100/C 100 - + + Legend: Lot ref = lot de referin; ACR = acrilamid; ACR 50 = acrilamid n doz per 48 ore de 50 mg/kg (gavaj gastric soluie apoas acrilamid 12,5 g/L); ACR 100 = acrilamid n doz per 48 ore de 100 mg/kg (gavaj gastric soluie apoas acrilamid 12,5 g/L); C 100 = acid ascorbic n doz per 48 ore de 100 mg/kg (gavaj gastric soluie apoas 25 g/L cu 15 minute nainte de intoxicaia cu acrilamid). 34 b) Controlul capacitii de sintez a ficatului n sensul depistrii insuficienei funciei proteosintetice: - determinarea cantitativ a azotului ureic; - determinarea activitii colinesterazei serice; c) Depistarea unei eventuale inducii enzimatice sau a unui virtual

fenomen de oncogenez: - determinarea activitii -glutamil transferazei (GGT); - determinarea calitativ a albuminei Bence-Jones; d) Evaluarea stresului oxidativ: - determinarea activitii catalazei serice (CAT); - determinarea activitii superoxid dismutazei serice (SOD); e) Evaluarea funciei de detoxifiere a ficatului: - determinarea cantitativ a gruprilor sulfhidril libere - dozarea acidului ascorbic din snge. Determinrile cantitative ale parametrilor biochimici vizai n prezentul capitol s-au efectuat pe analizorul semiautomat EOS 880 PLUS n sistem deschis, dup principiile enunate n capitolul XI. a) Testarea integritii celulare Determinarea aspartat-aminotransferazei Variaia activitii AST evideniaz accenturi semnificative pentru loturile de animale care au fost tratate cu 50 mg/kg i 100mg/kg acrilamid; aceste hiperenzinemii constituie dovada lezrii membranei hepatocitului i migrarea enzimei n spaiul intercelular. Analiza valoric a activitii acestei enzime pentru loturile care au fost protejate cu acid ascorbic evideniaz o atenuare semnificativ a impactului dintre forma agresiv/toxic a acrilamidei i membrana hepatocitului, atenuare care devine deosebit de evident pentru lotul tratat cu doza de 100 mg/kg acrilamid (fig. XII.1). Determinarea alanil aminotransferazei Evoluia ALT nregistrez un traseu asemntor celui obinut n cazul aspartat aminotransferazei, cu o exacerbare a activitii enzimei pentru loturile intoxicate cu acrilamid, mai ales pentru lotul tratat cu 100 mg/kg acrilamid, lot la care dimensiunea supradenivelrii fa de lotul martor depete 11 uniti. Valori semnificativ crescute fa de cele ale lotului de referin i uor sczute fa de ale loturilor tratate exclusiv cu acrilamid sugereaz35 o palid aciune protectoare a acidului ascorbic prin prisma alanil aminotransferazei (fig. XII.2). 42,25 44,16 57,65 51,996 48,434 61,21 59,76 45,19 58,16 53,382 55,29 62,986 51,83 68,55 60,17 8,0432 0,1507 0,1098 0,0731 0,061

5,7104 4,6042 2,9523 2,2464 0,039 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C 100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C 100 Loturi experimentale Activitatea aspartat aminotransferazei (UI) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XII.1. Evoluia activitii aspartat aminotransferazei Determinarea lactat dehidrogenazei Variaia lactat dehidrogenazei evideniaz aciunea toxic/membranar a acrilamidei, att la doza de 50 mg/kg mas corporal ct i la doza dubl. Cercetnd evoluia LDH pentru loturile beneficiare ale tratamentului cu acid ascorbic, se poate sublinia intervenia antitoxic a vitaminei pentru lotul intoxicat cu doza de 50 mg/kg, dar nu i pentru lotul tratat cu doz dubl de acrilamid (fig. XII.3). 43,724 55,19 51,852 53,662 79,12 39,66 49,19 60,66 45,09 49,66 68,53 48,63 58,61 55,14 59,58 0,0775 0,123 0,04 0,1134 0,0672 3,3869 6,7872 2,0754 7,7685 3,6077 0 10 20 30 40 50 60

70 80 90 Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C 100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C 100 Loturi experimentale Activitatea alanin aminotransferazei (UI) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XII.2. Activitatea alanil aminotransferazei 36 b) Controlul capacitii de sintez a ficatului Determinarea cantitativ a azotului ureic Cuantificarea azotului ureic din sngele animalelor nu furnizeaz informaii despre capacitatea funcional a ficatului i nici despre potenialul antitoxic al acidului ascorbic, dar evideniaz creteri semnificative ale azotemiei loturilor tratate cu doz dublat de amid acrilic ce se pot asocia cu intensificri ale catabolismului proteic sau cu afectri ale excreiei ureei, fenomene ce implic toxicodinamia acrilamidei. Determinarea colinesterazei Studiul valorilor activitii colinesterazei evideniaz oscilaii care, dei nu au un grad de semnificaie ridicat, sunt deosebit de concludente n ansamblul experimentului ce vizeaz rolul pozitiv al acidului ascorbic n intoxicaia cu acrilamid. Scderea semnificativ a activitii colinesterazei din serul animalelor tratate cu doza de 100 mg/kg corp poate fi interpretat ca fiind imaginea unei afectri semnificative a funciei sintetizatoare a hepatocitului. 20,694 23 29,35 16,68 18,68 20,19 19,5 19,01 23,708 20,756 22,564 23,336 25,01 23 25,7 2,3907 2,3338 4,3759 0,1155 0,1034 0,076 0,0889 0,1846 1,5778 2,0752 0 5 10

15 20 25 30 35 Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C 100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C 100 Loturi experimentale Activitatea lactat dehidrogenazei (mol/ml) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XII.3. Evoluia lactat dehidrogenazei c) Depistarea unei eventuale inducii enzimatice sau a unui virtual fenomen de oncogenez37 Determinarea gamma-glutamil transpeptidazei Oscilaia valoric a GGT pentru loturile protejate prin aport de vitamina C scoate n eviden atenuri semnificative ale activitii enzimei, aceste diminuri ale GGT ilustrnd existena unei certe aciuni antitoxice ale acestei vitamine hidrosolubile, cu implicaii majore n fenomenul de detoxifiere al organismului (fig. XII.4). d) Evaluarea stresului oxidativ Determinarea activitii catalazei serice Variaia catalazei denot certa sa implicare n reaciile de neutralizare a speciilor reactive ale oxigenului, rspunztoare de apariia stresului oxidativ; aceast implicare este susinut de scderea activitii sale n serul loturilor intoxicate cu acrilamid i de ameliorarea activitii sale pentru loturile ce au beneficiat de protecia acidului ascorbic (fig. XII.5). Determinarea superoxid dismutazei Variaia activitii superoxid dismutazei pentru loturile din experiment confirm aciunea antitoxic/antioxidant a acidului ascorbic mpotriva atacului speciilor reactive ale oxigenului, specii chimice generatoare ale stresului oxidativ. 8,782 11,484 9,5 16,9 10,01 11,23 5,69 7,79 7,03 13,018 7,622 8,48

12,21 10,01 9,91 1,5036 2,2412 0,1331 0,1033 0,1973 0,1722 0,0973 1,1286 0,9076 1,1178 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Lot ref Lot ACR 50 Lot ACR 50/C 100 Lot ACR 100 Lot ACR 100/C 100 Loturi experimentale Activitatea gama-glutamil transpeptidazei (UI) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XII.4. Activitatea -glutamil transpeptidazei e) Evaluarea funciei de detoxifiere a ficatului Determinarea cantitativ a gruprilor sulfhidril libere Analiza comparativ a concentraiilor plasmatice de funcii sulfhidrice libere pentru loturile tratate exclusiv cu acrilamid38 conduce la scderi deosebit de semnificative, scderi ce susin ipoteza epuizrii gruprilor tiolice libere n urma atacului radicalilor epoxidici ai acrilamidei. 605,58 568,07 433,14 585,47 504,34 595,7 543,15 411 579,65 495,1 621,12 601,1 451,8 595,5 519 0,046 0,042

10,143 26,095 18,088 6,427 9,068 0,017 0,011 0,018 0 100 200 300 400 500 600 700 Lot ref Lot ACR 50mg/kg Lot ACR 100 mg/kg Lot ACR 50/C100 Lot ACR 100/C100 Loturi experimentale Activitatea catalazei serice (U/L) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XII.5. Activitatea catalazei serice Concentraiile plasmatice ale tiolilor liberi n cazul loturilor protejate prin pretratament cu acid ascorbic ating valori ce se apropie de valorile lotului de referin, ceea ce ilustreaz o ameliorare a potenialului detoxifiant al ficatului ce a beneficiat de efectul antitoxic/antitoxidant al vitaminei C. XII.3 Concluzii n consecin, activitatea hepatotoxic a acrilamidei este susinut nu doar de variaiile enzimelor de citoliz hepatic dar i de variaia colinesterazei, ceea ce sugereaz i o deprimare a funciei proteosintetice. Intervenia protectoare a acidului ascorbic se manifest evident asupra aspartat aminotransferazei, evoluia celorlalte enzime edificatoare pentru afectarea hepatic fiind mai puin influenat de aciunea vitaminei. De asemena, evaluarea stresului oxidativ denot implicarea amidei toxice n creterea concentraiei speciilor reactive ale oxigenului, cel mai probabil prin intermediul metabolitului su cu structur epoxidic, glicidamida. Aciunea benefic a acidului ascorbic se traduce prin ameliorarea marcant a stresului oxidativ. 39 CAPITOLUL XIII POTENIALUL PROTECTOR AL FTALIDELOR DIN APIUM GRAVEOLENS N INTOXICAIA CU ACRILAMID Prezentul capitol i propune urmtoarele obiective: aprecierea toxicitii acrilamidei prin determinarea modificrilor biochimice survenite la loturile de obolani n urma administrrii cronice de amid toxic; evaluarea potenialului antitoxic al ftalidelor prezente n uleiul volatil de Apium graveolens, precum i n soluiile extractive de Apii folium, Apii semen i Apii radix n intoxicaia cronic cu acrilamid.

XIII.1 Modelul experimental Modelul experimental (tabel XIII.1) descris n acest capitol a fost astfel conceput nct s confirme sau s infirme existena unei poteniale aciuni antitoxice a ftalidelor din uleiul volatil de elin (Apii aetheroleum) n intoxicaia cu acrilamid. Totodat, experimentul ncearc s evalueze potenialele antitoxice ale unor soluii extractive obinute din Apii folium, Apii radix i Apii semen. Experimentul derulat pe o perioad de 11 sptmni s-a finalizat cu recoltarea sngelui pentru explorarea biochimic. XIII.2 Investigaia biochimic Investigarea biochimic s-a desfurat sub forma unor baterii de teste ce sunt redate n tabelul XIII.2. a) Evaluarea indicatorilor de citoliz hepatic Determinarea aspartat aminotransferazei Evoluia AST n serul animalelor din experiment evideniaz o cretere semnificativ pentru lotul tratat exclusiv cu acrilamid, ceea ce sugereaz apariia lizei membranare. Variaia activitii aspartat aminotransferazei pentru loturile ce au beneficiat de protecie reliefeaz existena unui bun efect antitoxic al ftalidelor din Apii radix i un efect antitoxic moderat pentru principiile active din uleiul volatil, frunzele i seminele de Apii graveolens (fig. XIII.1, tabel XIII.3). n ceea ce privete ameliorarea agresrii hepatocitului de ctre amida acrilic, s-ar putea ierarhiza potenialul protector al fitopreparatelor testate astfel: soluie extractiv Apii radix > Apii 40 aetheroleum > soluie extractiv Apii semen soluie extractiv Apii folium. Tabel XIII.1. Modelul experimental pentru evaluarea aciunii antitoxice a ftalidelor din Apium graveolens Loturi Denumire ACR (g/kg)* Apii aeth (g/kg)** Apii folium Apii radix Apii semen Lot 1 Referin - - - - Lot 2 Control 25 - - - Lot 3 Lot aeth 25 10 - - Lot 4 Lot folium 25 - Ad libitum -Lot 5 Lot radix 25 - - Ad

libitum Lot 6 Lot semen 25 - - - Ad libitum ACR = acrilamid; * - administrare prin gavaj; **- administrare prin gavaj, ncorporat n lactoz Tabel XIII.2. Schema investigaiei biochimice BATERIE TESTE PARAMETRII TESTAI Aspartat aminotransferaza (ASAT sau AST) 1 Indicatori de citoliz hepatic Alanil aminotransferaza (ALAT sau ALT) Lactat dehidrogenaza (LDH) Colinesteraza (ChE) 2 Indicatori de proteosintez Proteine totale serice (PT) Albumine serice (ALB) 3 Markeri de inducie enzimatic - glutamil transpeptidaza (GGT) Catalaza (CAT) 4 Indicatori ai stresului oxidativ Superoxid dismutaza (SOD) Glutation peroxidaza (GSH-Px) 41 Determinarea alanil aminotransferazei Studiul evoluiei ALT atrage atenia prin creterea activitii enzimei pentru lotul tratat exclusiv cu acrilamid, confirmnd astfel existena unei certe leziuni la nivelul hepatocitului (fig. XIII.2, tabel XIII.3). Pentru loturile protejate cu Apii aetheroleum i soluii extractive de Apii semen, Apii radix i Apii folium se obin valori apropiate de cele ale lotului de referin (28,390 UI 3,143, 25,951 3,161, 30,319 3,160, respectiv 30,011 1,467), ceea ce constituie un argument favorabil n ceea ce privete protecia hepatocitului n faa agresiunii amidei acrilice. ncercarea de ierarhizare a potenialului antitoxic al fitopreparatelor pe baz de Apii graveolens n intoxicaia cu acrilamid prin prisma acestui indicator de citoliz hepatic s-ar putea schematiza astfel: soluie extractiv de Apii semen > soluie extractiv de Apii folium Apii aetheroleum > soluie extractiv de Apii radix. 34,620 45,013 38,161 39,150 41,020 30,340 32,550 23,901 33,906 30,990 31,996 35,312

31,292 39,537 35,897 33,532 35,896 38,112 2,881 4,222 2,285 3,455 4,357 4,244 0,136 0,107 0,065 0,096 0,130 0,080 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea aspartat aminotransferazei (UI) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.1. Activitatea aspartat aminotransferazei Determinarea lactat dehidrogenazei Oscilaia activitii LDH profileaz o exacerbare a activitii enzimei pentru lotul cruia i s-a administrat doza cronic de acrilamid, ceea ce sugereaz agresivitatea acrilamidei nu numai la nivel hepatic ci i la alte nivele (organe ce gzduiesc intracelular LDH). Variaia activitii LDH pentru loturile protejate cu 42 fitopreparatele pe baz de Apium graveolens este aproape liniar, valorile activitii enzimei oscilnd n jurul valorii lotului de referin (fig. XIII.3, tabel XIII.3). Rezultatele confirm intervenia pozitiv a ftalidelor din elin care acioneaz antitoxic, aciunea antitoxic a acestora putnd fi gradualizat astfel: soluie extractiv de Apii folium > soluie extractiv de Apii semen > soluie extractiv de Apii radix > Apii aetheroleum. 28,563 39,561 31,151 33,541 29,554 22,331 29,952 22,549 25,405 27,991 23,164

24,970 25,951 30,011 30,319 28,390 34,860 31,602 3,160 3,161 1,467 3,143 4,097 2,688 0,108 0,118 0,111 0,049 0,104 0,122 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea alanil aminotransferazei (UI) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.2. Variaia alanil aminotransferazei 6,667 15,999 6,559 6,510 6,458 6,021 5,941 5,755 6,129 15,751 5,997 6,358 7,725 6,911 6,971 7,121 16,323 7,052 0,378 0,833 0,416 0,207 0,489 0,351 0,062 0,013 0,075 0,055 0,128 0,059 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea lactat dehidrogenazei (mol/ml)

Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.3. Variaia valorilor lactat dehidrogenazei 43 b) Investigarea indicatorilor de proteosintez Determinarea colinesterazei Variaia colinesterazei prezint o curb aleatorie nesemnificativ pentru controlul capacitii proteosintetice a ficatului, dar care se coreleaz cu existena unui sindrom nefrotic (tabel XIII.3). Determinarea proteinelor totale serice Proteinemia manifest variaii ce scot n eviden deprimarea funciei proteosintetice a ficatului de ctre acrilamid i evideniaz intervenia benefic a ftalidelor din produsele vegetale, prevalent din Apii semen (fig. XIII.4, tabel XIII.3). Determinarea albuminelor Controlul albuminemiei confirm efectul antitoxic al ftalidelor din Apii semen i sugereaz o posibil corelare a hiperalbuminemiei lotului intoxicat cu acrilamid cu existena unui sindrom nefrotic (tabel XIII.3). c) Evaluarea markerilor de inducie enzimatic Determinarea -glutamil transpeptidazei Studiul dinamicii GGT reliefeaz o cretere semnificativ pentru lotul tratat cu doza cronic de acrilamid, cretere ce se poate corela fie cu existena unei grave afectri hepatice, fie cu existena unui fenomen de inducie enzimatic. Valoarea diminuat a activitii -glutamil transpeptidazei pentru loturile beneficiare a aportului exogen de ftalide reliefeaz efectul protector al acestora (fig. XIII.5, tabel XIII.4). d) Evaluarea stresului oxidativ Determinarea catalazei Evoluia activitii CAT dezvluie o supraproducie de radicali liberi pentru lotul de control, cruia i s-a administrat doar acrilamid, i o ameliorare a stresului oxidativ n urma administrrii de fitopreparate bogate n ftalide, ntre acestea impunndu-se printrun bun efect antitoxidant Apii semen (fig. XIII.6, tabel XIII.4). Determinarea superoxid dismutazei Variaia activitii SOD confirm producerea stresului oxidativ att pentru lotul intoxicat cu acrilamid, ct i pentru loturile tratate cu fitopreparate de Apium graveolens, nesusinnd 44 efectul antitoxic al acestora, ca in cazul altor parametri (fig. XIII.7, tabel XIII.4). Determinarea glutation peroxidazei Studiul dinamicii glutation peroxidazei surprinde prin creterea activitii enzimei pentru lotul intoxicat, cretere ce s-ar putea justifica prin implicarea enzimei ntr-un proces de inducie enzimatic, fenomen semnalat n pulmonii i rinichii fumtorilor (fig. XIII.8, tabel XIII.4).

8,054 8,913 8,652 8,659 8,517 7,507 6,919 7,458 7,011 7,023 6,028 8,1836 8,0732 7,7044 7,7514 7,8912 7,2176 8,669 0,4985 0,759 0,706 0,5939 0,7395 0,4121 0 0,0609 0,1052 0,0895 0,0766 0,096 0,051 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Concentraiile serice de proteine totale (g/dL) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.4. Concentraia proteinelor totale serice 6,843 8,034 8,555 8,303 8,125 8,123 5,055 5,579 5,45 5,832 5,551 5,653 7,5248 7,0256 6,9348 6,8598 6,9316 9,435 1,3985 0,9763 1,2115 1,6784 1,4019 0,9501 0,2018 0,1388 0,2231 0,1423 1,2115 1,4019 0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea -glutamil transpeptidazei (UI) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.5. Activitatea -glutamil transpeptidazei 45 625,9 512,1 502,3 615,1 599,1 639,9 591,9 427,9 533,7 417,9 411,8 549,2 593,84 495,1 570,05 464,6 468,258 591,76 33,312 79,3254 33,6276 38,8164 38,8094 37,7014 0,0656 0,0835 0,0805 0,059 0,1602 0,0561 0 100 200 300 400 500 600 700 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea catalazei serice (U/L) Minima Media Maxima DS DSR

Fig.XIII.6. Activitatea catalazei 355 335 367,8 360,91 442,7 400,262 459,9 411,8 461 466 398,9 430 418,432 420,252 424,444 383,9 421,16 449,5 38,9471 39,6451 38,4667 30,9087 37,9051 9,4842 0,0214 0,099 0,1002 0,0728 0,0906 0,0927 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea SOD (U/mL) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.7. Evoluia superoxid dismutazei 46 63,500 75,150 66,500 58,120 66,150 60,970 91,900 99,170 88,909 88,902 90,166 88,700 84,670 78,592 69,492 77,019 79,330 83,991 6,928 7,779

12,010 9,768 8,091 11,842 0,143 0,115 0,103 0,170 0,098 0,090 0 20 40 60 80 100 120 Lot ref Lot control Lot aeth Lot folium Lot radix Lot semen Loturi experimentale Activitatea peroxidazei (U/L) Minima Media Maxima SD* RSD** Fig. XIII.8. Activitatea glutation peroxidazei XIII.3 Concluzii Rezultatele analizei biochimice evideniaz aciunea toxic hepatic a acrilamidei prin creterea lizei membranare i deprimarea funciei proteosintetice a ficatului, dar n acelai timp invoc ipoteza unei posibile afectri renale. De asemenea, rezultatele demonstreaz implicarea acrilamidei n inducerea stresului oxidativ. Valorile biochimice obinute n cazul loturilor tratate cu preparate obinute din elin (Apii folium, Apii radix, Apii semen, Apii aetheroleum) reflect mbuntirea funciei hepatice i scderea stresului oxidativ comparativ cu loturile intoxicate cu acrilamid, evideniind existena unei posibile aciuni antitoxice. 47 Tabel XIII.3. Rezultatele investigaiei biochimice privitoare la aciunea antitoxic a ftalidelor din Apium graveolens prin prisma indicatorilor de citoliz hepatic i de proteosintez Indicatori de citoliz (x SD) Indicatori de proteosintez (x SD) Loturi AST (UI) ALT (UI) LDH ChE PT ALB Lot 1 31,2914,244 24,9692,687 6,6660,415 232,245,350 8,1830,377 2,5110,377 Lot 2 39,5364,222 34,8594,097 15,9980,207 267,255,143 7,2170,758 3,7050,385 Lot 3 35,3112,284 28,393,143 6,5590,488 264,738,382 7,8910,705 3,1840,405 Lot 4 35,8973,455 30,0101,466 6,3580,351 276,8870,528 7,7510,593 3,0390,150 Lot 5 33,5324,357 30,3183,159 6,5090,832 251,93243,009 7,7040,739 3,0390,785 Lot 6 35,89582,8812 25,9513,160 6,4580,378 220,3218,021 8,0730,412 2,550,512 Tabel XIII.4. Rezultatele investigaiei biochimice privitoare la aciunea antitoxic a ftalidelor din Apium graveolens prin prisma markerilor de inducie enzimatic i stres oxidativ Markeri inducie enzimatic (oncogenez) (x sd) Indicatori stres oxidativ (x sd) Loturi GGT CAT SOD GSH-Px

Lot 1 6,8430,950 591,7638,816 442,7009,4842 83,99112,009 Lot 2 7,5241,678 464,638,809 400,26239,6451 84,6709,768 Lot 3 7,0251,401 468,25837,701 383,90038,4667 78,5918,091 Lot 4 6,9341,211 570,0533,627 424,44430,9087 69,49211,841 Lot 5 6,8590,976 495,179,325 418,43237,9051 79,3297,778 Lot 6 6,9311,398 593,8433,312 420,25238,9471 77,0196,927 48 CAPITOLUL XIV CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE XIV.1 Concluzii generale 1. Metoda de determinare cantitativ a acrilamidei a fost validat urmrind parametrii: domeniu de concentraie/liniaritate, precizie, acuratee, stabilitate, randament de recuperare, limit de detecie, limit de cuantificare. 2. Rezultatele evideniaz un domeniu de liniaritate cuprins ntre 0,5 i 5,0 mg/L, cu un coeficient de corelaie (R2 ) de 0,9999. 3. Metoda se caracterizeaz prin precizie, exactitate, stabilitate i un randament optim de recuperare. 4. Analiza cantitativ a acrilamidei n unele produse alimentare disponibile pe piaa comercial din Romnia dezvluie faptul c cele mai mari concentraii de acrilamid se gsesc n probele de cartofi prjii, fiind urmate de probele de chips-uri, biscuii, pop-corn i pine. 5. Variaiile concentraiilor de acrilamid n produsele alimentare analizate se datoreaz att coninutului diferit n precursori al materiilor prime, dar i condiiilor de prelucrare culinar, ce intervin prin urmtorii parametri: blanizare, condimente utilizate, timp i temperatur de prjire, tipul i calitatea uleiului utilizat la prjire, modalitatea de prelucrare culinar (pre-prjire, prjire n ulei, prjire n abur, coacere, microunde). 6. Rezultatele obinute n cadrul prezentei teze de doctorat evideniaz corelaia existent ntre coninutul n zahr direct reductor, respectiv zahr total solubil din probele de cartofi i porumb pentru pop-corn i concentraia final de acrilamid din probele de cartofi prjii i pop-corn. 7. Analiza probelor de pine feliat evideniaz valori aflate sub limita de cuantificare a metodei pentru pinea feliat neprjit i relev creterea concentraiei de acrilamid n probele de pine prjit dependent de timpul i temperatura procesului de prelucrare termic. De asemenea, valorile determinrilor analitice demonstreaz dependena coninutului n acrilamid de gradul de 49 extracie al finii, valorile cele mai mari obinndu-se pentru pinea Graham, care conine n compoziia sa tre de gru. 8. Nivelul acrilamidei n produsele alimentare pe baz de cartofi variaz dependent de soiul de cartof utilizat n procesul de

prelucrare culinar, valoarea cea mai ridicat regsindu-se pentru soiul Sante, urmat de Desiree, concentraiile cele mai reduse obinndu-se pentru soiul Ostara. Rezultatele demonstreaz, de asemenea, variaia coninutului n acrilamid dependent de procedeul culinar aplicat. Astfel, valorile cele mai ridicate pentru acrilamid sau obinut pentru cartofii prjii n ulei, valori mai sczute s-au obinut n cazul cartofilor copi la cuptorul clasic, n timp ce valorile cele mai reduse au fost determinate n cazul cartofilor prelucrai termic prin prjire n abur. 9. n experimentul ce a vizat evaluarea modificrilor biochimice, hematologice i histopatologice ulterior aportului cronic de acrilamid prin consumul de cartofi prjii, pine prjit, respectiv soluie apoas de acrilamid, aciunea hepatotoxic a amidei acrilice este susinut de rezultatele investigaiei biochimice prin creterea lizei celulelor hepatice i scderea funciei proteosintetice a ficatului, dar i de modificrile histopatologice observate la nivelul acestui organ int. Existena unui posibil sindrom nefrotic la loturile din cadrul aceluiai experiment este sugerat att de variaiile albuminemiei, dar i de rezultatele histopatologice la nivelul rinichiului. Evaluarea stresului oxidativ la animalele de laborator expuse aportului cronic de acrilamid prin consum de cartofi prjii, pine prjit, respectiv soluie apoas de acrilamid 0,1 g/L denot implicarea noxei alimentare, posibil n special prin intermediul metabolitului su epoxidic, glicidamida, n creterea concentraiei speciilor reactive ale oxigenului. n ceea ce privete parametrii hematologici, intoxicaia cronic cu acrilamid conduce la scderea numrului de eritrocite, a valorilor hemoglobinei, hematocritului i trombocitelor, precum i creterea formulei leucocitare. 10. n experimentul ce evalueaz potenialul protector al acidului ascorbic n intoxicaia subacut cu acrilamid, activitatea hepatotoxic a amidei este susinut nu doar de variaiile enzimelor de citoliz hepatic dar i de variaia colinesterazei, ceea ce sugereaz i o deprimare a funciei proteosintetice. Intervenia 50 protectoare a acidului ascorbic se manifest evident asupra aspartat aminotransferazei, evoluia celorlalte enzime edificatoare pentru afectarea hepatic fiind mai puin influenat de aciunea vitaminei. De asemena, evaluarea stresului oxidativ denot implicarea amidei toxice n creterea concentraiei speciilor reactive ale oxigenului, cel mai probabil prin intermediul metabolitului su cu structur epoxidic, glicidamida. Aciunea benefic a acidului ascorbic se traduce prin ameliorarea marcant a stresului oxidativ. 11. n experimentul ce estimeaz potenialul protector al preparatelor din elin, rezultatele analizei biochimice evideniaz aciunea toxic hepatic a acrilamidei prin creterea lizei membranare i deprimarea funciei proteosintetice a ficatului, dar n acelai timp invoc ipoteza unei posibile afectri renale. De asemenea, rezultatele

demonstreaz implicarea acrilamidei n inducerea stresului oxidativ. Valorile biochimice obinute n cazul loturilor tratate cu preparate obinute din elin (Apii folium, Apii radix, Apii semen, Apii aetheroleum) reflect mbuntirea funciei hepatice i scderea stresului oxidativ comparativ cu loturile intoxicate cu acrilamid, evideniind existena unei posibile aciuni antitoxice. XIV.2 Contribuii originale Rezultatele cercetrilor experimentale efectuate n cadrul prezentei teze de doctorat includ o serie de contribuii cu caracter de originalitate: - validarea unei metode gaz cromatografice de analiz cantitativ a acrilamidei n produsele alimentare, metod ce se distinge nu numai prin precizie, acuratee, randament de recuperare optim, stabilitate, ci mai ales prin simplitatea i uurina metodologiei de lucru, precum i un cost redus privind achiziionarea aparaturii i instrumentelor de laborator comparativ cu metodele gaz cromatografice sau lichid cromatografice utilizate; - cuantificarea coninutului n acrilamid al unor produse alimentare disponibile pe piaa comercial din Romnia (chips-uri, cartofi prjii, pine prjit, biscuii, pop-corn); - realizarea unui model experimental pe animale de laborator care a avut ca obiectiv major simularea aportului cronic de acrilamid prin consum de alimente cu un coninut bogat n aceast51 nox alimentar i repercusiunile la nivel biochimic, hematologic i histopatologic; - cercetarea unor posibile ci de diminuare a toxicitii amidei acrilice prin utilizarea de substane cu aciune chemopreventiv (substane cu potenial antiradicalar, antitoxic); - evidenierea unui potenial antitoxic parial al acidului Lascorbic n intoxicaia subacut cu acrilamid la animalele de laborator - stabilirea unei aciuni protectoare pariale a unor fitopreparate din Apium graveolens (Apii aetheroleum, Apii folium, Apii radix, Apii semen)n intoxicaia cronic cu acrilamid. XIV.3 Perspective privind noi direcii de cercetare a problematicii acrilamidei Rezultatele obinute n cadrul prezentei teze de doctorat ofer posibilitatea orientrii ctre noi direcii de cercetare: - continuarea determinrii cantitative a acrilamidei n alte categorii de produse alimentare din Romnia: cereale pentru micul dejun, cafea i substituitori pentru cafea, ciocolat i produse pe baz de ciocolat, produse de cofetrie, alimente pentru diabetici, hran pentru copii etc.; - extinderea cercetrii coninutului n acrilamid asupra produselor cosmetice i evaluarea aportului de acrilamid prin absorbia cutanat ulterior utilizrii acestor produse;

- evaluarea aportului de acrilamid prin consum de alimente printr-un model experimental realizat pe subieci umani, utiliznd fie metoda chestionarului, fie metoda biomarkerilor ce determin cantitativ aducii acrilamidei cu hemoglobina; - implicarea industriei alimentare n obinerea unor alimente cu un coninut redus n acrilamid, prin alegerea unor soiuri de cartofi cu un coninut sczut n zahr direct reductor, prin pstrarea unor condiii optime de depozitare i alegerea unor parametri culinari corespunztori; - revizuirea legislaiei privind securitatea i sigurana alimentar, prin introducerea unor limite maxime admisibile viznd prezena acrilamidei n ap, respectiv n ambalajele pentru produsele alimentare; 52 - stabilirea i recomandarea unei diete sntoase prin: consumul alimentelor cu un coninut redus n acrilamid, prin respectarea unor reguli privind controlul parametrilor din cadrul procesului culinar casnic, prin abordarea unei diete cu un coninut bogat n vitamina C (fructe i legume n stare proaspt), respectiv ftalide (elin, leutean). Bibliografie selectiv 1. *** - NICNAS, Acrylamide. Priority Existing Chemical. Assessment Report No. 23 (2002). 2. Eriksson, E., Acrylamide in food products: Identification, formation and analytical methodology. Doctoral Thesis, Stockholm University, 2005: 9-19 3. Dybing, E., Farmer, P. B., Andersen, M., Fennell, T. R., Lalljie, S. P. D., Muller, D. J. G., Olin, S., Petersen, B. J., Schlatter, J., Scholz, G., Scimeca, J. A., Slimani, N., Tornqvist, M., Tuijtelaars, S., Verger, P. (2005). Human exposure and internal dose assessments of acrylamide in food. Food and Chemical Toxicology, 43: 365410. 4. Fennell, T. R., Sumner, S. C., Snyder, R. W., Burgess, J., Friedman, M. A. (2006). Kinetics of elimination of urinary metabolites of acrylamide in humans. Toxicological Sciences, 93 (2): 256-267. 5. Fuhr, U., Boettcher, M. I, Kinzig-Schippers, M., Weyer, A., Jetter, A., Lazar, A., Taubert, D., Tomalik-Scharte, D., Pournara, P., Jakob, V., Harlfinger, S., Klaassen, T., Berkessel, A., Angerer, J., Srgel, F., Schmig, E. (2006). Toxicokinetics of Acrylamide in Humans after Ingestion of a Defined Dose in a Test Meal to Improve Risk Assessment for Acrylamide Carcinogenicity. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 15: 266-271. 6. Doerge, D. R., Twaddle, N. C., Boettcher, M. I., McDaniel, L. P., Angerer J. (2007). Urinary excretion of acrylamide and metabolites in Fischer 344 rats and B6C3F1 mice administered a single dose of acrylamide. Toxicology Letters. 169(1): 34-42. 7. Stadler, R., Blank, I., Varga, N., Robert, F., Hau, J., Guy, P., Robert, M., Riediker, S. (2002). Acrylamide from Maillard reaction products. Nature, 419: 449 450. 8. Stadler, R., Scholz, G. (2004). Acrylamide: an update on current

knowledge in analysis, levels in food, mechanisms of formation, and potential strategies of control. Nutrition reviews, 62: 449-467. 9. Landersdorfer, C. (2002). Acrylamide: increased concentrations in homemade food and first evidence of its variable absorption from food, variable metabolism and placental and breast milk transfer in humans. Chemotherapy, 48(6): 267-274. 10. Schettegen, T., Broding, H.C., Angerer, J., Drexler, H. (2002). Hemoglobin adducts of ethylene oxide, propylene oxide, acrylonitrile and 53 acrylamide-biomarkers in occupational and environmental medicine. Toxicol Lett, 134(1-3): 65-70. 11. Schettgen, T., Drexler, H., Angerer, J. (2002). Acrylamide in the general population - A daily intake estimation. Umweltmedizin in Forschung und Praxis, 7: 331-336. 12. Schettgen, T., Weiss, T., Drexler, H., Angerer, J. (2003). A first approach to estimate the internal exposure to acrylamide in smoking and non-smoking adults from Germany. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 206: 914. 13. Pedreschi, F., Bustos, O., Mery, D. (2007). Colour kinetics and acrylamide formation in NaCl soaked potato chips. Journal of Food Engineering, 79: 989997. 14. Petersson, E., Rosen, J., Turner, C., Danielsson, R., Hellenas, K. (2006). Critical factors and pitfalls affecting the extraction of acrylamide from foods: An optimisation study. Analytica Chimica Acta, 557: 287-295. 15. Park, J., Kamendulis, L. M., Friedman, M. A., Klaunig, J. (2002). Acrylamide-Induced Cellular Transformation. Toxicological Science, 65: 177-183. 16. Manca, D., Oi, T., Manca, G. (2005). Analiza acrilamidei cancerigene din alimente prin cromatografie n faz gazoas. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., 109 (4), [suppl. 1]: 262-265 17. Friedman, M. (2003). Chemistry, Biochemistry, and Safety of Acrylmide. A Review. J. Agric. Food. Chem., 51: 4504-4526. 18. *** - Nexant Chem Systems, PERP Program New Report Alert, Acrylamide (01/02S10), www.chemsystems.com/newsletters/perp/Dec02N01S10.cfm (2002). 19. Lindsay, R., Generalized Potential Origins of Acrylamide in Foods, Workshop on FRI Acrylamide Project, Chicago, 2002. 20. Mottram, D. S, Wedzicha, B. L., Dodson, A. T. (2002). Acrylamide is formed in the Maillard reaction. Nature, 419: 448-9. 21. Chuda, Y., Ono, H., Yada, H., Ohara-Takada, A., Matsuura-Endo, C., Mori, M. (2003). Effects o Physiological Changes in Potato Tubers (Solanum tuberosum L.) after Low Temperature Storage on the Level of Acrylamide Formed in Poatato Chips. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67 (5): 1188-1190. 22. Zyzak, D., Sanders, R., Stojanovic, M., Tallmadge, D., Eberhart, L. B., Ewald, D. K., Gruber, D. C., Morsch, T. R., Strothers, M. A., Rizzi, G. P., Villagran, M. D. (2003). Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods. J. Agric. Food. Chem., 51: 4782-4787. 23. Cavalli, S., Maurer, R., Hfler, F. (2003). Fast Determination of

Acrylamide in Food Samples Using Accelerated Solvent Extraction Followed by Ion Chromatography with UV or MS Detection. The Application Book Dionex Corp. 24. Robarge, T., Phillips, E., Conoley, M. Analysis of Acrylamide in Food by GCMS. (2003). The Applications Book of Thermo Electron Corporation Chromatography and Mass Spectrometry. 54 25. Pittet, A., Prisset, A., Oberson, J-M. (2004). Trace level determination of acrylamide in cereal-based foods by gas chromatographymass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1035: 123130. 26. tles, S., tles, S. (2004). Acrylamide in Food (Chemical Structure of Acrylamide). Electron. J. Environ. Agric. Food Chem. 3 (5): 723-730. 27. Hoenicke, K., Gatermann, R., Harder, W., Hartig, L. (2004). Analysis of Acrylamide in different Foodstuffs using Liquid Chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 520: 207-215. 28. Stadler, R., Scholz, G. (2004). Acrylamide: an update on current knowledge in analysis, levels in food, mechanisms of formation, and potential strategies of control. Nutrition reviews, 62: 449-467. 29. enyuva, H. Z., Gkmen, V. (2005). Study of acrylamide in coffee using an improved liquid chromatography mass spectrometry method: Investigation of colour changes and acrylamide formation in coffee during roasting. Food Additives and Contaminants, 22(3): 214220. 30. Pabst, K., Mathar, W., Palavinskas, R., Meisel, H., Blthgen, A., Klaffke H. (2005). Acrylamideoccurrence in mixed concentrate feed for dairy cows and carry-over into milk. Food Additives and Contaminants, 22(3): 210213. 31. Corradini, M. G., Peleg, M. (2006). Linear and Non-Linear Kinetics in the Synthesis and Degradation of Acrylamide in Foods and Model Systems. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 46:489517. 32. Koh, B-K. (2006). Determination of acrylamide content of food products in Korea. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86: 25872591. 33. Chuang, W. H., Chiu, C. P., Chen, B. H. (2006). Analysis and Formation of Acrylamide in French Fries and Chicken Legs during Frying. Journal of Food Biochemistry, 30: 497507. 34. Wenzl, T., Karasek, L., Rosen, J., Hellenaes, K-E., Crews, C., Castle, L., Anklam, E. (2006). Collaborative trial validation study of two methods, one based on high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry and on gas chromatographymass spectrometry for the determination of acrylamide in bakery and potato products. Journal of Chromatography A, 1132: 211218. 35. Aguas, P. C., Fitzhenry, M. J., Giannikopoulos, G., Varelis, P. Analysis of acrylamide in coffee and cocoa by isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry. (2006). Anal Bioanal Chem, 385: 15261531. 36. Dabrio, M., Sejeroe-Olsen, B., Musser, S., Emteborg, H., Ulberth, F. (2006). Certification Report. Certification of Acrylamide in Toasted Bread. Certified Reference Materials ERM-BD273. European Commission, Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM), Geel (BE).

37. Fernandes, J. O., Soares, C. (2007). Application of matrix solid-phase dispersion in the determination of acrylamide in potato chips. Journal of Chromatography A, 1175: 16. 55 38. Geng, Z., Jiang, R., Chen, M. (2008). Determination of acrylamide in starch-based foods by ion-exclusion liquid chromatography. Journal of Food Composition and Analysis, 21 (2): 178-182. 39. Matsuura-Endo, C., Ohara-Takada, A., Chuda, Y., Ono, H., Yada, H., Yoshida, M., Kobayashi, A., Tsuda, S., Takigawa, S., Noda, T., Yamauchi, H., Mori, M. (2006). Effects of Storage Temperature on the Contents of Sugars and Free Amino Acids in Tubers from Different Potato Cultivars and Acrylamide in Chips. Biosci. Biotchnol. Biochem., 70 (5): 1173-1180. 40. Matthus, B., Haase, N. U. (2003b). Acrylamides. What are the possibilities of their minimisation in food? Original language title: Acrylamid Welche Moglichkeiten zur Minimierung. Lebensmittel gibt est Muhle, 140: 142144. 41. Leufven, A., Lingnert, H. (2003). Factors influencing acrylamide formation food procesing Introductory model experiments performed at SIK. Public report of the Swedish Institute for Food and Biotechnology. 42. Olsson, K., Svensson, R., Roslund, C. (2004). Tuber components affecting acrylamide formation and colour in fried potato: Variation by variety, year, storage temperature and storage time. Journal of the Science of Food and Agriculture, 84: 447-458. 43. Biedermann, M., Noti, A., Biedermann-Brem, S., Mozzetti, V., Grob, K. (2002c). Experiments on acrylamide formation and possibilities to decrease the potential of acrylamide formation in potatoes. Mitt Lebensm Hyg, 93: 668687. 44. Biedermann, M., Biedermann-Brem, S., Noti, A., Grob K. (2002b). Methods for Determining the potential of Acrylamide Formation and Its Elimination in Raw Materials for Food Preparation, Such as Potatoes. Mitt Lebensm Hyg, 93: 653667. 45. Noti, A., Biedermann, B., Biedermann, M., Grob, K., Albisser, P., Realini, P. (2003). Storage of potatoes at low temperature should be avoided to prevent increased acrylamide formation during frying or roasting. Mitteilungen aus Lebensmitteluntersuchung und Hygiene, 94: 167-180. 46. Kita, A., Brathen, E., Knutsen, S. H., Wicklund, T. (2004). Effective ways of decreasing acrylamide content in potato crisps during processing. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (23): 5011-5016. 47. Grob, K., Biedermann, M., Biedermann, B., Noti, A., Imhof, D., Amrein, T., Pfefferle, A., Bazzocco, D. (2003a). French fries with less than 100 g/kg acrylamide. A collaboration between cooks and analysts. European Food Research and Technology, 217: 185-194. 48. Gertz, C., Klostermann, S., Kochhar, P. (2003). Deep frying: the role of water from food being fried and acrylamide formation. Olagineux Corps Gras Lipides, 10 (4): 297- 303. 49. Gertz, C., Klostermann, S. (2002). Analysis of acrylamide and mechanisms of its formation in deep-fried products. Eur J Lipid Sci Technol, 104: 762771. 56

50. Gertz, C. Optimising the frying and baking process using oil improving agents. 4th International Symposium Deep-Frying, Hagen, 2004. 51. Fernandez, S., Kurppa, L., Hyvnen, L. (2003). Content of acrylamide decreased in potato chips with addition of a proprietary flovonoid spice mix (Flavomare) in frying. Inn. In Food Technol., 18: 24-26. 52. Brathen, E., Knutsen, S. H. (2005). Effect of temperature and time on the formation of acrylamide in starch-based and cereal model systems, flat breads and bread. Food Chemistry, 92: 693-700. 53. Ishihara, K., Matsunaga, A., Nakamura, K., Sakuma, K., Koga, H. (2006). Examination of Conditions Inhibiting the Formation of Acrylamide in the Model System of Fried Potato. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 70 (7): 1616-1621. 54. Morales, F., Capuano, E., Fogliano, V. (2008). Mitigation Strategies to Reduce Acrylamide Formation in Fried Potato Products. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1126: 89100. 55. tles, S., tles, S. (2004). Acrylamide in Food (Chemical Structure of Acrylamide). Electron. J. Environ. Agric. Food Chem. 3 (5): 723-730. 56. Levine, R. A., Smith, R. E. (2005). Sources of variability of acrylamide levels in a cracker model. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 4410 4416. 57. Low, M.Y., Koutsidis, G., Parker, J.K. (2006). Effect of citric acid and glycine addition on acrylamide and flavor in a potatomodel system. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 59765983. 58. DiNovi, M., Howard, D. The Updated Exposure Assessment for Acrylamide, FDA/CFSAN, Acrylamide in Food: Update Scientific Issues, Uncertainties, and Research Strategies, April 13, 2004. http://www.jifsan.umd.edu/presentations/acry2004/acry_2004_dinovihoward.pdf. 59. *** - CERHR, Monograph on the Potential Human Reproductive and Developmental Effects of Acrylamide (2005). 60. Bergmark, E. (1993). Determination of hemoglobin adducts in humans occupationally exposed to acrylamide. Toxicology and Applied Pharmacology, 120:4554. 61. Bergmark, E. (1997). Hemoglobin adducts of acrylamide and acrylonitrile in laboratory workers, smokers and nonsmokers. Chemical Research in Toxicology, 10: 7884. 62. Dybing, E., Sanner, T. (2003). FORUM: Risk Assessment of Acrylamide in Foods. Toxicological Sciences, 75: 7-15. 63. Konings, E. J. M., Baars, A. J., van Klaveren, J. D., Spanjer, M. C., Rensen, P. M., Hiemstra, M., van Kooij, J. A.,Peters, P. W. J. (2003). Acrylamide exposure from foods of the Dutch population and an assessment of the consequent risks. Food and Chemical Toxicology, 41: 1569-1579. 64. Leung, K. S., Lin, A., Tsang, C. K., Yeung, S. T. K. (2003). Acrylamide in Asian foods in Hong Kong, Food Additives and Contaminants, 20: 11051113. 57 65. Maitani, T. (2004). Evaluation of exposure to chemical substances through foods - exposure to pesticides, heavy metals, dioxins, acrylamide and food additives in Japan. Journal of Health Science, 50(3): 205-209.

66. Matthys, C., Bilau, M., Govaert, Y., Moons, E., Henauw, S. D., Willems, J. L. (2005). Risk assessment of dietary acrylamide intake in Flemish adolescents. Food and Chemical Toxicology, 43(2): 271-278. 67. *** - Norwegian Food Control Authority. (2002). Risk assessment of acrylamide intake from foods with special emphasis on cancer risk . 68. Mucci, L. A., Dickman, P. W., Steineck, G., Adami, Augustsson, K. (2003). Dietary acrylamide and cancer of the large bowel, kidney, and bladder: Absence of an associatin in a population-based study in Sweden. British Journal of Cancer, 88: 84-89. 69. Srgel, F., Weissenbacher, R., Kinzig-Schippers, M., Hofmann, A., Illauer, M., Skott, A., Landersdorfer, C. (2002). Acrylamide: increased concentrations in homemade food and first evidence of its variable absorption from food, variable metabolism and placental and breast milk transfer in humans. Chemotherapy, 48(6): 267-274. 70. Twaddle, N. C., Churchwell, M. I., McDaniel, L. P., Doerge, D. R. (2004). Autoclave sterilization produces acrylamide in rodent diets: Implications for toxicity testing. J. Agric. Food Chem. 5: 4344-4349. 71. Fennell, T. R., Sumner, S. C. J., Snyder, R. W., Burgess, J., Spicer, R. (2005). Metabolism and hemoglobin adduct formation of acrylamide in humans. Toxicological Sciences, 85 (1): 447-459. 72. Mc Hugh, Atkins, W. M., Racha, K.J., Kunze, K. I. (1996) Biding of the toxin-glutation conjugate to mouse glutation-S-transferase A3-3 is saturate dat onlz one, Journal of Biological and Biochimistry, 27470-27474; 73. Park, J., Kamendulis, L. M., Friedman, M. A., Klaunig, J. (2002). Acrylamide-Induced Cellular Transformation. Toxicological Science, 65: 177-183. 74. Sumner, S., Williams, C. C., Snyder, R. W., Krol, W. L., Asgharian, B., Fennel, T. R. (2003). Acrylamide: A Comparison of Metabolism and Hemoglobin Adducts in Rodents following Dermal, Intraperitoneal, Oral, or Inhalation Exposure. Toxicological Science, 75: 260-270. 75. Roman, L., Boji, M., Sndulescu, R. Validarea metodelor de analiz i control. Bazele teoretice i practice, Editura medical, 1998: 75/129, ISBN 973-390362-0. 76. Kim, C. T., Hwang, E., Lee, H. Y. (2005). Reducing acrylamide in fried snack products by adding amino acids. Journal of Food Science, 70: 354358. 77. Becalski, A., Lau, B., Lewis, D., Seaman, S., Hayward, S., Sahagian, M., Ramesh, M., Leclerc, Y. (2004). Acrylamide in French fries: influence of free amino acids and sugars. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 38013806. 78. Fiselier, K., Bazzocco, D., Gama-Baumgartner, F., Grob, K. (2006). Influence of the frying temperature on acrylamide formation in French fries. Eur Food Res Technol, 222: 414419. 58 79. Matthus, B., Vosmann, K., Haase, N. U. (2003a). How can one reduce acrylamide during baking and frying? Original language title: Wie lasst sich Acrylamid beim Backen und Braten vermindern?. Forschungs-Report, 33-35. 80. *** - German Federation of Food Law and Food Science. Development of New Technologies to Minimize Acrylamide in Food, ISBN 3-925032-42-8 (2005).

81. Taeymans, D., Wood, J., Ashby, P., Blank I. (2004). A Review of Acrylamide: An Industry Perspective on Research, Analysis, Formation and Control, Critical Reviews. Food Science and Nutrition, 44: 323-347. 82. Soyka, S., Frohberg, C., Quanz, M., Essigmann, B. (2004). Process for reducing the acrylamide content of heat-treated foods. European PCT Patent Application, no: WO-2004-040999. 83. Ono, H., Chuda, Y., Ohnishi-Kameyama, M., Yada, H., Ishizaka, M., Kobayashi, H., Yoshida, M. (2003). Analysis of acrylamide by LC-MS/MS and GC-MS/MS in processed Japanese foods. Food Additives and Contaminants, 20 (3): 215 220. 84. Wenzl, T., Karasek, L., Rosen, J., Hellenaes, K-E., Crews, C., Castle, L., Anklam, E. (2006). Collaborative trial validation study of two methods, one based on high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry and on gas chromatographymass spectrometry for the determination of acrylamide in bakery and potato products. Journal of Chromatography A, 1132: 211218. 59 LUCRRI PUBLICATE IN EXTENSO DIN DOMENIUL TEZEI 1. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Fitterman, P., Larroque, M. (2009). Optimisation of a Gas Chromatographic Method For Acrylamide Analysis. Applications. Environmental Engineering and Management Journal, 8(2): 315-320. 2. Burlacu, A. I., Fitterman, P., Cuciureanu, R. (2008). Acrylamide Formation in Aliments Depending on Potato Varieties and Culinary Processes. A Comparative Study. Farmacia, LVI (3): 319-325. 3. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Larroque, M. (2007). Cercetri privind prezena acrilamidei n produsele alimentare. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iai, 111 (2) [Supliment Nr. 2]: 475-478. 4. Burlacu, A. I., Fiterman, P., Cuciureanu, R. (2008). Evaluarea aportului de acrilamid prin consum de alimente. Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iai. 112 (2) [Supliment Nr. 1]: 79 83. 5. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Priscaru, C. (2007). Acrylamide toxic compound formed during the thermical process of aliments. Lucrri tiinifice, Secia medicin Veterinar, 50 (9): 129 133. 6. Burlacu, A. I., Fiterman, P., Cuciureanu, R. (2008). Gas chromatographic determination of acrylamide in chips. Orvosi es Gzogzsyeresyeti Syemie, 54: 87-89. REZUMATE PUBLICATE N REVISTE COTATE ISI 1. Burlacu, A. I., Cruntu, I. D., Cuciureanu, M., Priscaru, C., Cuciureanu, R. (2008). Evaluation of the protective potential of ascorbic acid in acrylamide intoxication, Elsevier Toxicology Letters, 180 [1]: 62. PARTICIPAREA LA CONFERINE NAIONALE 1. Priscaru, A. I., Larroque, M., Cuciureanu, R. Contributions to the Acrylamide Analysis in Potato Products by Gas Chromatography,

Poster, Al XIII-lea Congres Naional de Farmacie Cluj-Napoca, 2830 septembrie 2006. 60 2. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Larroque, M. Cercetri privind prezena acrilamidei n produsele alimentare, Comunicare oral, Simpozionul naional Medicamentul de la concepere pn la utilizare Iai, Ediia I-a, 30 mai 1 iunie 2007. 3. Burlacu, A. I., Fiterman, P., Cuciureanu, R. Evaluarea aportului de acrilamid prin consum de alimente. Comunicare oral, Conferina Naional de Fitoterapie, Ediia a IV-a, Iai, 14-16 mai 2008. PARTICIPAREA LA CONFERINE INTERNAIONALE 1. Burlacu, A. I., Larroque, M., Cuciureanu, R. Analysis of acrylamide in food by gas chromatography. Comunicare oral, 29th Balkan Medical Week, Golden Sands, Bulgaria, 28-30 septembrie 2006. 2. Burlacu, A. I., Cuciureanu, R., Priscaru, C. Acrylamide toxic compound formed during the thermical process of aliments, Poster, Simpozionul tiinific Internaional Progrese i Perspective n Medicina Veterinar Iai, 7 8 iunie 2007. 3. Burlacu, A. I., Cruntu, I. D., Cuciureanu, M., Priscaru, C., Cuciureanu, R. (2008). Evaluation of the protective potential of ascorbic acid in acrylamide intoxication, Poster, The 45th Congress of the European Societies of Toxicology EUROTOX 2008, Rhodes, Grecia, 5-8 octombrie 2008. GRANTURI 1. Grant CNCSIS tip TD, Titlu: Cercetri privind prezena acrilamidei n alimentele prelucrate termic, Perioada: 2007-2009 (director de proiect). 2. Grant CNCSIS tip A, Tema Nr.1138/2007, Titlu: Acrilamida - compus toxic format n cadrul prelucrrii termice a alimentelor; Perioada: 2007-2008 (membru n echipa de cercetare).