CURSUL 6

ENZIME UTILIZATE N TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT

Tehnologia ADN recombinat sau altfel intitulat clonare genic sau molecular
este o denumire general care cuprinde o serie de protocoale experimentale ce conduc
la transferul informaiei genetice (ADN) de la un organism la altul. n practic sunt
mai multe metode care conduc la acest obiectiv, totui un experiment n urma cruia
se obine un ADN recombinat are paii generali descrii n figura 6.1.

Figura 6.1 Obinerea ADN recombinat (clonare). A) vector clonare-plasmid (ADN

int cu dimensiuni mici) i B) vector de clonare bacteriofag (ADN int cu
dimensiuni mari). ADN int este tiat cu enzime de restricie iar vectorul este tiat cu
acelai tip de enzime de restricie sau cu enzime care conduc la formarea unor capete
complementare cu ale ADN int. Cele dou tipuri de fragmente ADN cu capete
complementare sunt sudate n prezena ADN ligazelor lund natere un ADN
recombinat.
ADN-ul (ADN ce urmeaz a fi clonat, ADN inserat, ADN int sau ADN
strin) de la un organism donor este extras, tiat (digerat) enzimatic i legat (inserat)
1

la un alt ADN (vector de clonare) formnd o nou molecul ADN recombinat sau
ADN construct. Apoi ADN recombinat este transferat i meninut ntr-o celul gazd.
Procesul prin care are loc transferarea unui ADN ntr-o bacterie poart numele de
transformare. Celulele ce conin ADN recombinat (transformate) sunt identificate i
selectate (separate sau izolate de cele ce nu conin ADN recombinat pe baza unei
proprieti) iar ADN int este clonat.
Tehnologia ADN recombinat s-a dezvoltat pe baza descoperirilor din biologia
molecular, enzimologia acizilor nucleici i genetica microrganismelor (att a
virusurilor ct i a bacterilor). Totui, tehnologia ADN recombinat nu ar fi existat fr
enzimele care recunosc secvene dublu catenare ADN i care au capacitatea de a tia
ADN la nivelul ambelor catene denumite generic enzime de restricie sau
endonucleaze de restricie.
6.1. Endonucleaze de restricie
n cazul tehnicii de clonare molecular, att sursa ADN ce conine ADN int
ct i vectorul de clonare trebuie tiate n fragmente discrete i reproductibile. Acest
fapt a fost posibil numai dup descoperirea unor enzime de origine bacterian care au
capacitatea de recunoate o anumit secven ADN i de a tia moleculele de ADN la
nivelul aceleiai secvene sau la nivelul unor secvene aflate fie n aval fie n amonte
fa de situsul de recunoatere. Aceste enzime au fost formal numite endonucleaze de
restricie de tip II sau simplu enzime de restricie. n cadrul acestui grup de enzime
fac parte i alte tipuri de endonucleaze de restricie fiind ncadrate n cadrul tipului I,
III i IV. Endonucleaze de restricie/metilare de tipul II a fost pentru prima oar
observate atunci cnd s-a analizat atacul bacteriofagilor asupra bacteriilor obsevnduse c un anumit bacteriofag poate infecta un anumit tip de tulpin bacterian putnd
urma ciclul litic (Fig.6.2). ns dac fagii care au fost propagai pe o anumit tulpin
bacterian (tulpina 1) sunt transferai pe o alta (tulpina 2), ADN-ul bacteriofagului
este digerat de enzimele de restricie ale noii gazde (tulpina 2), deoarece nu mai
prezint acelai model de modificare ca i ADN-ul noii tulpini sau altfel spus, fagul
este restricionat la o anumit tulpin bacterian.

Figura 6.2. Ciclul lizogenic i ciclul litic al fagului

Bacteriile prezint sisteme specifice de restricie-metilare formate fie din
endonuleaze i metilaze distincte (tipul II) care au aceeai specificitate de secven
(Fig.6.2), fie aceeai enzim are o funcie dual de restricie-metilare (tipul I i III).
Metilaza are capacitatea de a metila un rest de citozin sau adenin din cadrul
secvenei recunoscut de enzima de restricie. Astfel, n urma modificrii prin metilare
situsul int devine rezistent la restricie.

Figura 6.2. Sistemul restricie-metilare EcoRI

Sistemul de restricie-metilare ajut tulpina bacterien s fac distincia ntre

ADN-ul self i ADN non-self(fagic, plasmidial, cromosomal) pe care l atac i l
taie cu enzimele de restricie.
Prima endonucleaz de restricie de tip II caracterizat a fost izolat din
Escherichia coli i a fost denumit EcoRI (prima liter desemneaz genul, iar celelalte
dou specia bacterian, fiind scrise italic iar cea de a patra n format normal provine
de la tulpina bacterian; numerele romane indic ordinea n care au fost descoperite
sistemele de restricie ale unei tulpini). Endonucleaza EcoRI este o protein
homodimeric (format din dou subuniti proteice identice) care se leag la o
regiune ADN ce prezint o secven palindromic (secven celor dou catene
complementare este identic dac este citit ntr-un singur sens 5-3). Secvena
recunoscut de EcoRI este format din 6 pb i este tiat ntre resturile de guanin i
adenin pe fiecare caten (Figura 6.2). EcoRI hidrolizeaz legtura fosfoesteric
dintre oxigenul carbonului 3 al deoxiribozei nucleotidei ce areca baza azotat
guanidine i gruparea fosfat ataat la

carbonul 5 al deoxiribozei nucleotidei

adiacente. Clivarea simetric a catenelor complementare a secvenei palindromice

ADN formeaz dou monocatene complementare avnd fiecare ctre captul 5 o
extensie de 4 nucleotide care se termin ntr-un rest de fosfat, denumite capete coezive
sau lipicioase (Figura 6.2 a).
De la izolarea endonucleazei EcoRI au fost caracterizate mai mult de 3700
endonucleaze de restricie de tipul II cu peste 250 de situsuri de recunoatere diferite
din variate tipuri bacteriene. Nomenclatura acestor enzime de restricie pstreaz
aceleai reguli ca cele utilizate pentru EcoRI. n plus la ora actual se dorete
renunarea scrierii italice a denumirii enzimelor de restricie. Astfel genul bacteriei
este scris cu litere mari,urmtoarele dou litere scrise cu minuscule desemneaz
specia bacterian. Tipul bacteriei este ocazional trecut cu litere mari ca R n EcoRI iar
serotipul este desemnat cu o liter mic precum d n HindIII. Numerele romane sunt
utilizate pentru a desemna ordinea n care au fost caracterizate enzimele de restricie
provenite de la aceeai bacterie. De exemplu HapI i HapII sunt prima i a doua
enzim de restricie de tip II izolat de la Haemophilus parainfluenzae.
Secvenele palindromice unde majoritatea enzimelor de restricie de tipul II se
leag i taie molecula de ADN sunt n interiorul situsului de recunoatere. Unele
endonucleaze de restricie cliveaz molecula de ADN genernd extensii monocatenare
la captul 5 fosfat (capete coezive) (Figura 6.3 a), altele genereaz capete coezive la
4

captul 3 (Figura 6.3 b) iar unele genereaz capete oarbe, tind simetric cele dou
catene ADN complementare (Figura 6.3 c).

Figura 6.3. Enzime de restricie de tip II care genereaz capete a) 5 coezive, b) 3

coezive i c) oarbe
Lungimea situsului de recunoatere pentru diferite enzime poate fi de patru,
cinci, ase, opt sau mai multe pb (Tabelul 6.1). Datorit frecvenei mari n care apar n
molecula de ADN, enzimele de restricie care taie la nivelul situsurilor de patru i ase
pb sunt cele mai utilizate n tehnicile de clonare.
Tabelul 6.1 Situsurile de recunoatere ale unor endonucleaze de restricie de tipII
Endonucleaz
BamHI

Situsul de restricie
G A AT T C

Tipul captului
5coezive

PstI

C T T A AG
C T G C AG

3coezive

Sau3AI

G AC G T C
G AT C

5coezive

HaeIII

C T AG
G GC C

oarbe

NotI

C CG G
GC G G C C G C

5coezive

C G C C G G C G

Tipul IIS de endonucleaze de restricie formeaz un subgrup aparte al tipului II

de enzime de restricie care sunt utilizate ocazional n strategii de clonare sau n
secvenierea multiplex. Aceste enzime taie molecula de ADN la nivelul ambelor
catene la un numar fix de nucleotide fa de situsul de recunoatere. De exemplu,
endonucleaza de restricie FokI de leag la secvena

GGATG
CCTAC

i taie dup 9

nucleotide la nivelul catenei 5-3 i la 13 dup situsul de recunoatere la nivelul

catenei 3-5, reprezentarea schematic a situsului de recunoatere i a modului de
tiere este:

GGATGNNNNN NNNN
, formnd un capt coeziv de 4 nucleotide
CCTACNNNNN NNNNNNNN

la captul 5 (unde N poate fi A, C, G sau T). Pe scurt acest motiv poate fi notat astfel:
GGATG N 9

CCTAC N 13

. Exemple de endonucleaze de restricie de tipul IIS sunt redate n

tabelul 6.2. Unele dintre aceste tipuri de endonucleaze pot cliva molecula de ADN att
n aval ct i n amonte fa de situsul de recunoatere.
Tabelul 6.2 Endonucleaze de restricie de tip IIS
Endonucleaz de

Situs de recunoatere

restricie IIS

5CTGAAG N 16
3GACTTC N 14

AcuI

5 ACCTGC N 4
3TGGACG N 8

BfuAI

5CGTCTC N 1
3GCAGAG N 5

BsmBI

5GGCGGA N 11
3CCGCCT N 9

EciI

5GGATG N 9
3CCTAC N 13
5GACGC N 5

FokI
HgaI

3CTGCG N 10
5GAGTC N 5

MlyI

3CTCAG N 5
5TCCRAC N 20
3 AGGYTG N 18

MmeI

n unele cazuri, diferite legturi fosfodiesterice din interiorul aceluia situs de

recunoatere sunt tiate de endonucleaze de restricie provenite de la diferite specii
bacteriene. De exemplu, enzimele de restricie XmaI i SmaI recunosc amndou
secvena

CCCGGG
GGGCCC

dar XmaI taie dup prima citozin 5 la nivelul fiecrei catene

complementare formnd capete coezive la captul 5 pe cnd SmaI genereaz capete

oarbe prin tierea ntre

CG
n mijlocul situsului de recunoatere. Prima n ordinea
GC

descoperirii dintre endonucleazele de restricie care se leag la un anumit situs poart

numele de prototip. Orice alt enzim de restricie care atac acelai situs de restricie
ca i prototipul se numete izoschizomer. De exemplu, endonucleazele de restricie
XhoI i PaeRI izolate din surse diferite au aceelai situs de recunoatere i de tiere.
Enzimele de restricie care recunosc acelai situs dar taie n poziii diferite se numesc
neoschizomere (Figura 6.4).

Figura 6.4 Enzime neoschizomere-endonucleazele KasI, NarI, SfoI i BbeI se leag la

acelai situs de recunoatere dar taie molecula de ADN n poziii diferite
Endonucleazele de restricie care produc aceleai tipuri de capete coezive
(aceeai extensie de nucleotide) dar care au situsuri de recunoatere diferite sunt
denumite izocaudomere, cum ar fi BamHI i Sau3AI (Figura 6.1B i Tabelul 6.1).
n unele cazuri, unele endonucleaze de restricie taie o secven din molecula
de ADN numai dac citozina situsului de recunoatere este nemetilat pe cnd altele
pot cliva aceeai secven de nucleotide doar dac citozina este metilat. Astfel, HpaII
7

taie numai situsul

CCGG
GGCC

nemetilat iar MspI izoschizomera enzimei HpaII cliveaz

acelai situs indiferent de starea de metilare a citozinei. Aceste perechi de

endonucleaze de restricie sunt adesea utilizate pentru a determina statusul metilrii
ADN genomic. Dac o molecul de ADN nu este tiat de enzima HpaII, dar este
tiat de MspI, atunci situsul de recunoatere este metilat. Dac ambele enzime taie
molecula de ADN, atunci situsurile de recunoatere sunt nemetilate.
Realizarea hartilor situsurilor de restricie ale endonucleazelor pentru o
molecul/fragment ADN. Harille ce redau situsurile de restricie la nivelul unui
fragment ADN se realizeaz prin tratarea respectivului fragment cu cte o enzim de
restricie iar apoi cu combinaii ale acelorai enzime de restricie. Poziia situsurilor
unde enzimele de restricie taie se pot deduce prin analiza marimii fragmentelor ADN
rezultate n urma digestiilor prin electroforez n gel de agaroz. n figura 6.5 sunt
redate mrimile fragmentelor ADN rezultate n urma digestiei unui fragment ADN
liniar de 16500 pb cu enzima EcoRI, BamHI i cu un amestec al ambelor enzime
(EcoRI i BamHI). Fiindc digestia separat cu fiecare enzim n parte produce trei
fragmente ADN, nseamn c la nivelul fragmentului ADN supus analizei exist dou
situsuri de restricie pentru enzima EcoRI i dou pentru enzima BamHI. n urma
digestiei duble (EcoRI i BamHI), fragmentul de 3000 pb rezultat n urma digestei
doar cu EcoRI rmne intact, pe cnd fragmentele de 8500 pb i 5000 pb sunt
fragmentate. Astfel, cele dou situsuri de restricie ale EcoRI sunt la o distan de
3000 pb fr s conin un situs al BamHI, n schimb fragmentele EcoRI de 8500 pb
i 5000 pb conin fiecare cte un situs de restricie BamHI. Fragmentul BamHI de
9500

pb

este

tiat

de

EcoRI

digestia

dubl

trei

fragmente

(2500+3000+4000=9500pb). Astfel, cele dou situsuri de restricie ale BamHI se

gsesc de o parte i de alta a fragmentului EcoRI de 3000 pb, delimitnd fragmentele
de 4000 pb i 2500 pb rezultate din digestia dubl. Fragmentul EcoRI de 8500 pb este
fragmentat de BamHI n dou fragmente de 2500 i 6000 pb iar unul din situsurile
EcoRI se afl la 2500 pb de BamHI, astfel fragmentul de 6000 pb conine unul din
capetele fragmentului original de 16500 pb. Fragmentul EcoRI de 5000 pb este tiat
de BamHI ntr-un fragment de 4000 pb i unul de 1000 pb, iar un situs al BamHI se
afl la o distan de 4000 pb fa de un situs EcoRI, deci fragmentul de 1000 pb
conine cellalt capt al fragmentului original de 16500. n figura 6.5 B este redat
harta situsurilor de restricie ale fragmentului de 16500 pb rezultat n urma analizei
redat mai sus.
8

n cazul moleculelor de ADN circular modul de construire al hrilor situsurilor de

restricie este similar cu excepia c dac o enzim de restricie prezint trei situsuri de
clivare n cadrul moleculei de ADN circulare se formeaz trei fragmente. Astfel, un
plasmid de 12 kpb dac este analizat prin digestie cu enzimele EcoRI, BamHI, HindIII
i HaeII i cu combinaii luate cte dou ale acestor enzime se obin fragmentele din
tabelul 6.3 i harta situsuilor de restricie din figura 6.6.
Tabelul 6.3 Mrimea fragmentelor ADN (kpb) rezultate n urma digestiei simple i
duble a ADN plasmidial de 12 kpb cu enzimele de restricie EcoRI, BamHI, HindIII i
HaeII
EcoRI

BamHI

HindIII

HaeII

EcoRI+

BamHI+

HindIII+

EcoRI+

EcoRI+

BamHI+

12,0

12,0

12,0

6,0
4,0
2,0

HaeII
5,0
4,0
2,0
1,0

HaeII
6,0
4,0
1,5
0,5

HaeII
6,0
2,5
2,0
1,5

HindIII
6,5
5,5

BamHI
10,5
1,5

HindIII
8,0
4,0

n urma experimentelor de digestie cu enzime de restricie a unui fragment

ADN exist posibilitatea s rezulte fragmente de aceeai mrime (pb) iar suma
mrimii fragmentelor rezultate s fie mai mic dect a fragmentului iniial. n urma
electroforezei fragmentele de aceeai mrime migreaz ntr-o singur band, care este
ns mai intens colorat sau mai groas fa de celelalte fragmente, fiind un indiciu c
n urma digestiei s-au obinut fragmente identice ca mrime.
La ora actual exist programe de calculator care sunt utilizate n configurarea
hrilor situsurilor de restricie pentru fragmente mai mari de ADN care sunt cuplate la
un sistem de electroforez capilar ce poate separa fragmente ADN care difer printro singur pb.

Figura 6.6 Harta situsurilor de restricie ale enzimelor EcoRI, BamHI, HindIII i
HaeII la nivelul unui ADN plasmidial de 12.0 kpb

10