TESTE SPECIFICE

LABORATORULUI DE
IMUNOLOGIE

Evidenierea celulelor
imunocompetene n sngele periferic
Leucocitele
Intervalul de referin valori
normale:
Adult:

4-9x103/L
Nou-nscut: 9-30x103/L
La vrsta de 1 an: 614x103/L

Granulocitele neutrofile (PMN)

Interval de referin:
Adult: 1,3-5,4x103/L
45-54% din leucocite
Nou-nscut: 6-26x103/L

Neutrofile nesegmentate:

Adult < 0,7x103/L

3-5% din leucocite

Neutrofilie:

Infecii bacteriene (mai ales piogenice)

Reacii inflamatorii acute
Malignitate (leucemia cronic mieloid)
Corticoterapie

Granulocitele eozinofile

Adult: 0-0,5x103/L
7 % din leucocite
Nou-nscut: 0,02-0,85x103/L
Eozinofilie:
Boli

alergice
Parazitoze
Malignitate: limfoame
Boli imunologice sistemice: LES, vasculite

Granulocitele bazofile

Interval de referin:
Adult: 40-200x106/L
< 1% din leucocite
Nou-nscut: 640 x106/L
Bazofilia izolat este rar: boli mieloproliferative
(mai ales n leucemia mieloid cronic).

Limfocitele

Adult: 0,7-3,5 x103/L

16-33% din leucocite
Nou-nscut: 2-11x103/L
Limfocitoz:
Infecii virale acute
Pertussis
Unele infecii cu protozoare (ex.toxoplasmoza)
Leucemie

Monocitele

Adult: 0,1-0,8x103/L,
3-8% din leucocite
Nou-nscut: 0,4-3,1x103/L
Monocitoz:
Infecii
Boli mieloproliferative
Boli autoimune i vasculite
Maligniti
Tezaurismoze
Sarcoidoz

Leucocite mononucleare
(Limfocite + Monocite)

Adult: 1,5-5 x103/L

20-35% din leucocite
Limfomonocitoz:
Tipic n mononucleoza infecioas infecia
acut cu virusul Ebstein Barr Virus (EBV);
Poate apare i n alte afeciuni, cum ar fi infec ia
primar cu citomegalovirus (CMV) sau cu virusul
imunodeficienei umane (HIV).

Limfocitele T CD4+/CD8+

Valori normale
Adult: 0,4-1,5 x103/L

Raportul CD4/CD8
Normal: 0,9-3,7 la aduli
Anormal: (sczut) n infecia cu HIV/SIDA

Viteza de sedimentare a hematiilor

(VSH-ul)

VSH-ul crete cu naintarea n vrst i tinde s fie

mai mare la sexul feminin.
VSH-ul este un marker al inflamaiei.
Valori normale (mm/h):
Brbai: limita inferioar = 0, limita superioar =
Vrsta:2
Femei: limita inferioar = 0, limita superioar =
(Vrsta+10):2

Proteinele de faz acut

markeri ai inflamaiei
Proteina C-reactiv (PCR)

Valori normale < 5 mg/l

PCR este sintetizat n ficat, ca rspuns la factorii eliberai
de adipocite.
Rolul su fiziologic este de a se lega la fosfocolina
exprimat pe suprafaa celulelor moarte sau vii (i a unor
tipuri de bacterii) pentru a activa sistemul complement pe
calea complexului C1q.

Detecia anticorpilor/antigenelor

Msurarea concentraiei anticorpilor serici

(imunoglobuline n form secretat IgG, M, A i E)

Determinarea Ac specifici ndreptai mpotriva:

Toxinelor, virusurilor, bacteriilor dificil de cultivat

Creterea nivelului unui Ac specific indic expunerea la un
anumit agent patogen i poate confirma diagnosticul de infecie.

Autoanticorpii (ndreptai mpotriva structurilor proprii):

Evaluarea imunitii umorale

Organ-specifici sau sistemici

Diagnosticul bolilor autoimune

Anticorpii dau reacii de legare, precipitare i aglutinare.

Imunoglobulinele serice
- valori normale
Vrsta

IgG (mg/dl)

IgA (mg/dl)

IgM (mg/dl)

<1 lun

600-1500

1-4

6-25

1-12 luni

170-800

1-85

15-100

1-3 ani

300-1100

10-150

35-175

4-9 ani

450-1200

15-200

40-200

Adult

600-1500

45-300

50-300

Subclasele IgG
Vrsta

Subclasa 1
(mg/dl)

Subclasa 2
(mg/dl)

Subclasa 3
(mg/dl)

Subclasa 4
(mg/dl)

Adult

470-1300

115-750

20-130

2-165

8 luni

140-620

25-170

4-90

2-35

9 luni-2 ani

230-710

30-330

6-98

2-65

3-4 ani

280-880

50-440

6-110

2-115

5-6 ani

290-820

60-500

8-130

1-120

7-8 ani

300-1120

60-500

12-130

2-120

9-14 ani

300-1300

70-500

12-130

2-120

Valori normale ale autoanticorpilor (U/ml)

Test

Negativ

Echivoc

Pozitiv

Anti-SS-A (Ro)

<15

15-25

>25

Anti-SS-B (La)

<3

3-4

>4

Anti-ds-DNA

<40

40-60

>60

Anti-ss-DNA

<8

8-10

>10

Anti-histone

<25

c-ANCA

<20

p-ANCA

<5

>5

Anti-mitocondrial (AMA)

<10

>10

Factor reumatoid (FR)

<20

>25
21-30

20-30

>30

>30

Titrul Ac antistreptoliszin O
(ASLO) la precolari

>100

ASLO la vrsta colar

>250

ASOT la aduli

>125

Autoanticorpi
Test

Negativ

Slab
pozitiv

Moderat
pozitiv

nalt
pozitiv

Unitate de
msur

Anti-fosfolipidici
IgG

<20

20-30

31-50

>51

GPLU/ml

Anti-fosfolipidici
IgM

<1,5

1,5-2,5

2,5-9,9

>10

MPL/ml

Anti-fosfolipidici
IgA

<10

10-20

21-30

>31

arb U/ml

Ac anti-peptid
ciclic citrulinat
(CCP)

<20

20-39

40-59

>60

EU

Ac + Ag = AcAg

Imun-electroforeza
Aglutinare
Precipitare
Fixarea complementului
RIA
ELISA
Chemiluminescen
Nefelometrie
Western-blot

Teste de precipitare

Cnd exist suficiente molecule de antigen (Ag) i

anticorp (Ac), acestea precipit n soluie
Dac sunt prea puine molecule de antigen, se
formeaz puin precipitat.
Dac sunt prea multe molecule de antigen,
reaciile Ag-Ac nu se produc.
Exemple
Imunodifuzia: Ac i AG reacioneaz n agar,
rezultnd benzi sau inele de precipitare.
Imunelectroforeza: un amestec complex de Ag
este separat, apoi pus s reacioneze cu Ac .

Precipitarea n gel

Imunodifuzia radial simpl - Mancini

Imunodifuzia radial dubl - Ouchterlony

Imunelectroforeza
Ser anti-uman de
iepure, adugat n
godeul central

Difuzia serului anti-uman pentru a forma linii de precipitare

Ser agamaglobulinemic

Ser
normal

Imunelectroforeza

Reacii de aglutinare pentru

depistarea de Ag/Ac
Diluii ale serului

Aglutinare
Neaglutinare

Aglutinarea

Identificarea patogenilor

Ac cunoscut mpotriva unui

patogen este fixat la particule
de latex.
Amestecarea acestui latex cu
bacteriile specifice va
produce aglutinarea.

Test screening pentru Factorul

reumatoid (IgM ndreptat
mpotriva unor determinani
antigenici multipli de pe
molecula IgG).

Particulele de latex sunt

cuplate cu molecul uman
de IgG.

Testul este utilizat frecvent pentru

identificarea rapid a Stafilococoului,
Streptococului .a.

Aglutinarea

Msurarea Ac n ser
Se

efectueaz diluii seriate ale

serului (de obicei 1:2).
Se amestec diluiile cu Ag
cunoscut. Aglutinarea va fi vizibil
dac exist Ac specific. Dac Ac
este prea diluat, aglutinarea nu
mai este observat.
Diluia necesar pentru a obine
Tipizarea gr. snge: da/nu
un test negativ = Titru.
Exemplu de aglutinare.

Test Coombs
direct

Test Coombs
indirect

Mam Rh- cu ft Rh+

Hematii fetale cu
anticorpi materni

Ser
matern

Adugare de
hematii Rh+

Adugare de ser de iepure anti-uman

Aglutinare

ANTICORPII
MONOCLONALI (AcMo)

Milstein (n. 1927)

Khler (1946-1995)

AcMo premiul Nobel n 1984

Anticorpii monoclonali

Splenocite de la
oarec imunizat
cu antigenul A

Celule
mielomatoase
care nu secret
anticorpi

Fuzionare n prezen de PEG

Transfer in mediul de selecie

Hibridoamele prolifereaz,
splenocitele i celulele
mielomatoase mor.

Selectarea hibridomului util

Clonarea hibridomului util

ELISA

ELISA

Metod cantitativ imuno-enzimatic

n care unul dintre reactivi este marcat
enzimatic
ELISA clasic
ELISA sandwich

ELISA clasic

Cuantificarea Ac

ELISA sandwich

Cuantificarea Ag

Triptaza

martor de degranulare mastocitar

VN 1-10 ng/ml

10 ml snge EDTA/tub sec - 4C max

12h

bazal > 20 ng/ml mastocitoza

anafilaxie valori mult crescute

medico-legal

Chemiluminescena

Nefelometria/Turbidimetria
De la termenul grec nephele=nor
Nefelometrul este un instrument desemnat s evalueze
turbiditatea unei probe. Turbiditatea se refer la gradul n
care o raz luminoas incident este mprtiat de
particulele prezente in faza lichid.

Nefelometria/Turbidimetria: Principiu
Ser de la
pacient

Se msoar gradul de
precipitare prin
evaluarea turbiditii

Cuva de reacie
Oglind deflectoare

Oglind deflectoare

Detector turbidimetric

Surs de lumin

Detector nefelometric
(msoar radiaia reflectat la 90 )

Testele de imunofluorescen

Ac specific este cuplat cu

compui fluoresceni.
Ag se leag la Ac;
Folosirea unui microscop cu
fluorescen evideniaz
celulele Ag-pozitive.

Imunofluorescena este o modalitate valoroas de identificare specific a

autoanticorpilor. Metoda expus mai sus este imunofluorescena direct,
folosit i n detecia Ac anti-nucleari (din LES).
n imunofluorescena indirect, este folosit un Ac fluorescent ndreptat
mpotriva unui alt Ac.

Imunofluorescenta

Imunofluorescen direct

Imunofluorescen indirect
- Realizeaz o amplificare a semnalului

Tipuri de substraturi:

Sobolan, cel mai discutabil din cauza anticorpilor heterofili.

Acestia sunt anticorpi umani care se leaga nespecific la
tesutul animal
Soarec cel mai utilizat, raport bun calitate-pret
Maimuta bun (antigene similare cu omul) , mai scump,
poate da insa aspecte fals pozitive datorita infiltrarii cu Ig
similar umane
Om- aparent ideal, dar Ig umane pot da aspecte deformate
Solutia optima substrat de maimuta combinat cu conjugat
anti-Ig specific uman

Tesuturile de rozatoare nu exprima exact autoantigenele umane

Tesuturile de maimuta sunt infiltrate cu Ig cvasi-umane

Tesuturile umane sunt infiltrate cu Ig umane

Solutia ideala

Tipuri de substraturi
Pentru ANA Hep-2
Pentru SMA, AMA, AGPC, LKM combinatie de ficat,
rinichi, stomac de soarece
Pentru anti-endomisium si boli buloase esofag de
maimuta
Pentru anti GBM (sdr. Goodpasture) rinichi de maimuta
Pentru dsDNA (nDNA) - Crithidia luciliae
Pentru ANCA Neutrofile umane fixate in etanol

Pemfigoid esofag de maimuta

Se admite o deviere de +/- o dilutie, datorita opiniei diferite a

specialistului care citeste

RIA
Cuantificarea IgE
total/specific IgE.
1 kUI/l = 2,4 g/l

IgE serice - valori normale

Vrsta

IgE (U/ml)

<3 luni

<1,5

3-11 luni

<15

1-5 ani

<60

6-14 ani

<90

10-15 ani

<200

Adult

<100

WESTERN BLOT
IMUNOBLOT

Western Blot
Acest test poate detecta o protein ntr-o mixtur de
proteine, oferind i informaii despre mrimea proteinei.
n laboratorul clinic, Western Blot este utilizat pentru
confirmarea dg. de infecie HIV, sugerat de o testare ELISA
pozitiv.

Western blot electroforeza

proteinelor i transferul pe membran

Proteinele din mostra de analizat sunt separate n funcie de

greutatea molecular n gel de poliacrilamid. Proteinele din
gel sunt transferate ulterior pe o membran de nitroceluloz,
prin aplicarea unui curent electric.

Gel de
poliacrilamid

Membrana
de transfer

Gelul dup
Transfer pe
Electroelectroforez membran
foreza

Immunoblot indirect pentru detectarea unei

proteine specifice pe un western blot
1. Blocare
2. Augarea Ac primar
3. Adugarea Ac secundar
4. Marker de
detecie
Proteina X

Membran de nitroceluloz

Western Blot n diagnosticul

infeciei cu HIV
Disocierea
proteinelor cu
SDS

Western Blot n diagnosticul

infeciei cu HIV

Western Blot n diagnosticul

infeciei cu HIV

Evaluarea sistemului complement

Complementul: proteine circulante activate n

cascad, implicate n imunitatea umoral.
Deficienele complementului predispun la infecii i la
boli autoimune.
Nivelele serice ale componentelor complementului
reflect o balan nte sinteza i catabolismul acestora .
Hipocomplementemia apare dac concentraia C3 sau
C4 scade sub valoarea normal:
C3 = 75 - 161 mg/dL
C4 = 16 - 47 mg/dL

Evaluarea sistemului complement

Majoritatea cazurilor de hipocomplementemie sunt

asociate cu hipercatabolism (consum crescut al
complementului) datorat activrii sistemului imunitar, mai
degrab dect cu producie sczut.
Majoritatea bolilor asociate cu complexe imune circulante
(CIC) coninnd IgM sau IgG pot cauza
hipocomplementemie: LES, artrit reumatoid, vasculite,
endocardit bacterian subacut, antigenemie HBs,
infecii pneumococice, sepsis cu Gram-negativi, infecii
virale (ex. rujeol), crioglobulinemie mixt.
Intervalele de referin sunt relativ largi, de aceea
rezultatele trebuie interpretate n dinamic (rezultatele
actuale de comparat cu cele anterioare), mai degrab
dect prin raportare la intervalul de referin.

Evaluarea sistemului complement

Activitatea hemolitic a complementului 50% (CH50)

Interval

de referin: 100-250 UI/ml

CH50 msoar abilitatea serului pacientului de a liza 50%
dintr-o suspensie standard de eritrocite de oaie cuplate cu
Ac de iepure. Toate cele 9 componente ale cii clasice de
activare a copmlementului sunt necesare pentru a ob ine
o reacie normal.
Poate fi util n caz de suspiciune a unei deficien e a
sistemului complement, sau pentru monitorizarea terapiei
n boli produse prin complexe imune i consum de
complement (ex. nefrita lupic).

Testul de fixare a complementului

Testul de fixare a complementului

Testul de fixare a complementului

Testul de fixare a complementului

Inhibitorul de C1-esteraz(C1-INH)

C1-INH

C1-inhibitorul (C1-INH, C1 esterase inhibitor) este un inhibitor

proteazic aparinnd familiei serpinelor.
Funcia sa principal este aceea de a inhiba sistemul
complement, pentru a preveni activarea spontan.
C1-INH are rol inhibitor i asupra proteazelor cii fibrinolitice,
coagulrii i kininelor.
C1-INH este cel mai important inhibitor fiziologic al kalikreinei
plasmatice, fXIa i fXIIa.
Valori normale pentru activitatea C1-INH: 70-130%.
Reducerea activitii C1-INH (<10-35%): angioedem dobndit sau
ereditar.
Pacienii cu engioedem dobndit au i valori sczute ale C1q.

Citometria n flux

Aparatura de citometrie n flux

Exist patru mari categorii de componente ale unui
flow citometru:
Fluide
Optice
De detecie
Electronice
nelegerea modului de funcionare a unui flow
citometru este esenial pentru proiectarea i
realizarea experimentelor de citometrie n flux.

Citometria n flux componentele fluide

Suspensia de analizat este injectat ntr-o camer cu
coninut lichidian. Proba poate conine celule sau alte
particule, suspendate ntr-un mediu tampon, de obicei PBS.
Densitatea suspensiei: 105 - 107 celule / ml.
Dup principiul fluxului laminar, proba rmne n centrul
fluidului.
Celulele din prob sunt accelerate i trec individual printr-o
raz laser pentru analiz.

Celulele sunt
prezentate razei
LASER pe baza
focalizrii
hidrodinamice.
Fluorescen

Raz LASER
focalizat

Injector

n momentul trecerii prin laza

laser, celula reflect lumina
incident.
Dou regiuni importante de
detecie a luminii mprtiate:
1

Forward-Scattered Light (FSC),

2 - 20 (FSC), gradul de
mprtiere depinde de mrimea
(suprafaa) celulei.
Side-Scattered Light (SSC), 90,
gradul de mprtiere depinde
de structura celulei (granularitate
i complexitate intern).

Lumina mprtiat

Forward Angle Light Scatter

(lumina mprtiat frontal)

Laser
FALS Sensor

Side Light Scatter

(lumina mprtiat n lateral)
Laser
FALS Sensor

90o LS Sensor

Fluorescena

n aparatele moderne, mai mult de un laser este focalizat

asupra fluxului de analizat.

Astfel, celulele pot fi msurate nu numai dup mrime i

granularitate, dar i pe baza intensitii semnalului
fluorescent.

Fluorescena celulelor este obinut prin utilizarea unor

colorani numii fluorocromi.

Anticorpii recunosc molecule

specifice de pe suprafaa
celulelor,
FITC

Imunofluorescena

FITC
Anticorpi

Anticorpii sunt conjugai artificial cu

molecule fluorescente.

FITC

FI

TC

FITC

C
FIT

dar nu i altele.

Cnd aceste celule trec prin faa razei LASER,

doar cele care exprim molecula de interes vor
manifesta fenomenul de fluoresen.

Fiecare celul genereaz un cuantum de fluorescen

PE FL

FITC FL

488nm SSC

LASER

Filtre
discriminatoare
Lentile dicroice

Lentile confocale

Detector FSC

Celulele negative sunt de asemenea contabilizate

PE FL

FITC FL

488nm SSC

Lentile dicroice
Lentil confocal

LASER

mprtier
e frontal
a luminii

Tipuri de filtre optice

Wavelengths
LONG (700nm)

Short Pass

Long Pass

Band Pass

SHORT (500nm)

650 Short Pass

(600SP)

550 Long Pass

(650LP)

600/100 Band Pass

(600/100)

Transmitted

<650 nm

>550 nm

550 - 650 nm
(60050)

Blocked

>650 nm

<550 nm

<550 nm & >650 nm

Pass Through
Filters

LONG (700nm)

Dichroic
Filters
SHORT (500nm)

Transmitted
Diflected 90

650 Short Pass

(600SP)
<650 nm
>650 nm

550 Long Pass

(650LP)
>550 nm
<550 nm

Spectrul de emisie al diferiilor fluorocromi

utilizai

Generarea semnalului
electric
t

1.

Laser
Voltage

2.

Laser
Voltage

t
Laser

3.
Voltage

nlimea pulsului (H)

Voltaj

Caracteristicile pulsului electric sunt determinate de

mrimea particulei, de viteza ei i de intensitatea
fluorescenei.
Aria pulsului
(A)

40
Lrgimea
pulsului (W)

Timpul (s)

Analiza datelor

Semnalul electric este amplificat i digitalizat.

Diversele semnale primite de la fiecare celul sunt stocate.

Se efectueaz analize la nivel populaional.

Prezentarea grafic

Histograme bazate pe un singur parametru

Pozitiv
Negativ
Numr

Strlucitor

Slab fluorescent

1 2 3 4 6 7

150 160 170 .. 190

Canalul detector
Fluorescena detectat n canalul PE

Histograme cu 2 parametri
Populaie dublu
pozitiv

Populaie
pozitiv PE

PE FL

Populaie
negativ

FITC FL

Populaie
pozitiv FITC

Sortarea celulelor
Pressurized Cell
Sample

488nm Formard Light Scatter Detector

Ultrasonic
Transducer

Collimated Light Path Through

Dichroic and Band Pass Filters

Pressurized
1X
PBS(Sheath)

PMTs

Pulse Height
(0-10Volts)
Analog Data
Time(useconds)
SS

FL1

FL2

FL3

FL4

Ce putem msura prin

citometria n flux?

Parametri celulari evaluai prin

citometria n flux
Extrinseci

Intrinseci

Nu sunt necesari ali reactivi

(Structural)

Mrimea celulei (FSC)

Granularitatea (SSC)
Pigmeni intrinseci

Sunt necesari reactivi.

Structural
Coninutul ADN
Raportul dintre baze ADN
Coninutul ARN

Funcional

Molecule de suprafa
Sinteza de ADN
Apoptoza
Ca++ citoplasmatic
Expresia genic
Producia de citokine

Imunofenotiparea
CD4

CD3

Limfocite T CD4+

Valori normale
Adult:

0.4-1.5 x103/L

CD4/CD8
Normal: 0.9-3.7 la aduli
Anormal: (scderi) la pacienii cu infecie
HIV/AIDS

Utilizarea analizei multiparametrice

Fenotipare (evidenierea antigenelor celulare de suprafa)

Peste

300 de molecule CD

Multe

populaii funcionale necesit 5 sau chiar mai

muli markeri de suprafa pentru a fi bine definite

Lymphocytes in Blood
B cells

T cells

CD5

CD5+

CD23+
CD23
CD45RB+
CD45RB

CD4CD8

TH (CD4+)
Memory
CD11a+
CD11a
CD45RA+

NK cells

Naive

CD4+
CD4

Naive

CD60+
CD60

CD11a+

CD60+
CD60

CD11a

CD57+
CD57

CD8 dim

TC/S (CD8+)
Memory

CD45RA+

CD16+CD56
CD16+CD56+
CD16CD56+

CD60+
CD60
CD60+
CD60
CD57+
CD57

T cells
V2
V1

V9+
V9

Principalii markeri de suprafa

detectai de flowcitometrie

Hematologie - Imunofenotiparea
leucemiei acute mieloide

Stnga: discriminare ntre populaii leucocitare din sngele periferic. Regiunea Alimfocite mature; regiunea B-monocite mature; regiunea C-granulocite mature; regiunea
D-celule mieloide imature.
Dreapta: populaia din regiunea D din graficul din partea stng exprim CD13, un
marker mieloid, i CD34, un marker de celule stem. Co-expresia acestor markeri n
sngele periferic este nalt sugestiv pentru o leucemie acut mieloid.

Tete funcionale pentru Limfocitele B i T,

teste funcionale ale neutrofilelor i celulelor NK
n anumite circumstane clinice este important s evalum i funcia unor
celule, nu doar s le numrm sau s le caracterizm morfologic.
Se poate recurge la purificarea unor populaii celulare i cultivarea lor,
urmat de evaluarea proprietilor n cultur i a rspunsului la diver i stimuli.

Evaluarea funcional a celulelor NK

Linia eritroleucemic K562, sensibil la ac iunea NK,

este incubat cu PBMC. Dac NK con inute n PBMC
sunt active, vor liza celulele K562.
50 microL snge integral + 50 microL K562. Incubare
la 37 de grade 2 ore in mediu cu 5% CO2. Marcare cu
anti CD71, specific pentru K562
Liza hipotona a hematiilor, spalare (va indeparta si
resturile lizate de K562, raman K562 viabile).
Evaluare flow-citometrica, prin comparare cu martor.

Evaluarea funcional a
PMN periferice
PMN separate prin sedimentare pe dextran,
centrifugare pe Ficoll i liza hipoton a
hematiilor sunt expuse la E. Coli marcat cu
FITC i la DHR (dihidrorodamin). Aceasta
devine fluorescent i msurabil prin
citometrie n flux dac PMN produc RLO.
Grafic FITC vs. DHR.

Populaie dublu
pozitiv

DHR
FL

Populaie
negativ

FITC FL

Populaie
pozitiv FITC

Testul cu Nitroblue tetrazol

La pacientii normali, PMN si Monocitele SRO sunt activate de fagocitoza si
NBT este convertit in forma rosu-albastru(1). Pacient cu BGC. NBT ramane
predominant in forma portocalie (2).

Metode de izolare celular

Flow-citometru cu modul de sortare

Separarea pe coloane, utiliznd anticorpi cupla i
cu molecule feromagnetice
Separea prin metoda Ficoll-Hypaque

Separarea pe coloane,
utiliznd anticorpi cuplai
cu molecule
feromagnetice

Separea prin metoda Ficoll-Hypaque

Culturi celulare
Celulele obinute prin metodele descrise mai sus pot fi cultivate.

n cultur se pot aduga mitogeni i se poate testa activarea populaiei

limfocitare prin ncorporarea unor substane radioactive (timidin tritiat).
Timidina radioactiv este ncorporat n celulele aflate n diviziune dup
stimulare.
Celulele din cultur sunt trecute prin hrtie de filtru care le re ine.
Supernatantul culturii este ndeprtat.
Radioactivitatea hrtiri de filtru este evaluat la un beta-counter.

Evaluarea funcional a LT
Snge integral diluat n mediu de cultur
Se adaug mitogeni/antigeni pentru LT
Incubare 7 zile
Marcare cu anti CD3/CD4, liza hematiilor, splare
Analiz pe flow-citometru

Evaluarea funcional a LT (diviziuni)

V MULUMESC!