Biologie Moleculara

Investete n oameni!
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Tehnici de biologie moleculara

Expert Dr Maria Comanescu Expert Dr Codruta Lazureanu Expert Dr Raluca Balan
Activitatea A.1.4.: Rolul angajatilor cu studii medii din laboratorul de anatomie patologica 24-27 noiembrie 2011, Sinaia
Investete n oameni!
Definitie
Un tehnician de biologie moleculara efectueaza analize complexe moleculare pentru diagnosticul, tratamentul si prevenirea bolilor. Un loc de munc de Tehnician de Patologie Moleculara se ncadreaz n categoria mai larg de tehnician de laborator medical.
Investete n oameni!
Dinamica pietei justifica o noua profesie?

Da. De fapt, poate mai mult dect una. Modelul tradiional linear pacient clinician patolog tehnician este perturbat de aparitia unor forme inovatoare de livrare a produselor medicale, cresterea costurilor medicale si pacientii mai solicitanti, DAR MAI ALES noi tehnologii. CAND? UNDE? CINE? Necesare relatii noi ntre profesii si schimbarea calificarii.
Investete n oameni!
Molecular Science 32% Molecular Techniques 40% Applications of Molecular Testing 28%
Investete n oameni!
Nivelul de cunostinte
- ntelegere a principiilor care stau la baza stiintific a testelor de laborator, precum si a aspectelor procedurale, tehnice si de rezolvare a problemelor. - Intelegere general a mai multor factori care afecteaz sntatea si boala, - recunoaste importanta selectiei unor metode de testare corespunztoare, - identificarea numeroaselor cauze ale rezultatelor discordante ale testelor - coreleaz date de laborator anormale cu stari patologice, - determin validitatea rezultatelor testelor, - ntelege si impune regulile de sigurant, - urmeaz codul etic de conduit profesionala.
Investete n oameni!
Competente tehnice
Efectueaz o gam complet de proceduri de biologie moleculara. Participa la evaluarea de noi tehnici si proceduri n laborator.
este capabil sa realizeze teste standard, complexe i de specialitate. Stabilirea sau monitorizarea programelor de asigurare a calitii sau activiti pentru a asigura exactitatea rezultatelor de laborator. operareaza, calibreaza, sau menine echipamentele utilizate n analiza cantitativ sau calitativ. este capabil sa participe la introducerea, investigarea i punerea n aplicare a noi proceduri i n evaluarea de noi instrumente. nelege tehnicile preventive de ntreinere pentru a asigura funcionarea corect a laboratorului. Introduce datele obtinute n calculator pentru a fi pstrate. furnizarea de informaii tehnice despre rezultatele testelor la medici sau cercettori. Taierea, colorarea si montare materialului biologic pe lame pentru studiul microscopic i de diagnostic, n urma unor proceduri standard de laborator.
Investete n oameni!
Rezolvarea problemelor si luarea deciziei analitice Evalueaza si rezolva problemele legate de colectarea si prelucrarea probelor biologice pentru analize. Diferentiaz si rezolv cauzele tehnice ale unor rezultate neasteptate. Are capacitatea de a demostra initiativ si judecat independent, n domeniul de aplicare larg a problemelor procedurale si tehnice. Este capabil s participe la, si ii poate fi delegata responsabilitatea pentru deciziile care implic: control al calitii / programele de asigurare a calitii, metodologia de selectie a probelor Activitatea A.1.4.: procedurile de sigurant Rolul angajatilor cu studii medii din achizitii reactivi laboratorul de anatomie patologica
24-27 noiembrie 2011, Sinaia
Investete n oameni!
Comunicare
Ofer servicii de consultant tehnic si administrativ cu privire la testele de laborator. Comunic informatiile tehnice, cum ar fi rspunsul la solicitri cu privire la rezultatele testului, metodologia, specificitatea de testare si de sensibilitate si factorii specifici care pot influenta rezultatele testului pentru profesionistii din domeniul snttii si a altor consumatori.
Investete n oameni!
Implicarea in patologie moleculara
Etapa preanalitica FISH CISH Extractie ADN, ARN PCR Amplificare familiarizare cu metoda Etapa postanalitica electroforeza QC Echipament asigurarea functionalitatii Administratie laborator si achizitii asigurare stocuri
Investete n oameni!
Gena Her2/neu (human epidermal growth factor receptor-2gene)
Protooncogena situata pe cromozomul 17 cunoscuta si ca CerbB 2 Codifica o glicoproteina transmembranara p185, receptorul Her2 cu 3 domenii, cu activitate tirozinkinazica factor de crestere
Investete n oameni!
Metode de Biologie Moleculara
Pentru determinarea amplificarii genei Her 2 neu din cancerul de san sunt utilizate doua metode de de hibridizare: FISH (FLUORESCENT IN SITU HIBRIDIZATION) CISH (CHROMOGEN IN SITU HIBRIDIZATION)
Investete n oameni!
Reactiile de hibridizare in situ
Localizeaza secvene specifice de DNA / RNA n esuturi, prin hibridizarea acestora cu o prob (sond) complementar de acid nucleic. In cazul FISH sonda este marcat cu un fluorocrom i vizualizat la microscopul de fluorescenta sau cu un cromogen i vizualizat la microscopul cu lumina normala (CISH = chromogenic in situ hybridization). Materialul utilizat Materialul utilizat in cazul acestei tehnici este reprezentat de blocurile de parafin, din care se taie sectiuni fine, pe lame incarcate electrostatic sau silanizate.
Investete n oameni!
Her 2neu- kituri comerciale disponibile
F VYSIS PathVysion HER2neu kit DAKO - HER2 FISH pharmDx Kit I VENTANA - INFORM HER-2/neu Probe Kreatech S Zytovision C H Invitrogen SPoT-Light HER2 Probe I Kreatech S - SPoT-Light HER2 Probe ZYMED Zytovision H
Activitatea A.1.4.:
Rolul angajatilor cu studii medii din laboratorul de anatomie patologica 24-27 noiembrie 2011, Sinaia
Investete n oameni!
FISH (FLUORESCENT IN SITU HIBRIDIZATION)

Tesut tumoral mamar Inclus la parafina
CEP17 HER2
Hibridizare cu probe fluorescente gena HER2 Centromerul cromozomului 17 (CEP17)
CEP17
HER2
Analiza microscopica a semnalelor fluorescente (numararea copiilor genei)
Investete n oameni!
Schema hibridizarii
Investete n oameni!
Echipamente folosite pentru FISH

Pentru efectuarea etapelor de denaturare si hibridizare se utilizeaza: Placa de hibridizare Invitrogen, care are o capacitate de 12 lame Baia de apa Memmert, Microscop cu fluorescenta Nikon E 800
Baie apa MEMMERT Placa hibridizare INVITROGEN Microscop NIKON E800
Investete n oameni!
Factori care influenta eficienta reactiei de hibridizare

A. Factori care tin de etapele de prelucrare ale tesutului Tipul fixatorului utilizat Temperatura de fixare Perioada de fixare Timpul si temperatura de parafinarea tesutului Vechimea lamelor cu sectiuni Grosimea sectiunii
Investete n oameni!
Factori care tin de parametrii reactiei de hyb

Temperaturile de lucru PH- ul solutiilor de lucru Conditiile de HYB Proba utilizata : AND, ARN greutate moleculara concentratie contine dextran sulfat(aditiv folosit pentru realizarea probelor de hibridizare cu rolul de a accelera reactia de hyb)
Investete n oameni!
Conditii minime si optime pentru realizarea FISH- factori care tin de prelucrarea biopsiei
Se folosesc biopsiile fixate in formol 10%, alti fixatori nu sunt corespunzatori pentru pastrarea integritatii AND ( formaldehida 37% 1o ml + 90ml AD se amesteca foarte bine) Fixare 18- 48h, pentru pastrarea intacta a AND si pentru obtinerea unor semnale de hibridizare optime O fixare mai mare de 48h in formol sau in alt tip de formol poate duce la reducerea intensitatii semnalelor de hibridizare. Un timp prea scurt de fixare a AND in formol la temperatura camerei, determina pierderea acestuia in solutia de fixare, prin scurgere Un timp de fixare prea mare, determina distrugerea ADN
Investete n oameni!
Parafinarea biopsiilor
Tesutul trebuie impregnat cu parafina la 60 C, o temperatura mai inalta duce la alterarea tesutului si implicit la degradarea ADN, astfel ca fixatorul ramas in tesut poate reactiona, fiind posibila formarea legaturilor incrucisate intre proteine si fixarea ADN Tesutul fixat corespunzator si inclus in prafina se pastreaza la o temperatura de 20- 25 C Se taie sectiuni foarte fine de 4-6 m Sunt utilizate lame speciale silanizate sau lame incarcate electrostatic, daca se utilizeaza lame normale sectiunile se vor desprinde, datorita temperaturilor inalte cerute de protocolul de lucru Aceste lame pot fi pastrate si utilizate pentru reactiile de hibridizare intre 4- 6 luni de la sectionare la o temperatura de 20- 25 C Nu se pot utiliza lame mai vechi de 6 luni, calitatea ADN in timp scade si semnalele de hibridizare dispar sau sunt foarte slabe Este recomandat utilizarea lamelor cu sectiuni taiate recent\
Investete n oameni!
Conditii minime si optime pentru realizarea FISHProiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013 etape ISH
PREHIBRIDIZARE- pregatirea tesutului pentru hibridizare, permeabilizarea acestuia , in vederea patrunderii sondei in celula Cuprinde: Tratare cu H Cl care solubilizeaza proteinele nucleare, extrage proteinele matricei extracelulare, proteine care limiteaza accesibilitatea sondei la tesut si determina autofluorescenta Pretratarea termica- se foloseste solutie de pretratament incalzita in prealabil la o temperatura de 80- 82 grade C, 30 min, pentru a denatura proteinele si de a distruge legaturile dintre acestea, in vederea realizarii unei digestii optime. Digestie enzimatica cu proteinaza K, 3 minute ,37 C, cu rol de a distruge proteinele din tesut si faciliteaza patrunderea sondei (probei) la secventa de ADN de interes O digestie prelungita determina distrugerea tesutului, degradarea AD N- ului Semne de supradigestie- pierderea progresiva a coloratiei la DAPI, pana la aparitia unor gauri in nucleu prin pierderea totala a ADN. Conturul nuclear foarte neregulat. Denaturare- separarea celor 2 catene de ADN, 2 min 72C, utilizand placa de hibridizare
Investete n oameni!
Etape ISH
HIBRIDIZAREA- se adauga sonda pe lama si ramane la incubat 18-20 h, la 37 C etapa realizata cu ajutorul placii de hibridizare POSTHIBRIDIZARE- cuprinde spalarile posthyb, la o temperatura de 74 C, 2 minute,pentru indepartarea sondei nehibridizate O spalare inadecvata, ca timp si temperatura duce la aparitia unui background, fiind imposibila citirea reactiei de HYB Se utilizeaza baia de apa Memmert pentru aceasta etapa Montare in DAPI pentru vizualizarea cromatinei Vizualizarea lamei si interpretarea reactiei de hibridizare la microscopul de fluorescenta
Investete n oameni!
Investete n oameni!
Examin are in UV
DAPI - cromatina
Scor: analiza standardizata conform protocolului Vysis Se numara 60 de nuclei tumorali

Se face raportul sumei semnalelor rosii cu cele verzi Un raport peste 2 inseamna amplificarea genei Her2/ neu (zona borderline 1,8-2,2)
CEP 17
Her -2
Investete n oameni!
Neamplificat Raport CEP 17/ Her2 neu < 2
Investete n oameni!
Amplificat
Investete n oameni!
Amplificat
Investete n oameni!
Neamplificat
Investete n oameni!
>2 cromozomi 17 nr gene Her2 crescut prin cresterea nr cromozomi ihc 3+ FISH negativ
Polis omi e
Investete n oameni!
PROBLEME DE SCORIFICARE FISH

Material tumoral scorificabil redus: Carcinom microinvaziv / zone restranse invazie Tumori tratate preoperator (carcinoame reziduale) Blocuri prelucrate deficitar
Investete n oameni!
Metoda Cish
Tehnica CISH (Chromogenic in situ Hybridisation) este asemntoare tehnicii FISH, ca substrat cromogen folosindu se DAB (diaminobenzidina), ns prezint cteva caracteristici: Semnalele CISH corespunztoare amplificrii genice HER2 pot fi vizualizate ca semnale individuale sau grupuri de semnale de culoare brun la nivelul nucleului. Gena HER2 nealterat este definit printr-un numr de 1-5 semnale/nucleu, Un nivel nalt de amplificare genic, printr-un numr de peste 10 copii ale genei, Iar un nivel sczut printr-un numr de 6-10 copii, In ambele cazuri aceste semnale interesnd peste 50% din celulele tumorale. Semnalele CISH sunt uor de vizualizat, se utilizeaz lumina normal a microscopului, iar lamele CISH pot fi stocate timp ndelungat la temperatura camerei fr ca semnalele CISH s fie alterate. Tehnica CISH fiind o metod deosebit de util pentru determinarea genei HER2 si nu numai, care poate nlocui cu succes tehnicile uzuale de FISH si IHC. Amplificarea genelor, poate fi vizualizat n contextul morfologiei esutului nconjurtor.
Investete n oameni!
CISH (CROMOGENIC IN SITU

HIBRIDIZATION)
CEP17
HER2
CEP17
HER2
CEP17
HER2
Investete n oameni!
Protocol
Deparafinare Pretratament cu solutie de pretratare 15 minute la 98 grade Celsius Digestie enzimatica cu proteinaza k- 5 minute la temperature camerei Denaturare la 95 grd. timp de 5 minute Hibridizare la 37 grade celsius 18- 20 h Imunodetectia prin adaugarea secventiala de anticorpi la digoxigenina si conjugat peroxidaza de hrean- polimer (HRP) Culoarea este dezvoltata prin reactia HRP legat cu cromogenul DAB si substratul H2O2 Pentru identificarea morfologiei tesutului se coloreaza cu hematoxilina Mayer Semnalul genei Her 2 neu apare sub forma unui punct unic, maro inchis, 1- 5 puncte maro / celula tumorala- reactia este negativa, atunci cand apar aglomerari de puncte sau mai mult de 5, reactia este interpretata ca si pozitiva- amplificarea genei. Lama poate fi arhivata si pastrata mai mult timp, ca orice lama de imunohistochimie, pastrandu si in timp semnalul
Investete n oameni!
Avantaje /dezavantaje FISH /CISH

CISH _ _ _ + + + + +
FISH Sensibilitate + Probe multiple + Rezolutie + Autofluorescenta _ Microscop Special _ Conditii de pastrare _ Costuri _ Timp de evaluare _
Investete n oameni!
CISH / FISH Cocordanta 85% -100% CISH mai ieftin studii suplimentare
Investete n oameni!
Etapa preanalitica
Primirea necesar o nregistrare ntr-o baz de date cu caracteristici de securitate bine definite Buletinul de analiz HP +/- alte teste existente > nu neaparat treabatehnicianului DAR Identificarea pacientului Verificarea probei
Investete n oameni!
Afecteaza expresia profilelor genice la nivel proteic si de mARN. Atentie sporita in ceea ce priveste perioada de fixare respectarea standardelor. Procesarea tesuturilor de obicei automata. DAR parametrii ce afecteaza aceasta etapa sunt timpul, temperatura ex timpuri mai lungi de procesare = calitate mai buna a ARN-ului - in absenta unui proces de deshidratare intens, apa reziduala poate fi retinuta in tesuturi cu hidroliza ulterioara a ARN-ului. Activitatea A.1.4.:
Investete n oameni!
Sectionarea
Pstrarea probelor se prefer secionarea blocurilor de parafin cu puin timp nainte de efectuarea analizelor Manipularea probelor se face n zone bine definite, cu instrumente dedicate procedurilor de biologie molecular Pregtirea seciunii Se lucreaz permanent cu mnusi Cuitul de microtom se schimb dup fiecare utilizare Pescuirea se face pe ap distilat Nu se amestec probele pentru biologie molecular cu altele Intotdeauna se taie si o sectiune pentru HE, chiar dac exist lame anterioare colorate Se utilizeaz tuburi Eppendorf sterile
Activitatea A.1.4.:
Investete n oameni!
Microdisectia
- acuratetea si reprodictibilitatea analizei moleculare depinde de selectionarea corecta a materialului de studiu. - Microdisectia manuala: metoda cea mai simpla se razuieste cu o lama sterila de bisturiu sau un ac steril de pe o lama necolorata
Investete n oameni!
- Intai se examineaza o sectiune HE si se marcheaza pe lama zona de interes -> - Sectiunea succesiva necolrata se deparafineaza cu xilen si se deshidrateaza - Se suprapune peste cea colorata si se razuieste zona de interes. Numarul de sectiuni tisulare depinde de aria tisulara, grosimea sectiunii si tipul de analiza.
Investete n oameni!
IEFTINA (consumabile, echipament) SCUMPA (timp, depinde de abilitatile executantului) Dificil de obtinut celule in totalitate fara contaminare
Investete n oameni!
TMA - Includerea intr-un singur bloc de parafina cu mai multe fragmente tisulare de la pacienti diferiti (anterior prelucrate si incluse la parafina). - Inainte de recoltare este necesara definirea actiunilor ulterioare
- Ex. ?= caracterizarea patternului general de expresie nu conteaza zona de recoltare - Ex. ?= comparatie intre zone tumorale si peritumorale
- Pentru a depasi problema heterogeneitatii tisulare este recomandabila efectuarea de multiple recoltari - Noile blocuri sunt utilizate pentru extractie de ARN, ADN si proteine deparafinarea si digestia tisulara se efectueaza direct in tub. Activitatea A.1.4.:
Investete n oameni!
Investete n oameni!
Manual
Semi-Automatic
Automatic
Beecher Instruments, USA
Computer-Assisted
Integrated Systems Engineering, Italy
International, USA
Chemicon
Instruments, USA
Alphelys, France
Beecher
Investete n oameni!
Microdisectie laser - Reprezinta automatizarea metodei manuala si utilizarea instrumente pe baza de laser. - Pregatirea lamelor depinde de aparatul si consumabilele folosite.
- De obicei prima si ultima sectiune se pescuiesc pe lame de sticla si se coloreaza HE, iar cele intermediare pe mebranele speciale
- Deparafinare+colorare - Microdisectie si captura in tuburi sterile - Digestie

Investete n oameni!
Investete n oameni!
Extractia de acizi nucleici

- sectionarea lama noua curata, microtom curatat cu xilen ->tuburi sterile - Deparafinarea - Digestia cu proteinaza K si extractia ADN
Investete n oameni!
Extractia ARN
- Procedeu similar ADN - Precautii speciale:
Macromolecul extrem de instabil Etanol 100% pentru curarea mesei de lucru Mnusile se schimb des Utilizare de materiale sterile, ARN-free (! Autoclavarea nu ndeprteaz ARN-aza) Sticlria, pipetele si tampoanele utilizate trebuie s fie dedicate experimentelor ARN Reactivii se cantaresc prin scuturarea lor direct din sticle pe balanta acoperita cu o folie noua de aluminiu
Investete n oameni!
PCR
Tuburi si reactivi etichete Se evita intrarea in camera de preamplificare dupa ce a fost intr-o camera unde au existat materiale potential contaminante Toate consumabilele inclusiv papetaria sunt dedicate fiecarei camere. Toti reactivii PCR se alicoteaza. Tuburile se centrifugheaza inainte de deschidere, se deschid si se inchid cu grija pentru a evita raspandirea aerosolilor. Toate mesele de lucru se curata dupa fiecare utilzare; suplimentar se poate utiliza o lampa UV pentru decontaminare. Ariile decontaminate
Investete n oameni!
Flux de munca unidirectional de la curat la contaminat si nu invers. Zona de extractie Zona de amplificare Zona de interpretare gel de agaroza, sisteme de detectie zona contaminata
Investete n oameni!
Extractia de ADN genomic Metoda de extractie a ADN-ului a fost bazata pe kit-ul QIAamp.Tissue Kit (QIAGEN, BIOTRADE, Austria), conform recomandarilor producatorului. O prima etapa presupune deparafinarea probelor: - se aplica un tratament succesiv de 3 bai de xilen; initial se mixeaza viguros, se centrifugheaza si se indeparteaza supernatantul la fiecare trecere; - indepartarea xilenului se face similar, folosind etanol 100%; - eliminarea alcoolului se face prin evaporare Peste proba deparafinata si uscata se adauga 180 l tampon ATL si 20l proteinaza K (20mg /ml), se vortexeaza bine timp de 20 sec si se incubeaza peste noapte la 56 0C, pe baie de apa. Se adauga peste proba 200l AL si se incubeaza 15 min la 70 0C, pe baie de apa. Se adauga apoi 200l etanol 100% si se centrifugheaza. Supernatantul este transferat pe coloane. ADN-ul se lasa sa se adsoarba pe o membrana siliconata QIAamp, cu o scurta centrifugare (1 min, 12 000 rpm).
Investete n oameni!
Etapa urmatoare presupune realizarea a doua spalari succesive cu 500 l tampon AW1 si, respectiv, AW2. Se adauga 200l buffer de elutie AE, preincalzit la 70 0C intr-o coloana. Se incubeaza 5-15 min la temperatura camerei. Dupa centrifugare 1 min la 12 000 rpm elutia se transfera intr-un nou tubulet; se face o noua centrifugare, 5 min, la 12.900 rpm Proba astfel obtinuta se poate stoca la 20 0C Determinarea puritatii si a concentratiei ADN-ului- prin spectrofotometrie in UV-cu nanodrop ACTGene ASP-3700
Investete n oameni!
Separarea produsilor PCR electroforeza in gel de agaroza 2-4% Vizualizare in UV dupa colorare ADN Bromura de etidiu Fotografiere cu camera foto Olympus
Investete n oameni!
Electroforeza in gel de agaroza Este utilizata pentru separarea fragmentelor de ADN in

functie de dimeniunile lor Acizii nucleici sunt incarcati negativ la un ph de 8si sunt miscati printr-o matrice de agaroza de catre un camp electric (electroforeza). Fragmentele mai mici migreaza mai repede decat cele mari Distanta migrata in gel este invers proportionala cu log greutatii moleculare
Investete n oameni!
Scopuri - stabilirea eficacitatii amplificarii PCR - cuantificarea sau izolarea unui anumit produs PCR - estimarea dimensiunilor moleculelor de ADN ca urmare a a digestiei enzimelor de restrictie -stabilirea integritatii acizlor nucleici Colorantul cel mai frecvent utilizat pentru evidentierea benzilor de ADN si ARN in gelul de agaroza este bromura de etidiu !!!!!carcinogena se manipuleaza doar cu manusi in arii special destinate!!!
Activitatea A.1.4.:
Investete n oameni!
Electroforeza in gel de poliacrilamida

Este utilzata pentru a analiza fragmente mici de ADN si pentru a determina dimensiunile lor prin compararea cu distanta migrata in comparatie cu distanta migrata de fragmente cu lungimi cunoscute.
Investete n oameni!
NFW NFW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K- K+ M U R U R M U R U R M U R U R M U R U R M U R U R M U R U R M U R U R M
NFW NFW 1 M U R U R M U R
2 U R
3 M U R
KU R
K+ U R M
250bp 150bp 50bp Legend: U = unrestricted fragment R = restricted fragment with Mva I M = Gene Ruler 50bp DNA Ladder (Fermentas) NFW = nuclease-free water K- = negative control K+ = positive control 1 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 102 = probe with no mutation in exon 2, codon 12 3 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 4 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 5 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 6 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 7 = probe with no mutation in exon 2, codon 12 8 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 9 = probe with activating mutation in exon 2, codon 12 10 = probe with no mutation in exon 2, codon 12
157bp 143bp 114bp 143bp (mutant allele) 114bp (wild type allele)
codon 12
Investete n oameni!
PCR-RFLP k-ras gene, codon 13

cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013 NFW 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 Samples:ProiectNFW
M1 U R U R M2 M1 U R U R M1 U R
U R M1 U
R U
R M1 U R
R M1 U R U
R M1
150 bp 85 bp (wild-type allele) 74 bp (mutant allele) 48 bp 29 bp 25 bp
75 bp
50 bp
4% agarose gel electrophoresis of PCR products for k-ras codon 13 unrestricted and restricted with restriction enzyme Hae III. U= unrestricted PCR product R= PCR products digested with restriction enzyme Hae III M1: 25 bp DNA Ladder (Promega) M2: GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Fermentas) NFW: nuclease-free water (negative control of PCR) Samples 05 and 10: heterozygous for codon 13 mutation samples (with both mutant and wild type alleles) Samples 01-04 and 06-09: homozygous normal samples (with wild type allele only)
Activitatea A.1.4.:
Investete n oameni!
PCR-RFLP k-ras gene, codon 13

(the same electrophoresis, longer running)
NFW NFW 01 M1 U R U R M2 M1 U R
Samples:
02 03 04 05 06 07 08 09 U R M1 U R U R M1 U R U R M1 U R U R M1 U R
10 U R M1
4% agarose gel electrophoresis of PCR products for k-ras codon 13 unrestricted and restricted with restriction enzyme Hae III. U= unrestricted PCR amplicon R= PCR products digested with restriction enzyme Hae III M1: 25 bp DNA Ladder (Promega) M2: GeneRuler 50 bp DNA Ladder (Fermentas) Activitatea A.1.4.: NFW: nuclease-free water (negative control of PCR) Cases 05 and 10: heterozygous for codon 13 mutation samples (with both mutant and wild type alleles) Rolul angajatilor cu studii medii din Cases 01-04 and 06-09: homozygous normal samples (with wild type allele only)
laboratorul de anatomie patologica 24-27 noiembrie 2011, Sinaia
Investete n oameni!
PCR-RFLP codon 13 (8% PAA gel Ag staining: PCR products from the second PCR,
with Hae III)
Samples:
01 02 03 04 M 05 06 07 08 09 10 M
digested
85 bp (wild-type allele) 74 bp (mutant allele)
Samples:
M 05
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
10
159 bp (undigested PCR product) 85 bp 74 bp 75 bp DNA 48 bp DNA
Investete n oameni!
Probleme ?
- prezenta de benzi in controlul negativ contaminarea=> se pregatesc noi reactivi si se opereaza in spatii separate pentru pregatirea solutiilor si analiza produselor de amplificare - amplificare slaba sau nedectabila reactivi cu probleme, termocicler defect, erori de programare
Investete n oameni!
Angajam tehnician HP/Patologie Atentie la detaliiMoleculara!!! - munca necesit atentie la detalii i implicare n
ndeplinirea sarcinilor de lucru. Integritate - onest si etic. Fiabilitate a fi de incredere, responsabil in ndeplinirea obligaiilor. Toleranta la stres - acceptarea criticilor i care se ocup cu calm i n mod eficient in situaii de stres ridicat. Independen - necesit dezvoltarea unor metode proprii de a face lucrurile, cu supraveghere puina sau deloc, i depinderea de sine insusi pentru a finaliza actiunile.

Biologie Moleculara

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Biologie Moleculara

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Investete n oameni!

Tehnici de biologie moleculara

Dinamica pietei justifica o noua profesie?

Implicarea in patologie moleculara

Gena Her2/neu (human epidermal growth factor receptor-2gene)

Metode de Biologie Moleculara

Reactiile de hibridizare in situ

Her 2neu- kituri comerciale disponibile

FISH (FLUORESCENT IN SITU HIBRIDIZATION)

Hibridizare cu probe fluorescente gena HER2 Centromerul cromozomului 17 (CEP17)

Analiza microscopica a semnalelor fluorescente (numararea copiilor genei)

Echipamente folosite pentru FISH

Factori care influenta eficienta reactiei de hibridizare

Factori care tin de parametrii reactiei de hyb

Scor: analiza standardizata conform protocolului Vysis Se numara 60 de nuclei tumorali

Neamplificat Raport CEP 17/ Her2 neu < 2

PROBLEME DE SCORIFICARE FISH

CISH (CROMOGENIC IN SITU

Avantaje /dezavantaje FISH /CISH

Beecher Instruments, USA

- Deparafinare+colorare - Microdisectie si captura in tuburi sterile - Digestie

Extractia de acizi nucleici

Electroforeza in gel de agaroza Este utilizata pentru separarea fragmentelor de ADN in

Electroforeza in gel de poliacrilamida

PCR-RFLP k-ras gene, codon 13

150 bp 85 bp (wild-type allele) 74 bp (mutant allele) 48 bp 29 bp 25 bp

PCR-RFLP k-ras gene, codon 13

85 bp (wild-type allele) 74 bp (mutant allele)

159 bp (undigested PCR product) 85 bp 74 bp 75 bp DNA 48 bp DNA

S-ar putea să vă placă și