UNIVERSITATEA DIN BUCURETI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
DEPARTAMENTUL DE BIOCHIMIE I BIOLOGIE MOLECULAR

LUCRRI PRACTICE
BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI I
BIOLOGIE MOLECULAR

Sergiu Emil GEORGESCU Marieta COSTACHE

BUCURETI 2009
CUPRINS

LISTA ABREVIERILOR

CAPITOLUL I: ACIZII NUCLEICI STRUCTUR, PROPRIETI,

TRANSMITEREA I EXPRIMAREA INFORMAIEI GENETICE
I.1. Structura i compoziia acizilor nucleici
I.2. Parametrii de mrime ai moleculelor de acizi nucleici
I.3. Hidroliza acizilor nucleici
I.4. Purificarea i evaluarea cantitativ a acizilor nucleici
I.5. Proprietile fizico-chimice ale acizilor nucleici
I.6. Transmiterea informaiei genetice procesul de replicare
I.7. Exprimarea informaiei genetice - transcripia

CAPITOLUL II: METODE DE IZOLARE I PURIFICARE ALE ACIZILOR

NUCLEICI
II.1. Izolarea ADN genomic total din esut vegetal folosind metoda cu
SDS/Acetat de potasiu
II.2. Izolarea ADN genomic total din esut vegetal folosind metoda cu CTAB
II.3. Izolarea ADN din esut animal cu fenol-cloroform (metoda Taggart)
II.4. Izolarea ADN din suspensii de culturi celulare
II.5. Izolarea ADN genomic din snge
II.6. Izolarea ADN din material seminal
II.7. Izolarea ADN din esuturi mparafinate
II.8. Izolarea ADN din plasm sau ser
II.9. Izolarea ADN de la nivelul celulelor somatice din lapte
II.10. Izolarea ARN total cu guanidin-tiocianat (metoda Chomczynski)
II.11. Izolarea ARN din snge
CAPITOLUL III: METODE DE ANALIZ ALE BAZELOR AZOTATE I
ACIZILOR NUCLEICI
III.1. Spectrele de absorbie ale bazelor azotate
III.2. Spectrul de absorbie al ADN. Determinarea spectrofotometric a puritii
i concentraiei ADN.
III.3. Efectele hipocromic i hipercromic ale ADN
III.4. Verificarea integritii ADN prin electroforez n gel de agaroz
III.5. Electroforez ADN n gel de poliacrilamid
III.6. Verificarea integritii ARN prin electroforez n gel denaturant de
agaroz

CAPITOLUL IV: REACIA PCR VARIANTE I TEHNICI DERIVATE

IV.1. Realizarea reaciei PCR n gradient de temperatur pentru optimizarea
hibridizrii primerilor
IV.2. Touch-Down PCR cu adugare de adjuvant
IV.3. Tehnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
IV.3.1 Diagnosticarea unor maladii genetice prin tehnica RFLP
A. Diagnosticarea deficienei de adeziune leucocitar bovin
B. Diagnosticarea deficienei n uridin-monofosfat sintaz bovin
IV.3.2 Evidenierea unor polimorfisme la nivelul ADN prin tehnica RFLP
A. Evidenierea polimorfismului genei care codific pentru -
lactoglobulin la bovine
B. Analiza polimorfismului locusului Extension la cabaline
IV.3.3 Identificarea speciei utiliznd tehnica RFLP
A. Identificarea speciilor de sturioni din genurile Acipenser i Huso
IV. 4. Tehnica de analiz a fragmentelor marcate fluorescent
IV.4.1 Identificarea deleiilor folosind tehnica analizei fragmentelor
marcate fluorescent (diagnosticarea Imunodeficienei severe combinate la cabaline)
 IV.4.2 Identificarea inseriilor folosind tehnica analizei fragmentelor
marcate fluorescent (diagnosticarea Epidermolizei joncionale severe la cabaline)
IV.4.3 Identificarea mutaiilor punctiforme utiliznd tehnicile RFLP i
de analiz a fragmentelor marcate fluorescent (diagnosticarea Paraliziei hiperkalemice
periodice la cabaline)
IV.5. Tehnica PCR multiplex
IV.5.1 Analiza prin PCR multiplex a microsateliilor la sturioni
IV.5.2 Analiza prin PCR multiplex a microsateliilor la suine
IV.5.3 Aplicaii ale tehnicii PCR multiplex - Genotiparea la cabaline
n vederea testrii paternitii
IV.6. Tehnica RT-PCR (PCR revers transcris)
IV.7 Tehnica Real-Time PCR
IV.7.1 Cuantificarea relativ a expresiei genei leptinei la suine

Capitolul V: SECVENIALIZAREA ADN

V.1 Secvenializarea prin metoda Dye-terminator

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
LISTA ABREVIERILOR

2-ME 2-mercaptoetanol.
6-FAM, ROX, VIC, NED, PET, LIZ colorani fluoresceni.
ADN acid deoxiribonucleic.
ADNc acid deoxiribonucleic complementar.
ARN acid ribonucleic.
ARNr acid ribonucleic ribozomal.
ARNt acid ribonucleic de transfer.
ASIP proteina de semnalizare Agouti (Agouti Signaling Protein).
BLAD deficiena de adeziune leucocitar bovin.
BSA - albumin seric bovin.
CTAB bromura de cetil-trimetil-amoniu.
ddNTP dideoxinucleotid trifosfat.
DEPC dietilpirocarbonat.
DMSO - dimetil sulfoxid.
dNTP deoxinucleotid trifosfat.
DTT ditiotreitol.
DUMPS deficiena n uridin 5monofosfat sintaz.
EDTA acid etilen-diamino-tetraacetic.
GAPDH gliceraldehid fosfat dehidrogenaz.
HYPP paralizia periodic hiperkalemic (Hyperkalemic Periodic Paralysis).
JEB epidermoliza joncional sever (Junctional Epidermolysis Bullosa).
Kpb kiloperechi de baze.
MC1R - receptorul pentru melanocortin.
MOPS acid 3-[N-Morfolino]-propan-sulfonic.
Pb perechi de baze.
PBS tampon fosfat salin.
PCR reacie de polimerizare n lan (Polymerase Chain Reaction).
RFLP polimorfismul lungimii fragmentelor de restricie (Restriction Fragment Lenght
Polymorphism).
rpm rotaii pe minut.
RT-PCR revers-transcris PCR.
SCID imunodeficiena sever combinat (Severe Combined Immunodeficiency).
SDS sodiu dodecil-sulfat.
TAE TRIS-Acid acetic-EDTA.
TBE TRIS-Acid boric-EDTA.
TE tampon TRIS-EDTA.
TEMED - N,N,N,N- tetrametiletilendiamin.
TRIS tris(hidroximetil)aminometan.
UMP uridin 5monofosfat sintaz.
UV ultraviolet.
VIS vizibil.
CAPITOLUL I
ACIZII NUCLEICI STRUCTUR, PROPRIETI, TRANSMITEREA I
EXPRIMAREA INFORMAIEI GENETICE

I.1. Structura i compoziia acizilor nucleici

Acizii nucleici sunt substane care au fost pentru prima dat izolate din nucleii
celulelor. Ulterior, s-a evideniat existena acizilor nucleici att n nucleu ct i n
citoplasma celulelor dar denumirea a fost pstrat din considerente istorice.
Exist dou tipuri de acizi nucleici:
a) ADN (acid deoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul celulelor dac
acesta este individualizat, cum este cazul eucariotelor;
b) ARN (acid ribonucleic), prezent n principal n citoplasma celulelor dar i n
nucleu.
n celul, acizi nucleici se gsesc asociai cu proteinele n complexe numite
nucleoproteine. Prin tratare, n anumite condiii, cu acizi sau cu sruri, acizii nucleici se
pot separa de proteinele respective. Odat separai, acizii nucleici sub forma lor de
polimeri pot fi hidrolizai, n condiii adecvate pn la nucleotide, unitile de baz ale
alctuirii acizilor nucleici. Mai departe, nucleotidele pot fi hidrolizate pn la fosfat i
nucleozide sau pn la fosfat, pentoze i baze purinice i pirimidinice. Pentozele sunt
glucide. n ADN pentoza se numete deoxiriboz, iar n ARN poart numele de riboz.

Figura 1: Pentozele din structura acizilor nucleici.

 Acizii nucleici au rol esenial n conservarea i transmiterea informaiei genetice
necesar funcionrii programului sintezei proteinelor celulare, suportul marii majoriti
a activitilor biologice. Acestia sunt responsabili de dictarea ordinii n care aminoacizii
se leag ntre ei pentru a da natere unei proteine adecvate.
ADN este un element permanent al celulei, informaiile coninute n structura sa
fiind transmise descendenilor. Din acest motiv se afirm c ADN este suportul ereditii.
Acizii ribonucleici, ARNr, ARNt i ARNm, sunt moleculele implicate n realizarea
direct a sintezei proteice.
Din punct de vedere structural, acizii nucleici sunt molecule polinucleotidice foarte
mari formate din repetiia unor subuniti numite nucleotide. Unitile nucleotidice sunt
formate din acid fosforic, un monozaharid cu cinci atomi de carbon (riboza n ARN i
deoxiriboza n ADN) i o baz purinic (adenina sau guanina) sau pirimidinic (citozina
i timina n ADN, respectiv citozina i uracilul n ARN).

Figura 2: Bazele azotate din structura acizilor nucleici.

Unitatea structural format prin legarea unei pentoze de o baz azotat prin
intermediul legturii N-glicozidice se numete nucleozid. Prin legarea unei grupri fosfat
la o nucleozid se va obine o nucleotid (Figura 3). n structura acizilor nucleici, unitile
nucleotidice sunt nlnuite prin legturi fosfo-diesterice stabilite ntre hidroxilul din
poziia 3 al unei nucleotide i gruparea fosfat din poziie 5 a nucleotidei urmtoare.

Figura 3: Structura unei nucleotide.

Figura 4: Legatura fosfodiesteric.

Acizii nucleici sunt, asemeni proteinelor, polimeri neramificai care pot fi liniari
sau circulari. Demonstrat de Levene n 1925 i confirmat dup 1950 de ctre Todd,
nlnuirea covalent a nucleotidelor este de tip ester. Depolimerizarea se poate realiza
prin hidroliz de diferite tipuri (acid, bazic, enzimatic) i este destul de folosit n
tehnicile de biologie molecular.
 Indiferent de tipul de acid nucleic (ribonucleic sau deoxiribonucleic), reacia de
asamblare polinucleotidic este aceeai: hidroxilul din poziia 3 al unui nucleozid
monofosfat este esterificat de ctre 5-fosfatul din structura nucleozid trifosfatului care
particip la formarea legturii. Faptul c acizii nucleici sunt polimeri fosfodiesterici ai
nucleozid-monofosfailor (NMP) are urmtoarele consecine directe:
a) asemeni polipeptidelor, catena este orientat (vectorizat). Sensul convenional
5-3 a fost adoptat pentru lectura i scrierea polinucleotidelor ca i pentru reprezentrile
prescurtate sau simbolice.
b) bazele fixate regulat n funcie de o secven specific speciei moleculare, sunt
purtate de un schelet covalent pentozo-fosfat. Cu toate c imaginea este asemntoare cu
cea a scheletului polipeptidic purttor al catenelor laterale ale aminoacizilor, exist o serie
de diferene fa de acesta: - scheletul acizilor nucleici este un polianion cu o sarcin pe
unitate care are o densitate total de sarcin negativ foarte mare; - varietatea bazelor este
mult mai redus (patru baze azotate fa de 20 de aminoacizi).
Consecinele acestor diferene sunt foarte importante pentru sistemele de
informaie genetic. nelegem astfel, de ce pentru codificarea aminoacizilor de ctre
secvenele nucleotidice nu este nevoie numai de o simpl echivalen baz/aminoacid, ci
de un limbaj ternar format din ansambluri de trei baze adiacente a cror asociere
determin existena a 64 de combinaii posibile, care stau la baza codului genetic.

I.2. Parametrii de mrime ai moleculelor de acizi nucleici

Mrimea acizilor nucleici se exprim prin trei tipuri de uniti:

- lungime;
- mas molecular exprimat n Daltoni (Da);
- numr de nucleotide sau de baze ale acestora pentru monocatene (b) i n perechi
de baze (pb) dac molecula este constituit din dou catene asociate. Multiplul cel mai
folosit este cel de kilobaze sau kilo-perechi de baze (1000 b sau 1000 pb).
 Numrul nucleotidelor din structura ARN variaz de la mai multe zeci de baze la
mai multe mii de baze.
ARN ribozomal (ARNr) 100 - 5000 b
ARN de transfer (ARNt) 75 - 90 b
ARN mesager (ARNm) numrul de baze depinde de mrimea genei copiate
Mrimea ADN variaz n funcie de regn i specie. Aceasta acoper toat gama de
la 5000 la mai mult de un milion de perechi de baze.
Metode de determinare a mrimii acizilor nucleici
Metodele de determinare a mrimii acestor macromolecule se bazeaz pe diferite
caracteristici i poate fi determinat prin mai multe metode:
1. Microscopie electronic: datorit dimensiunilor lor acizii nucleici pot vizualizai
prin aceast tehnic. Metoda se potrivete foarte bine moleculelor de ADN de mrime
medie (cteva mii la 200000 pb).
2. Electroforez: este o tehnic de separare a moleculelor n funcie de masa lor
molecular. Condiiile de densitate de sarcin asemntoare, caracteristice pentru
electroforeza n SDS a proteinelor, sunt realizate n mod natural, de ctre scheletul
pentozo-fosfat. De asemenea, dependena logaritmic, distan de migrare n funcie de
mrime, este bine respectat.
Pentru separarea moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite
geluri de agaroz cu poroziti variate. Pentru facilitarea estimrilor cantitative exist
colecii de polimeri marcheri de mas molecular utilizai pentru etalonarea separrilor.
De altfel, aceast metod de separare este omniprezent n manipulrile de biologie
molecular. Electroforeza se poate realiza i n geluri de poliacrilamid pentru situaiile n
care este necesar separarea moleculelor polinucleotidice mici sau oligonucleotidelor.
Prin electroforeza n gel de poliacrilamid este posibil identificarea unor fragmente care
difer numai printr-un singur nucleotid. Din acest motiv tehnica este foarte util n
secvenializarea acizilor nucleici i n determinarea regiunilor de polimorfism normal sau
patologic determinat de existena unor mutaii.
Moleculele ADN de mrime mare sunt analizate i prin:
 a) ultracentrifugare: forele de frecare existente ntre aceste molecule limiteaz
cmpul aplicaiilor molecule de pn la 1,5 x 106 pb. Prin aceast tehnic pot fi separate
fragmente de ADN care au un coninut diferit n guanin i citozin; ADN genomic
bacterian; ADN plasmidial; ARN total, diferite tipuri de ARN ribozomal, etc.
b) electroforeza n cmp pulsatoriu (sau alternant). Prin aceast tehnic care a fost
imaginat la nceputul anilor 1980, dou cmpuri electrice se aplic alternativ pe dou
direcii diferite. Principul de separare se bazeaz pe viteza diferit de reorientare a
moleculelor n momentul alternrii celor dou cmpuri electrice. Ele impun moleculelor
de ADN etape de reorientare diferite nainte de migrarea lor efectiv. Aceste etape de
reorientare sunt dependente de mrimea moleculelor.
Hidroliza acizilor nucleici
Degradarea unui polinucleotid poate s se refere la: i) legtura fosfodiester atunci
cnd se produce o depolimerizare; ii) unitile nucleotidice dac se rupe legtura
glicozidic i se degradeaz componentele. n ambele cazuri hidroliza poate fi de natur
chimic sau enzimatic.

I.3. Hidroliza acizilor nucleici

Hidroliza chimic
Dei sunt printre cele mai stabile molecule, n condiii fiziologice celulare, acizii
nucleici prezint totui, in vitro, rezistene diferite la condiiile de pH i de temperatur.
Tratamentul acid afecteaz n mod similar cele dou tipuri de acizi nucleici. Astfel
sunt necesare condiii drastice pentru a degrada scheletul pentozo-fosfat (nclzire, acizi
concentrai). n aceste condiii celelalte legturi din structur nu rezist i obinem un
amestec de fosfai, pentoze i baze azotate. Acest protocol, urmat de o fracionare
cromatografic, a fost una dintre tehnicile care au permis analiza compoziiei acizilor
nucleici. n condiii relativ blnde (pH 4,0), se vor rupe numai legturile N-glicozidice cu
purinele care sunt cele mai fragile. n acest caz, se obine un derivat de acid nucleic
apurinic care prezint interes pentru anumite analize.
 Comportamentul ARN i ADN la hidroliz bazic este foarte diferit. ADN rezist
la valori extreme de pH bazic. La pH 13,0 i 370C se nregistreaz aproximativ zece
scindri pe or i pentru milion de puni fosfo-diester. Cu toate acestea, punile
fosfodiester din ADN devin sensibile la hidroliz alcalin dac bazele sunt nlturate sau
degradate. Aceast proprietate este utilizat n tehnica de secvenializare chimic.
ARN este total hidrolizat n ribonucleotidele componente n cteva minute, la 370C
i pH 11. nc de la pH 8, se constat nceperea unei degradri semnificative.
Diferena dintre reactivitatea ARN i ineria ADN este dat de existena gruprii
hidroxil din poziia 2. Deprotonarea sa n condiii alcaline produce un anion alcoxid,
puternic nucleofil care atac gruparea fosfo-diester adiacent. Absena hidroxilului n 2
din scheletul ADN este un factor determinant al stabilitii sale chimice n condiii
celulare, normale sau agresive.
Hidroliza enzimatic
Enzimele care catalizeaz hidroliza legturii fosfodiester din structura acizilor
nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite i nucleaze. Acestea sunt prezente n toate celulele
i sunt foarte utile n metabolismul acizilor nucleici i proteinelor. O parte dintre a ceste
nucleaze sunt secretate de ctre pancreasul exocrin, n intestin, i particip direct la
digestie hranei. Aceste enzime prezint niveluri de specificitate comparabile cu cele ale
peptidazelor i proteazelor. Ele se pot clasifica n funcie de:
a) modul lor de atac al catenei: - exonucleaze, enzimele care acioneaz la nivelul
extremitii catenelor; - endonucleaze, enzimele care atac n interiorul catenelor.
b) specificitatea lor fa de substrat: - pentru tipul de acid nucleic: ribonucleaze
pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN i nucleaze pentru ambele; - pentru tipul de
structur: mono- sau dublu catenar.
c) specificitatea lor de recunoatere a situsurilor de aciune: - specificitate pentru
baze; - specificitate pentru secvene.
d) tipul de rupere a legturii fosfodiester: - exonucleazele i endonucleazele de tip
d scindeaz extremitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; - exonucleazele i
endonucleazele de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP.
 Descoperirea enzimelor de restricie, n 1970, de ctre W. Harber, H. Smith i D.
Nathans, a nsemnat un pas gigantic pentru evoluia tehnicilor de biologie molecular.
Acestea au permis nlturarea principalului obstacol tehnologic privind manipularea
ADN, deoarece pot reduce ntr-o manier reproductibil, un genom ntreg la o serie de
fragmente caracteristice pentru o specie dat. Astfel, genele sau pri ale genelor devin
entiti fizice izolabile. Aceste enzime sunt responsabile pentru fenomenul de restricie de
unde i numele lor.
Enzimele recunosc i taie secvene de baze cu structuri caracteristice de pe catena
ADN, numite palindroame, a cror lungime variaz ntre 4 i 10 pb. Se observ c
secvena de pe una din catene reprezint palindromul secvenei celeilalte catene. n urma
aciunii enzimelor de restricie, se pot obine capete coezive sau capete drepte pentru
fragmentele eliberate, n funcie de poziia situsurilor de scindare (Figura 5).

Figura 5: Exemple de enzime de restricie i situsurile recunoscute de acestea.

I.4. Purificarea i evaluarea cantitativ a acizilor nucleici

Un procedeu clasic de purificare const n tratarea soluiei apoase de acid nucleic

cu soluie fenolic care denatureaz proteinele. De obicei este folosit amestecul fenol-
cloroform care este destul de eficient. Dup separarea fazelor prin centrifugare, este
recuperat faza apoas care constituie supernatantul i care conine acizii nucleici. Urmele
de fenol (care ar putea s inhibe activitatea enzimelor din etapele urmtoare) sunt
eliminate printr-un nou tratament cu cloroform/alcool izopropilic. Dac acizii nucleici
provin din extracte celulare, proteinele sunt n prealabil hidrolizate cu ajutorul unei
enzime proteolitice numit proteinaza K.
n ultimii ani au fost puse la punct procedee de purificare pe baz de rini.
Reactivii sunt livrai sub form de kituri gata de ntrebuinare simplificnd mult
procesul de purificare i crescnd adesea randamentul acestuia.
Metode spectrofotometrice
Determinarea absorbiei n ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru permite
verificarea puritii unei soluii de ADN sau ARN. n urma determinrii densitii optice
se va obine un semnal la 260 nm. Pentru estimarea puritii este necesar calcularea
raportului densitilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie s fie cuprins
n intervalul 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o contaminare cu ARN.
Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8.
Concentraia acizilor nucleici poate fi apreciat astfel:
unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 30 ng/l pentru ARN
Determinarea secvenei primare a acizilor nucleici
Strategia curent de secvenializare a acizilor nucleici este format din trei etape,
conforme cu principiile comune de analiz a polimerilor:
a) acidul nucleic este ntotdeauna prea lung pentru a fi secvenializat direct i
trebuie fracionat n fragmente repetabile de mrime adecvat. Acestea sunt separate,
fiecare fiind apoi supus secvenializrii;
b) prin scindarea diferit a fragmentului de secvenializat, se produc amestecuri de
segmente de oligonucleotide, de diferite lungimi care se suprapun;
c) separarea i identificarea componentelor fiecruia dintre aceste amestecuri i
apoi compararea lor n scopul reconstituirii secvenei iniiale a fragmentului.
nceputurile n secvenializarea acizilor nucleici au fost tributare modalitilor de
scindare i de fracionare a oligonucleotidelor. nainte de 1970 cercettorii nu dispuneau
nici de endonucleaze i nici de modaliti de scindare echivalente degradrii Edman.
Secvenializarea realizat pentru ARNtAla a constat n scindarea parial cu ajutorul
ribonucleazelor T1 i A, suprapunerea fragmentelor obinute n urma aciunii secveniale
a unei exonucleaze i analiza produilor obinui prin cromatografie.
Anii 1970 marcheaz descoperirea endonucleazelor de restricie i primele realizri
ale tehnicilor de biologie molecular, printre care i clonarea care permitea multiplicarea
moleculelor de ADN disponibile.
La baza evoluiei ulterioare a secvenializrii ADN au stat dou metode. Diferena
dintre cele dou const n modul de obinere a ansamblurilor de fragmente: una din
metode se bazeaz pe scindarea chimic (metoda introdus de A. Maxam i W. Gilbert),
cealalt se inspir din procesul de replicare i se bazeaz pe tehnologia sintezei
enzimatice (metoda Sanger).
Cu toate c metoda Maxam i Gilbert a cedat de mult locul metodei Sanger, pentru
care la ora actual exist numeroase variante, confruntarea dintre cele dou concepii
rmne interesant.
Metoda dideoxi a lui F. Sanger
Sanger, pionierul secvenializrii insulinei, a conceput o metod genial de
secvenializare care se bazeaz pe principiul replicrii. Analiza structurii ADN i a rolului
su n exprimarea genelor a fost uurat enorm de punerea la punct a acestei tehnici de
secvenializare. Esena tehnicii de secvenializare a ADN, propus F. Sanger i
colaboratorii, a constituit-o generarea de fragmente a cror lungime era dependent de
ultima baz din structura secvenei. Colecii de astfel de fragmente au fost generate prin
ntreruperea controlat a sintezei enzimatice. Aceast tehnic s-a impus n faa celorlalte
tehnici de secvenializare datorit simplitii sale.
Iniial, fragmentul care urmeaz a fi secvenializat (matri), este denaturat, pentru
obinerea de monocatene, i adus n contact cu un primer. Hibridizarea primerului cu
matria monocatenar permite iniierea aciunii ADN polimerazei, n prezena substratelor
nucleotidice dNTP. n fiecare dintre cele n patru loturi se adug o mic cantitate dintr-
un 2-3dideoxinucleotid trifosfat (ddNTP) diferit, analog cu una dintre nucleotide.
ncorporarea acestui analog, n locul unei nucleotide normale, blocheaz alungirea
datorit lipsei hidroxilului din poziia 3 terminal. Din acest considerent ddNTP au fost
denumite molecule terminatoare de caten (Figura 6). Concentraia lor este destul de mic
pentru a opri sinteza numai ocazional.

Figura 6: Structurile deoxi- i dideoxinucleotidelor.

Ulterior, prin electroforez n gel de poliacrilamid sau prin electroforez capilar,

se realizeaz separarea fragmentelor din cele patru loturi. Mrimea diferit a fragmentelor
este datorat opririi copierii catenei matri la un anumit nivel, corespunztor fiecruia
dintre cele patru tipuri de ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP).
Aceast metod ingenioas i-a permis lui F. Sanger, n 1977, s stabileasc prima
secvena complet de 5386 baze a bacteriofagului X174. Total automatizat ulterior,
tehnica a permis descifrarea complet a genoamelor multor organisme procariote i
eucariote i a fost folosit cu succes n amplul proiect de secvenializare a genomului
uman. Secvenializarea clasic a acizilor nucleici inventat de Sanger are la ora actual o
serie de variante care au fcut-o s se impun ca singura alternativ viabil de determinare
a secvenei acizilor nucleici.
La ora actual se folosesc primeri sau dideoxinucleotid trifosfai marcai
fluorescent ce conduc la obinerea unor fragmente a cror separare se realizeaz prin
electroforez n gel de acrilamid sau prin electroforez capilar. Marcarea fluorescent
ofer posibilitatea combinrii amestecurilor de reaciei urmat de separarea electroforetic
a ansamblului. Benzile obinute pot fi detectate independent n funcie de reactivul
fluorescent cu care au fost marcate. Folosirea marcrii fluorescente i evoluia interesant
a sistemelor de detectare i a programelor de interpretare a rezultatelor a permis
automatizarea tehnicii i extinderea aplicaiilor acesteia.

I.5. Proprietile fizico-chimice ale acizilor nucleici

Pentru a extrage acizii nucleici i pentru a le evalua masa molecular, sunt utilizate
anumite proprieti determinate de natura fibroas i de mrimea ADN i anume:
a) srurile de sodiu ale acizilor nucleici sunt solubile n ap i dau soluii cu
vscozitate ridicat;
b) alcoolii, dintre acetia cel mai folosit este etanolul, sunt utilizai pentru
precipitarea acizilor nucleici din soluie;
c) densitatea acizilor nucleici este destul de mare pentru a permite separarea lor
prin ultracentrifugare. Centrifugarea n gradient de densitate la echilibru permite
determinarea masei moleculare i evaluarea coninutului n G/C.
Dintre proprietile datorate compoziiei reinem:
a) Caracterizarea i dozarea ADN pentru coninutul n deoxiriboz. Hidroliza acid
parial la cald nltur purinele demascnd resturile de 2-dezoxiriboz. O fraciune
suficient dintre deoxiriboze ataate pe schelet, sub forma lor furanozic, sunt convertite
n forma aldehidic care poate reaciona cu reactivul Schiff i l recoloreaz. Produsul
obinut precipit pe scheletul macromoleculei i poate fi cuantificat spectrofotometric.
b) Absorbia n UV a ADN la 260 nm datorit coninutului lui n baze. Aceast
absorbie este de aproximativ 30 de ori mai important dect a proteinelor cu o
concentraie egal, dar totui inferioar bazelor libere.
Denaturarea acizilor nucleici
Procesul denaturarea reprezint o alterare a structurii spaiale a unei
macromolecule fr ruperea legturilor covalente. Denaturarea i renaturarea termic a
ADN sunt pe de o parte modaliti de studiu ale acestor molecule dar i unelte necesare n
manipularea acestora.
 Fenomenul de denaturare se manifest la nclzirea unei soluii de ADN. Acest
fenomen este nsoit de modificri spectaculoase ale proprietilor fizice cum ar fi
pierderea vscozitii i amplificarea absorbiei n UV. Efectul de hipercromicitate este o
modificare foarte important i informativ pentru studiul fenomenului de denaturare. Din
stare nativ, dublu catenar, molecula trece n stare denaturat prin ruperea legturilor de
hidrogen i a contactelor Van der Waals care asigur stivuirea. Temperatura separ
complet sau incomplet cele dou catene care i pierd forma elicoidal i adopt o
conformaie statistic aleatoare. n aceste condiii crete absorbia n UV a bazelor care
pn n acel moment erau mascate.
Un factor important este concentraia n sruri a mediului, un factor extrinsec care
are efect protector spectacular. Ionii minerali neutralizeaz sarcinile scheletului fosfat i
anuleaz repulsiile electrostatice care destabilizeaz dublul helix. De reinut c n ap
pur ADN se poate denatura la temperatura ambiant.
Fenomenul de renaturarea se refer la restaurarea strii iniiale de dubl caten,
plecnd de la ADN denaturat. Succesul acestei renaturri depinde de condiiile de mediu
(pH, trie ionic), de starea mai mult sau mai puin avansat a denaturrii; de protocolul
adoptat pentru revenirea la temperatura nedenaturant.
Procesul de denaturare/renaturare parcurge diferite etape n funcie protocolul
utilizat:
a) dac soluia este rcit prea repede, timpul de cutare al catenelor
complementare este prea scurt, iar moleculele sunt ngheate n starea imperfect de
cupluri inter- i intramoleculare;
b) dac soluia este rcit treptat s-a observat, din contr, o revenire gradat la
proprietile caracteristice structurii bicatenare. Acest fenomen are loc deoarece este
asigurat durata necesar pentru explorarea bazelor prezente pe cele dou catene. Aceste
condiii au fost denumite de anelare sau annealing.
Dac se pornete de la o soluie complet denaturat, remperecherea se realizeaz
n dou etape de cinetic diferite: n prima catenele separate se ntlnesc la ntmplare i o
scurt regiune se poate mperechea pe baz de complementaritate i forma nceputul unei
duble elice. n a doua etap, plecnd de la aceste puncte de iniiere a procesului,
mperecherile se vor efectua foarte rapid, dup modelul nchiderii unui fermoar,
impunnd structura de dublu helix pe toat lungimea moleculei.
Denaturrile i renaturrile sunt etape cheie pentru numeroase tehnici de biologie
molecular. Hibridizarea, etap tehnic foarte important, presupune formarea de
duplexuri artificiale ntre ADN din diferite surse sau ntre ADN i ARN.
Regiunile de ARN al cror lan monocatenar se repliaz pentru a forma o structur
de dublu helix prezint acelai fenomen de denaturare, dar aceste duplexuri ARN sunt
mult mai stabile.
Exist o serie de ali factori care au aciune denaturant asupra ADN. Astfel,
valorile extreme de pH dezorganizeaz mperecherile modificnd ionizarea grupelor de
baze.
Tratamentul alcalin este o metod important care este folosit n tehnicile de
biologie molecular pentru denaturarea ADN. Prin aceasta se separ rapid catenele fr a
se produce degradare. Este o modalitate reversibil de a obine molecule de ADN
monocatenare care sunt foarte utile etapelor de hibridizare din tehnicile Southern i
Northern blotting.
Compuii organici ca aldehida formic, formamida, ureea, au capacitatea de a
stabili legturi de hidrogen i sunt utilizai n ca ageni denaturani n tehnicile de separare
a ADN. Faptul c aciunea lor necesit accesibilitatea grupelor de baze implicate n
mperecheri a condus la concepia unei structuri dinamice pentru ADN, n care exist
regiuni care se desfac tranzitoriu i monocatene care se remperecheaz. n ADN linear,
desfacerea spontan a bazelor este totui rar la temperaturi fiziologice.
Trebuie s reinem c in vivo probabilitatea de denaturare a ADN n condiii de pH,
for ionic i temperatur celular este minim. Cu toate acestea existena procesului
activ de mperechere parial este obligatoriu pentru replicare i transcripie. De
asemenea, proteinele care se leag la ADN inhib, pentru cea mai mare parte,
denaturarea. Cu toate acestea, n funcie de starea fiziologic a celulei, numeroase
proteine destabilizeaz dubla elice.
I.6. Transmiterea informaiei genetice procesul de replicare

ADN este supus unor procese celulare eseniale (replicri, reparri, rearanjri i
recombinri) catalizate de enzime i care asigur transmiterea corect, conservarea i
unicitatea informaiei genetice a fiecrui individ.
Replicarea ADN, un proces fundamental care are loc n celulele organismelor vii i
st la baza ereditii biologice. Prin acesta se realizeaz copierea, mai precis duplicarea,
moleculelor de ADN. Replicarea este semiconservativ, deoarece o molecul de ADN
este duplicat (replicat) prin polimerizarea unei noi catene complementare pe fiecare
dintre vechile catene ale dublei helice de ADN. Fiecare din acestea devine un model
pentru sinteza unei noi catene complementare, rezultnd dou molecule ADN identice.
Replicarea este bidirecional. Practic, n momentul replicrii unei molecule de
ADN, catenele sale sunt deprtate pentru a forma una sau mai multe furci de replicare n
form literei Y. Enzima ADN polimeraza, care se poziioneaz la nivelul fiecrei furci,
este responsabil de sinteza noii catene de ADN complementare cu fiecare din catenele
parentale. Replicarea ADN ncepe la nivelul mai multor situsuri cromozomiale specifice
numite origini de replicare. n funcie de organism, originile de replicare sunt segmente de
ADN unice care contin mai multe uniti repetitive scurte care sunt recunoscute de
proteine multimere denumite Origin Binding Proteins.
Polimerazele care realizeaz sinteza unor noi molecule ADN necesit asocierea cu
un complex multiproteic de iniiere a reaciei de polimerizare nucleotidic. Toate ADN
polimerazele cunoscute au numai capacitatea de a elonga o caten preexistent de ADN
sau de ARN i sunt incapabile s iniieze sinteza de novo a unei noi catene. Din acest
motiv n complexul multiproteic de iniiere exist enzime, numite primaze care realizeaz
sinteza unui primer complementar la nivelul fiecarei origini de replicare. De asemenea,
polimerazele pot cataliza numai reacia de adugare de nucleotide la captul 3-hidroxil al
catenei n formare determinnd creterea lanului numai n direcia 5-3.
n acest context, numai una dintre catenele furcii de replicare, cea direct, poate fi
sintetizat continuu. Sinteza celeilalte catene, denumit ntrziat, necesit mai muli
primeri i este sintetizat discontinuu de polimeraz, sub forma unor fragmente scurte de
ADN, numite fragmente Okasaki, care sunt ulterior conectate cu ajutorul ADN ligazei
pentru a obine o singur caten continu.
Replicarea ADN necesit cooperarea mai multor proteine, care constituie o main
de replicare multienzimatic la nivelul furcii de replicare, responsabila de sinteza ADN.
ADN polimeraza realizeaz replicarea unei matrie ADN cu o remarcabil fidelitate,
nregistrnd mai puin de o eroare pentru fiecare 109 baze parcurse. Acest lucru este
posibil deoarece enzima elimin propriile sale erori de polimerizare deplasndu-se n
lungul ADN (etap de proofreading sau de autocorectare a greelilor).
Activitatea de corectare/editare pe care o realizeaz ADN polimeraza face ca
enzima s fie incapabil s realizeze sinteza de novo a unei noi catene ADN. Sinteza
ADN este amorsat de ctre o ARN polimeraz, numit primaz, care sintetizeaz
fragmente scurte de ARN numite primeri care sunt apoi (la sfritul procesului) nlturate
i nlocuite cu fragmentele similare de ADN.
Rarele erori de copiere care scap mainriei de replicare i editare a ADN i
leziunile determinate de catre reaciile chimice care modific nucleotidele n ADN sunt
identificate i corectate de sistemele proteice de reparare a nemperecherilor. Acestea
controleaz secvenele de ADN nou sintetizate sau pe cele afectate de modificari i repar
erorile de copiere. Leziunile ADN datorate reaciilor chimice i radiaiilor UV sunt
corectate de diferite enzime care recunosc ADN modificat i excizeaz un fragment scurt
din catena care l conine. Secvena de ADN nlturat este resintetizat de ctre o ADN
polimeraz de reparare, care folosete drept matri catena fr leziuni. ADN ligaza
sudeaz fragmentele de ADN pentru a completa procesul de reparare.

I.7. Exprimarea informaiei genetice transcripia

Procesul prin care o gen conduce producerea unei gene este numit expresie
genic. Genele sunt exprimate prin transcriere din ADN n ARNm i prin traducerea
acestuia n proteine. Nivelul de expresie al unei gene este fin acordat de o serie de
mecanisme de control corelate permanent cu nevoile temporale ale fiecarei celule.
Att celulele procariote ct i cele eucariote posed mecanisme, pe de o parte
comune i pe de alt parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor i a fluxului de
informaie de la ADN la proteine. Transcripia ADN realizat de ARN polimeraze
constituie prima etap, comun la toate organismele.
La celulele procariote, ribozomii se fixeaz pe molecula de ARNm, n curs de
sintez i realizeaz traducerea imediat a informaiei n proteine, la nivelul citoplasmei.
Din contr, la eucariote, membrana nuclear separ locul n care se realizeaz
transcripia de cel n care are loc traducerea. Transcriptul primar, ARNm imatur, conine o
succesiune de secvene netraduse, numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de
scindare a intronilor i sudare a exonilor (splicing) n procesul de maturare a ARNm. n
urma acestei etape, localizat n nucleu, ARNm trece n citoplasm unde este tradus.
Maturarea ARNm prin splicing confer celulei eucariote posibilitatea diversificrii
informaiei prin combinarea alternativ a exonilor.
Genele procariote i eucariote sunt structurate dup aceeai logic de baz, dar cu
diferene importante n detaliile moleculare. O definiie sintetic a unei gene eucariote
poate fi util pentru a rezuma esena acestor diferene. Este general admis c o singur
definiie dat genei eucariote nu poate satisface pe toat lumea sau nu poate corespunde
tuturor exemplelor practice. Definiia adoptat de noi este rezultatul structurii moleculare
a genelor i ine cont de diferenele de localizare i de tipurile de secvene care
influeneaz expresia genelor.
Astfel, definim gena ca fiind o combinaie de segmente de ADN care, mpreun,
constituie o unitate de expresie, o unitate care determin formarea unui produs specific i
funcional care poate fi o molecul de ARN sau un polipeptid. Segmentele de ADN care
definesc gena includ:
1. Unitatea de transcripie care este constituit dintr-un segment ADN continuu
care codific pentru secvena transcriptului primar. Acesta conine secvena codant a
ARN matur sau a proteinei produse, intronii i secvenele nceput 5 i coad 3 prezente
la nivelul ARNm matur ca i secvenele de separare care sunt eliminate n timpul
maturrii transcripilor primari care codific pentru molecule de ARN.
2. Secvenele minimale necesare pentru iniierea corect a transcripiei
(promotorul) i pentru a da natere extremitii 3 particulare din structura ARN matur.
3. Elementele secvenei care determin frecvena de iniiere a transcripiei. Acestea
cuprind secvenele responsabile de inducerea i represia transcripiei i de specificitatea
celular, tisular i temporal a transcripiei. Aceste regiuni sunt foarte variate structural,
ca poziie i ca funcie pentru a putea purta un singur nume. Dintre acestea enumerm
elementele activatoare (enhancers) i elementele moderatoare (silencers), care sunt
secvene ce influeneaz iniierea transcripiei la distan, independent de localizarea lor n
raport cu situsul de iniiere.
n aceast definiie a genei nu sunt incluse secvenele ADN care influeneaz
configuraia unei gene n cromatin i nici cele care codific proteine sau ARN care
moduleaz expresia unei anumite uniti de transcripie.
Controlul vitezei de transcripie la eucariote nu este complet neles. Datorit
mrimii genomului eucariotelor, este necesar o selectivitate crescut a utilizrii ARN
polimerazei la transcrierea genelor dect la ADN necodant (non-coding DNA). O
transcripie eficient necesit, de regul, ca dou sau mai multe proteine diferite s se lege
n poziii apropiate nceputului transcripiei. Anumite poziii de legtur numite
intensificatori pot fi pot fi localizate la aproximativ 3kb de la nceputul transcripie i
activarea lor poate crete viteza de transcripie de o sut de ori (transcrierea este un proces
rapid de ordinul 60 nucleotide pe secund). Intensificatorii se pot ntinde att nainte ct i
dup startul transcrierii i pot exista mai muli intensificatori care s afecteze o singur
gen.
CAPITOLUL II
METODE DE IZOLARE I PURIFICARE ALE ACIZILOR NUCLEICI

II.1. Izolarea ADN genomic total din esut vegetal folosind metoda cu
SDS/Acetat de potasiu

Principiul metodei
Metoda este folosit pe scar larg pentru realizarea extraciei de ADN din esuturi
vegetale proaspete. Sodiu dodecil-sulfat (SDS), un detergent neionic, este utilizat pentru a
elibera acizii nucleici din celul. Moleculele de ARN din extract sunt ndeprtate prin
utilizarea ribonucleazelor, iar contaminanii proteici eliminai cu ajutorul proteinazei K.
Precipitarea ADN se realizeaza utiliznd etanol, iar ndeprtarea total a contaminanilor
se va face dup etapa de splare a ADN cu etanol 70%. Realizarea practic a metodei este
relativ simpl i se poate adapta pentru cantiti variate de material vegetal.
Material biologic: diferite tipuri de esut vegetal cum ar fi frunze sau semine.
Probele trebuie s fie proaspete i ngheate pe azot lichid.
Reactivi i aparatur: i) tampon de extracie: 100 mM TRIS (pH 8), 50 mM
EDTA (pH 8), 500 mM NaCl. Reactivul se stocheaz la temperatura camerei i este stabil
o perioad ndelungat; ii) soluie SDS 20%; iii) soluie acetat de potasiu 5 M; iv) soluie
NaCl 5 M; v) soluie ribonucleaz 20 mg/ml; vi) soluie proteinaz K; vii) etanol 100% i
70%; viii) izopropanol 100%; ix) tampon salin TRIS-EDTA (TE): 1 mM TRIS-HCl (pH
8), 0,1 mM EDTA (pH 8). Reactivul se stocheaz la temperatura camerei i este stabil o
perioad ndelungat; x) 2-mercaptoetanol (2-ME); xi) amestec 24:1 (v/v) cloroform
alcool izoamilic; xii) ap ultrapur: ap purificat, deionizat i lipsit de nucleaze; xiii)
termobloc; xiv) agitator; xv) microcentrifug; xvi) omogenizator sau mojar steril.

Mod de lucru
1. esutul vegetal ngheat pe azot lichid este omogenizat sau mojarat pn la
obinerea unei paste omogene.
2. ntr-un tub de centrifug de 2 ml se adaug: 300 mg omogenat, 900 l tampon
de extracie (la care se adaug extemporaneum -mercaptoetanol pn se ajunge la o
concentraie de 2% -v/v- a acestuia) i 80 l SDS (20%).
3. Amestecul se agit puternic i se incubeaz 10 minute la 65C.
4. Dupa adaugarea a 300 l acetat de potasiu 5 M, amestecul este plasat 20 minute
pe ghea.
5. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 10 minute, la 4C.
6. Supernatantul este transferat ntr-un tub de centrifug nou i se adaug un volum
egal de alcool izopropilic. Se amestec uor prin nclinarea tubului i se plaseaz
amestecul 30 de minute pe ghea.
7. Centrifugare la 8000-11000 rpm,10 minute, la 4C.
8. Supernatantul se arunc i peste sediment se adaug 100 l soluie TE nclzit
la 65C. Se amestec puternic pn cnd sedimentul se dizolv complet.
9. Dup adugarea a 10 l soluie ribonucleaz se incubeaz 60 de minute la 37C.
10. Se adaug un volum egal de amestec de cloroform:alcool izoamilic 24:1 i se
omogenizeaz prin inversia tubului timp de 5 minute.
11. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4C.
12. Se adaug 10 l proteinaz K i se incubeaz 60 de minute la 37C.
13. Se adaug un volum egal de amestec cloroform:alcool izoamilic 24:1 i se
omogenizeaz prin inversia tubului timp de 5 minute.
14. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4C.
15. Supernatanul se transfer ntr-un tub de microcentrifug nou i se adaug peste
acesta dou volume de etanol 100% i volume de soluie NaCl 5 M. Se omogenizeaz
energic timp de 20-30 de secunde.
16. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4C.
17. Supernatantul este nlturat prin inversia tubului, iar peste sediment se adaug
etanol 70%. Se spal prin agitare uoar, timp de 30-60 minute.
18. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 4C.
 19. Etanolul este ndeprtat prin nclinarea tubului. Sedimentul se las la uscat timp
de 15-20 minute la 370C n curent de aer.
20. Sedimentul uscat este resuspendat ntr-un volum adecvat de ap ultrapur sau
de tampon TRIS-EDTA.

II.2. Izolarea ADN genomic total din esut vegetal folosind metoda cu CTAB

Principiul metodei
Acest procedeu este folosit pe scar larg pentru realizarea extraciei de ADN din
diverse surse vegetale. Iniial, protocolul de extracie a fost folosit la bacterii (Jones,
1953), ulterior el fiind adaptat la plante (Murray and Thonpson, 1980).
Bromura de cetil-trimetil-amoniu (CTAB), care este un detergent neionic, este
utilizat n acest caz pentru a elibera acizii nucleici din celul i, ulterior, pentru a forma un
complex insolubil cu acetia, la concentraii de NaCl sub 0,5 M. n acest timp,
polizaharidele, compuii fenolici i alii contaminani specifici plantelor vor precipita i
vor putea fi ndeprtai. Complexul acizi nucleici-CTAB este solubil numai n soluii
saline concentrate. Prin creterea treptata a concentraiei de NaCl, complexul disociaza i
CTAB poate fi ndeprtat.
Precipitarea ADN se realizeaza utiliznd izopropanol, iar ndeprtarea total a
CTAB se face dup etapa de splare a ADN cu etanol. Cantitatea de ADN care poate fi
obinut variaz ntre 100 i 500 g per gram de esut vegetal iniial. Cele mai mari
cantiti se obin n cazul esuturilor proaspete care au fost n prealabil ngheate pe azot
lichid. Realizarea practic a metodei este relativ simpl i se poate adapta pentru cantiti
variate de material vegetal.

Material biologic: diferite tipuri de esut vegetal cum ar fi frunze, semine,

cotiledoane, polen. Probele pot fi proaspete, liofilizate, deshidratate sau ngheate pe azot
lichid.
Reactivi i aparatur: i) soluie de extracie CTAB: 2% CTAB, 100 Mm TRIS-
HCl (Ph 8), 20 Mm EDTA (pH 8), 1,4 M NaCl. Reactivul se stocheaz la temperatura
camerei i este stabil pe o perioad ndelungat; ii) soluie de precipitare CTAB: 1%
CTAB, 50 Mm TRIS-HCl (pH 8), 10 Mm EDTA (pH 8). Reactivul se stocheaz la
temperatura camerei i este stabil o perioad ndelungat; iii) tampon salin TRIS-EDTA
(TE): 10 Mm TRIS-HCl (Ph 8), 0,1 Mm EDTA (pH 8), 1 M NaCl. Reactivul se stocheaz
la temperatura camerei i este stabil pe o perioad lung; iv) 2% (v/v) 2-mercaptoetanol
(2-ME); v) soluie CTAB/NaCl: 10% CTAB n soluie 0,7 M NaCl; vi) amestec 24:1 (v/v)
cloroform:octanol sau cloroform alcool izoamilic; vii) etanol 80%; viii) izopropanol
100%; ix) ap ultrapur; x) agitator; xi) microcentrifug; xii) omogenizator sau mojar
steril.

Mod de lucru
1. esutul vegetal ngheat pe azot lichid este omogenizat sau mojarat pn la
transformarea n pulbere fin i apoi este transferat ntr-un tub de microcentrifug.
2. La soluia de extracie CTAB se adaug 2-mercaptoetanol ntr-un volum adecvat
astfel nct concentaria final a acestuia s fie de 2%. Soluia proaspt obinut este
nclzit la 650C. De asemenea se nclzete i soluia CTAB/NaCl.
3. Peste esutul vegetal proaspt pulverizat se adaug tampon de extracie 2-
ME/CTAB i soluie CTAB/NaCl. Amestecul se vortexeaz foarte puternic pn la
omogenizarea complet. Se incubeaz ntre 10 i 60 de minute la 650C. Pentru obinerea
unei cantiti crescute de ADN este necesar un timp de 60 de minute. Pentru fiecare 100 mg
de esut vegetal proaspt se adaug cte 400 l de tampon 2-ME/CTAB i cte 50 l de
soluie CTAB/NaCl. n cazul folosirii unor esuturi deshidratate, liofilizate sau uscate (ex.
semine), tamponul de extracie 2-ME/CTAB trebuie diluat 1:1 cu ap ultrapur.
4. Se adaug un volum egal de amestec cloroform: octanol sau cloroform: alcool
izoamilic 24:1 i se vortexeaz puternic.
5. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 40C. Se recupereaz faza apoas
superioar i se transfer ntr-un tub curat.
 6. Se adaug un volum de 1/10 soluie CTAB/NaCl din cantitatea total recuperat
peste faza apoas. Se amestec energic prin inversia tubului.
7. Dup adaugarea unui volum egal de amestec cloroform:octanol sau
cloroform:alcool izoamilic 24:1 se vortexeaz puternic.
8. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 5 minute, la 40C. Se recupereaz faza apoas
superioar i se transfer ntr-un tub curat. Aceasta poate avea o culoare galben-maronie.
9. Se adaug exact un volum de soluie de precipitare CTAB i se amestec energic
prin inversie. ADN precipitat trebuie s devin vizibil n soluie. Dac acest lucru nu se
observ se incubeaza amestecul 30 minute la 650C.
10. Centrifugare la 2000-3000 rpm, 5 minute, la 40C. Viteza de centrifugare nu
trebuie crescut foarte mult deoarece sedimentul va fi foarte greu de resuspendat. Dac
sedimentul nu este vizibil se adaug nc 1/10 soluie de precipitare CTAB din volumul
total i se incubeaza ntre 1 i 12 ore, la 370C. Ulterior se repet etapa de centrifugare.
11. Supernatantul se reia ntr-un tub curat de microcentrifug i este pstrat.
Sedimentul este resuspendat n tampon salin TRIS-EDTA (se adaug ntre 0,5 i 1 ml de
tampon salin pentru fiecare gram de material vegetal supus extraciei). Dac sedimentul nu
se resuspend se trece la o incubare timp de 30 de minute la 650C i se reia operaia pn la
resuspendarea total.
ATENIE: Este posibil ca ADN s se regseasc n supernatant. n acest caz
etapele ulterioare se vor continua folosind supernatantul. Pentru a verifica prezena ADN
n supernatant este recomandat citirea absorbanei acestuia la 260 nm.
12. ADN este precipitat prin adugarea unui volum egal de izopropanol rece. Se
omogenizeaz bine coninutul prin agitarea tubului.
13. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 15 minute, la 40C. Izopropanolul este
ndeprtat prin nclinarea tubului.
14. Sedimentul obinut se spal cu 1 ml etanol 80%, 60 de minute prin agitare.
15. Centrifugare la 8000-11000 rpm, 15 minute, la 40C. Etanolul este ndeprtat prin
nclinarea tubului. Sedimentul se las la uscat timp de 15-20 minute, la 370C, n curent de
aer.
 OPIONAL: Pentru o mai bun splare a ADN i pentru ndeprtarea total a
CTAB se repet etapele 14-15.
16. Sedimentul uscat este resuspendat ntr-un volum adecvat de ap ultrapur sau de
tampon TRIS-EDTA.

II.3. Izolarea ADN din esut animal cu fenol-cloroform (metoda Taggart)

Principiul metodei
Acest protocol descrie una dintre cele mai simple metode de extracie i purificare
de ADN genomic.
Izolarea ADN se realizeaz avnd la baz un proces de extracie n trei etape. n
prima etap are loc liza celulelor i a nucleelor acestora ntr-o soluie coninnd detergent
i EDTA. Concomitent are loc clivarea enzimatic a proteinelor folosind proteinaz K sau
amestecuri de enzime proteolitice. Eliminarea ARN din extractul de acizi nucleici se
realizeaz cu ajutorul unei soluii de ribonucleaz.
n etapa urmtoare sunt precipitate proteinele folosind un amestec de solveni
organici (fenol/cloroform/alcool izoamilic), n timp ce ADN genomic este extras n
soluie. Fenolul realizeaz o denaturare foarte eficient a proteinelor, solubilizndu-le
ulterior n faza organic. De asemnea, cloroformul este un agent denaturant al proteinelor
destul de eficient. Totodat el are i proprietatea de a stabiliza interfaa instabil dintre
faza apoas i cea fenolic, separate prin centrifugare. Amestecul fenol-cloroform are i
rolul de a reduce cantitatea de soluie apoas reinut la nivelul fazei organice, realiznd
astfel concentrare a ADN i deci o cretere a randamentului de extracie. Alcoolul
izoamilic previne amestecarea celor dou faze, organic i apoas.
n ultima etap, ADN este concentrat i desalifiat prin precipitare cu etanol absolut.
n pezena unei concentraii relativ crescute de cationi monovaleni (ntre 0,1 i 0,5 M),
etanolul induce o modificare conformaional a ADN, aceasta cauznd agregarea i
precipitarea ADN din soluie. Precipitarea cu etanol absolut este extrem de eficient
pentru concentrarea ADN i pentru eliminarea reziduurilor de fenol i cloroform din
soluia apoas deproteinizat.
n final, sedimentul de ADN este splat cu etanol 70% pentru a nltura total
srurile i moleculele organice mici iar apoi este resuspendat ntr-un volum adecvat de
tampon sau ap.
Pasul de splare cu etanol 70% se realizeaz datorit faptului c majoritatea
srurilor i unele molecule organice mici sunt solubile n aceast soluie.

Material biologic: probe biologice provenite din diferite esuturi: ficat, muchi,
aripioar nottoare, etc.
Reactivi i aparatur: i) EDTA 0,2 M; ii) N-lauroylsarcozinat de sodiu 5%; iii)
pronaz 20 mg/ml; iv) ribonucleaz 2 mg/ml; v) fenol redistilat (pH 8); vi) amestec
cloroform:alcool izoamilic 24:1; vii) etanol absolut i 70%; viii) ap ultrapur; ix)
agitator; x) microcentrifug; xi) termobloc.
ATENIE: Fenolul este toxic i poate cauza arsuri sau iritaii n zonele de contact
cu acesta.

Mod de lucru
Ziua I
1. ntr-un tub de microcentrifug de 2 ml se adaug 350 l EDTA (etilen diamin-
tetraacetic acid, tetrasodic x 2 H2O) 0,2 M, 800 l N-lauroylsarcozinat de sodiu 0,5% i
25l pronaz sau proteinaz K 20 mg/ml.
2. Se adaug esut n fiecare tub (50 mg aripioar nottoare/ 20 mg ficat/ 100 mg
esut muscular).
3. Dup amestecarea uoar, se incubeaz peste noapte, 15-16 ore, la 37C.
Ziua II
1. Se adaug 10 l de ribonucleaz n fiecare tub, se amestec i se incubeaz la
37C timp de o or.
 2. n fiecare tub se adaug 400 l fenol redistilat (pH 8), se agit puternic
aproximativ 20 secunde i mult mai uor timp de 10 minute (prin inversia repetat a
tubului sau prin vortexare la vitez mic).
3. Se adaug 400 l cloroform:alcool izoamilic (24:1) n fiecare tub. Se agit
puternic timp de 20 secunde i mult mai uor timp de 10 minute.
4. Se centrifugheaz tuburile la 13400 rpm timp de 3 minute.
5. Cu o pipet automat, se ndeprteaz, cu atenie, stratul apos superior i
coninutul se transfer ntr-un tub nou.
6. OPIONAL: Se repet etapele 3, 4, 5 pe faza superioar nou transferat.
Pentru a extrage ADN de calitate superioar i pentru a asigura o deproteinizare
eficient este recomandat repetarea, cel puin o dat, a celor trei etape. n caz contrar,
se va obine un ADN parial impurificat cu proteine.
7. Dupa adugarea a dou volume de etanol 100% rece peste faza apoas
transferat n tub, se realizeaz amestecarea prin inversia rapid a tubului de 5-6 ori.
8. Se centrifugheaz 3 minute la 13400 rpm i se ndeparteaz etanolul prin
inversia tubului.
9. Se adaug 1 ml de etanol 70% i se spal pentru cel puin o or prin agitare
uoar, urmat de centrifugare 3 minute la 13400 rpm i ndepartarea etanolului 70% prin
nclinarea tubului.
10. ADN se usuc la 37C timp de 10-15 minute i se resuspend n ap ultrapur.
Se las cel puin 24 de ore pentru solubilizarea complet la 4C. Se stocheaz la 40C, pe
termen scurt, sau la -200C, pe termen lung.

II.4. Izolarea ADN din suspensii de culturi celulare

Principiul metodei
Metoda descris n continuare este simpl i conduce la obinerea unei cantiti
relativ mari de ADN. Sedimentul de celule aflate n cultur este plasat ntr-o soluie care
conine SDS i proteinaz K i este incubat pn cnd membranele celulare sunt lizate iar
proteinele sunt degradate. Soluia este tratat cu fenol/cloroform/alcool izoamilic n
vederea deproteinizrii, iar ADN este precipitat cu etanol. n final, ADN precipitat este
splat cu etanol, uscat i resuspendat n tampon specific sau n ap ultrapur.

Material biologic: diferite tipuri de celule animale n cultur.

Reactivi: i) tampon fosfat salin (PBS) 10X: 1,37 M NaCl, 27 Mm KCl, 43 Mm
Na2HPO4 x 7 H2O, 14 mM KH2PO4. Se prepar sub forma unei soluii 10X i se dilueaz
nainte de folosire. Soluia diluat are un pH de aproximativ 7,3. Se stocheaz la
temperatura camerei pe termen nelimitat; ii) tampon de digestie: 100 Mm NaCl, 10 Mm
TRIS-HCl (Ph 8), 25 Mm EDTA (pH 8), 0,5% SDS, 0,1 mg/ml proteinaz K. Reactivul
se poate stoca la temperatura camerei. Proteinaza K este instabil la temperaturi ridicate i
trebuie adugat proaspt nainte de fiecare folosire; iii) ribonucleaz 2 mg/ml; iv)
amestec fenol: cloroform:alcool izoamilic 25:24:1; v) acetat de amoniu 7,5 M; vi) etanol
100% i 70%; vii) ap ultrapur; viii) agitator; ix) microcentrifug; x) termobloc.

Mod de lucru
1. Flascurile cu celule n cultur sunt tratate cu tripsin iar coninutul este reluat n
tuburi de centrifug de 15 sau 50 ml care sunt centrifugate 5 minute la 800 rpm i 40C.
2. Supernatantul se arunc i sedimentul se resuspend ntr-un volum de 1 pn la
10 ml de PBS rece.
3. Se repet etapele de centrifugare-resuspendare de dou-trei ori, pn cnd
sedimentul de celule este bine splat.
4. Sedimentul de celule se resuspend ntr-un volum adecvat de tampon de
digestie. Acest volum poate varia ntre 300 i 1000 l, n funcie de cantitatea de celule.
5. Celulele sunt incubate n tamponul de digestie timp de 12-16 ore, la 500C, cu
agitare uoar.
6. Se adaug 10 l de ribonucleaz i se las la incubat o or la 370C, dup care se
adaug un volum egal de amestec fenol/cloroform/alcool izoamilic i se vortexeaz
puternic circa 20-30 de secunde.
 7. Centrifugare la 10000 rpm timp de 4 minute. Dac dup centrifugare se observ
un strat subire de material alb la interfaa dintre faza apoas superioar i cea organic
inferioar se va repeta etapa 6.
8. Faza apoas este transferat ntr-un tub nou, evitndu-se impurificarea acesteia
cu faz inferioar. Se adaug volum acetat de amoniu i 2 volume de etanol absolut i
se agit prin inversia tubului. ADN trebuie s nceap imediat s precipite din soluie.
9. Centrifugare 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul este aruncat prin nclinarea
tubului, iar sedimentul este splat cu etanol 70% timp de 30-40 minute, cu agitare uoar.
10. Centrifugare 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul este decantat prin
nclinarea tubului. Sedimentul este uscat la 370C timp de 15-20 de minute.
11. ADN se resuspend n ap ultrapur. Se las cel puin 24 de ore pentru
dizolvare complet la 4C. Se stocheaz la 40C, pe termen scurt i la -200C, pe termen
lung.

II.5. Izolarea ADN genomic din snge

Principiul metodei
Protocolul de fa asigur izolarea ADN genomic din snge n dou etape. n prima
etap se face o izolare a limfocitelor din probele proaspete de snge. n a doua etap se
realizeaz practic izolarea ADN din limfocite. Deproteinizarea se face folosind o soluie
salin saturat iar ADN este precipitat cu etanol.

Etapa I: Izolarea limfocitelor

Material biologic: probe proaspete de snge recoltate n recipiente speciale vidate
avnd drept anticoagulant EDTA, heparin sau citrat de sodiu.
Reactivi i aparatur: i) tampon clorur de amoniu: clorur de amoniu 140 mM,
TRIS 17 mM (pH 7,5); ii) tampon fosfat salin (PBS) 10X: 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 43
mM Na2HPO4 x 7 H2O, 14 mM KH2PO4. Se prepar sub forma unei soluii concentrate
10X i se dilueaz nainte de folosire. Soluia diluat are un pH de aproximativ 7,3 i se
stocheaz la temperatura camerei pe termen nelimitat; iii) microcentrifug; iv) agitator.
Mod de lucru
1. ntr-un tub de centrifug de 50 ml se amestec 10 ml snge cu 40 ml tampon
clorur de amoniu.
2. Amestecul se plaseaz pe ghea timpde ntre 30 de minute i o or, pn cnd
soluia devine nchis la culoare. Se centrifugheaz 10 minute, la 800 rpm i la
temperatura camerei.
3. Se ndeprteaz supernatantul i sedimentul se usuc pe hrtie de filtru. Se spal
prin agitare cu 20 ml PBS.
4. Centrifugare 10 minute la 700 rpm i la temperatura camerei. Se ndeprteaz
supernatantul i sedimentul se usuc pe hrtie de filtru. Se spal prin agitare cu 5 ml PBS.
5. Centrifugare 10 minute, la 700 rpm i la temperatura camerei.
6. Se ndeprteaz supernatantul, iar sedimentul de limfocite este folosit imediat la
extracia ADN.
7. OPIONAL: Dac dorim s realizm extracia n alt zi limfocitele trebuie
pstrate la -20C. Sedimentul este resuspendat ntr-un volum de 1 ml PBS i limfocitele se
transfer ntr-un tub nou de centrifug de 2 ml. Se realizeaz o a doua splare cu 1 ml
PBS a tubului n care s-a realizat izolarea i coninutul se transfer n acelai tub.
8. Centrifugare 10 minute la 700 rpm. Supernatantul este ndeprtat i sedimentul
se stocheaz la -200C.

Etapa II: Extracia ADN

Material biologic: sediment de limfocite proaspt sau ngheat.
Reactivi i aparatur: i) tampon de liz: 10 mM TRIS-HCl (pH 8), 10 mM EDTA
(pH 8), 0,5% SDS. Reactivul se poate stoca la temperatura camerei; ii) soluie salin
saturat: NaCl 18%; iii) proteinaz K 10 mg/ml; iv) tampon de resuspendare TRIS-EDTA
(pH 8): 10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA; v) ribonucleaz 2 mg/ml; vi) ap ultrapur; vii)
etanol 100% i 70%; viii) microcentrifug; ix) agitator.
 Mod de lucru
1. Peste sedimentul de limfocite proaspt sau ngheat se adaug 1 ml PBS i se
vortexeaz pn se aduc toate celulele n suspensie.
2. Se adaug 10 ml tampon de liz i 100 l proteinaz K. Se amestec uor.
3. Amestecul este incubat o or la 65C sau peste noapte la 37C. Pentru un
randament mai bun al extraciei i pentru o mai bun calitate a ADN extras este de
preferat incubarea peste noapte a amestecului.
4. Se adaug 10 l soluie ribonucleaz, se amestec prin inversia tubului i se
incubeaz o or la 370C.
5. Se adaug 4,3 ml soluie salin saturat i se amestec puternic 30 de secunde.
6. Centrifugare 10 minute, la 5000 rpm i 4C. Supernatantul se transfer ntr-un
tub nou de 50 ml.
7. Peste supernatant se adaug ncet, pe perei i prin rotirea constant a tubului, 30
ml de etanol absolut. Se amestec uor, prin inversia tubului pn cnd ADN precipit.
8. Se centrifugheaz 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul se nltur prin
nclinarea tubului, iar sedimentul este splat cu etanol 70%, 30-40 minute, cu agitare
uoar.
9. Centrifugare 3 minute la 10000 rpm. Supernatantul este nlturat prin nclinarea
tubului. Sedimentul este uscat la 370C timp de 15-20 de minute.
10. ADN se resuspend n 2 ml tampon TE. Se las cel puin 24 de ore pentru
dizolvare complet la 4C. Se stocheaz la 40C pe termen scurt i la -200C pe termen lung.

II.6. Izolarea ADN din material seminal

Principiul metodei
Izolarea ADN genomic din material seminal se realizeaz printr-un proces de
extracie salin. n prima etap are loc liza celulelor seminale ntr-un tampon de liz,
urmat de precipitarea proteinelor cu o soluie de NaCl 6M. ADN genomic cu mas
molecular mare rmne n soluie fiind apoi concentrat i desalifiat prin precipitare cu
izopropanol.

Material biologic: paiete cu material seminal proaspete sau crioconservate.

Reactivi i aparatur: i) soluie de precipitare a proteinelor: NaCl 6 M; ii) tampon
de liz: 10 mM EDTA (pH 8), 1% Sodium dodecil sulfat (SDS) i 100 Mm NaCl; iii)
soluie ditiotreitol (DTT) 500 Mm; iv) soluie proteinaz K 20 mg/ml; v) ser fiziologic:
NaCl 0,9%; vi) izopropanol 100%; vii) etanol 70%; viii) ap ultrapur; ix) agitator; x)
microcentrifug; xi) termobloc.

Mod de lucru
Ziua I
1. Coninutul unei paiete de material seminal (aproximativ 25 l) este introdus ntr-
un tub de microcentrifug steril de 1,5 ml, peste care se adug 0,5 ml ser fiziologic.
2. Se omogenizeaz probele dup care se centrifugheaz 3 minute la 6500 rpm.
3. Supernatantul este ndeprtat iar sedimentul de celule seminale este resuspendat
din nou cu 1 ml de ser fiziologic.
4. Se centrifugheaz probele 3 minute la 6500 rpm i se ndeprteaz
supernatantul.
5. Peste sedimentul de celule seminale se adug 450 l tampon de liz dup care
acesta este resuspendat n supernatant prin aspirare uoar cu ajutorul unei micropipete.
6. Se adaug 50 l DTT, se omogenizeaz i apoi se adaug 10 l proteinaz K.
7. Probele se omogenizeaz printr-o inversie uoar dup care se incubeaz 12-14
ore la 600C.
Ziua II
1. Se adaug 160 l NaCl i se amestec viguros timp de 1-2 minute prin
vortexare. La sfrit vor aprea vizibile agregatele de resturi proteice.
 2. Centrifugare 10 minute la 13000 rpm. Supernatantul se transfer n alt tub de
microcentrifug coninnd 500 l izopropanol 100% la temperatura camerei i se agit
uor prin inversarea tubului pn la precipitarea ADN din soluie.
3. Centrifugare 1 minut la 13000 rpm. Se ndeprteaz supernatantul prin inversia
tubului i se adaug 500 l etanol 70% la temperatura camerei. Se inverseaz uor tubul
timp de cteva minute pentru a spla sedimentul de ADN i se centrifugeaz 1 minut la
13000 rpm.
4. Etanolul se nltur complet prin inversia tubului pe o hrtie de filtru. Se usuc
precipitatul, 15 - 20 minute, la 37oC.
5. Precipitatul de ADN se rehidrateaz ntr-un volum adecvat de ap ultrapur.
ADN astfel obinut se pstreaz la 40C pe termen scurt sau la 20 0C pe termen mai lung.

II.7. Izolarea ADN din esuturi mparafinate

Principiul metodei
esuturile mparafinate sunt folosite la ora actual n multe metode de diagnostic i
de analiz a bolilor. Ca atare apare necesitatea dezvoltrii unor tehnici de extracie a ADN
din aceste tipuri de probe. Principalul impediment care apare n acest caz este eliminarea
total a urmelor de parafin de la nivelul seciunilor, aceasta putnd bloca procedeele de
extracie a ADN. n cazul tehnicii prezentate mai jos se va realiza o deparafinare cu xilen
a probelor, urmat de o extracie a ADN prin metoda clasic care utilizeaz
fenol/cloroform. Precipitarea materialului genetic se face utiliznd izopropanol.

Material biologic: seciuni mparafinate.

Reactivi i aparatur: i) tampon de liz: proteinaz K 20 mg/ml, 50 l, soluie
Tris-HCl 1 M, 10 l, EDTA 0,5 M 2 l, SDS 10%, 100 l, ap distilat 838 ml; ii)
amestec fenol/ cloroform/ izopropanol 25:24:1; iii) acetat de sodiu 3 M; iv) ap ultrapur;
v) xilen; vi) etanol absolut i etanol 75%; vii) izopropanol; viii) agitator; ix)
microcentrifug; x) termobloc.
 Mod de lucru
1. La nceput se realizeaz deparafinarea esuturilor. Pentru aceasta, ntr-un tub de
2 ml coninnd cteva seciuni mparafinate, se adaug 1 ml de xilen i se las 30 minute
la 37C.
2. Se nltura xilenul i se adaug din nou 1 ml peste esuturile mparafinate. Se
incubeaz 30 minute la 37C. Etapa poate fi repetat nc de o dat pentru asigurarea unei
bune deparafinri.
3. Se nltura xilenul i se fac alte dou splari de cte 30 de minute folosind etanol
absolut. Etanolul absolut este ndeprtat i se fac alte dou splari de cte 30 de minute
folosind etanol 75%.
4. Etanolul 75% este nlturat i se fac alte dou splari de cte 15 minute folosind
tampon fosfat salin.
5. Se adaug 500 l de tampon de liz i se incubeaz la 52C peste noapte. Liza
trebuie s se desfoare pn cnd seciunile deparafinate sunt total dizolvate n tampon.
6. Se adaug 500 l amestec cloroform/alcool izoamilic/izopropanol. Se agit
puternic i se centrifugheaz 10 minute la 12000 g.
7. Supernatantul este transferat ntr-un tub nou de centrifug. Peste acesta se
adaug un volum egal de cloroform. Se agit puternic i se centrifugheaz 5 minute la
12000 g.
8. Faza apoas superioar este transferat cu atenie n alt tub de centrifug. Peste
acesta se adaug 1/10 volume de acetat de sodiu 3 M. Se agit puternic.
9. Se adaug 1 volum de izopropanol, se agit i se incubeaz la 20C peste
noapte.
10. Centrifugare 4 minute, la 4C i 12000 g. Supernatantul se arunc, iar
precipitatul este splat cu 1 ml de etanol 75% prin agitare uoar.
11. Centrifugare 4 minute la 12000 g. Etanolul este ndeprtat prin nclinarea
tubului i sedimentul ADN este uscat prin centrifugare la vid 3 minute sau prin plasare la
37C timp de 15 minute.
 12. ADN se resuspend n ap ultrapur iar apoi se las cel puin 24 de ore pentru
solubilizarea complet la 4C. Se stocheaz la 40C, pe termen scurt, sau la -200C, pe
termen lung.

II.8. Izolarea ADN din plasm sau ser

Principiul metodei
La indivizii normali, cantitile de ADN din astfel de probe sunt foarte sczute dar
suficiente pentru a servi drept matrie la o reacie de amplificare n lan (PCR
Polimerase Chain Reaction). De asemenea, o cantitate sporit de ADN n ser sau plasm
este ntlnit n cazul unor afeciuni precum cancerul, bolile autoimune sau infecioase.
Protocolul urmtor reprezint o metod simpl i eficient de izolarea ADN din astfel de
probe.

Material biologic: plasm sau ser.

Reactivi i aparatur: i) tampon de liz 10X: SDS 10%, proteinaz K 0,5%. Se
prepar sub form concentrat i se dilueaz nainte de folosire; ii) tampon Tris-EDTA
(TE): 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8; iii) amestec fenol/cloroform 1:1; iv) glicogen
10 mg/l; v) acetat de amoniu 7,5 M; vi) etanol absolut i etanol 70%; vii) agitator; viii)
microcentrifug; ix) termobloc.

Mod de lucru
1. ntr-un tub de centrifug de 15 ml se adaug 1,5 ml ser sau plasm, 1,5 ml
tampon de liz 1X i se agit energic. Se las la incubat peste noapte la 55C.
2. Peste amestecul incubat se adaug 3 ml de amestec fenol/cloroform. Se agit
puternic timp de 30 de secunde i se centrifugheaz 10 minute la 1000 g folosind rotor
swing-out.
3. Faza superioar apoas se transfer ntr-un tub centrifug i se repet etapa 2.
 4. Faza superioar apoas este transferat ntr-un tub nou i peste aceasta se adaug
5 l glicogen, 1 ml soluie acetat de amoniu i 8 ml de etanol absolut. Se amestec prin
inversarea tubului de mai multe ori i se centrifugheaz 40 de minute la 2500 g.
5. Supernatantul este ndeprtat prin nclinarea tubului iar sedimentul este splat n
10 ml de etanol 70% prin agitare uoar.
6. Se centrifugheaz 10 minute la 2500 g. Se ndeprteaz etanolul prin nclinarea
tubului. Sedimentul se usuc n curent de aer sau prin incubare 15 minute la 37C.
9. Sedimentul uscat este reluat ntr-un volum adecvat de tampon TE sau de ap
ultrapur.

II.9. Izolarea ADN de la nivelul celulelor somatice din lapte

Principiul metodei
Laptele poate reprezenta un material biologic bun pentru izolarea de material
genetic. Astfel, n lapte se gsesc mai multe tipuri de celule somatice reprezentate n
principal de celule epiteliale, limfocite, macrofage i polimorfonucleare. Aceste celule pot
servi drept surs pentru extracia ADN.
Protocolul dezvoltat de dAngelo et al. (2007) necesit n prealabil realizarea unei
degresri a laptelui prin centrifugare. Ulterior are loc o liz a celulelor somatice, o
deproteinizare, iar precipitarea ADN se realizeaz utiliznd izopropanolul. Metoda poate
fi folosit cu succes n locul extraciei ADN din snge deoarece laptele poate fi procurat
mult mai uor, prin metode neinvazive.

Material biologic: probe de lapte.

Reactivi: i) tampon fosfat salin (PBS) 10X: 1,37 M NaCl, 27 Mm KCl, 43 Mm
Na2HPO4 x 7 H2O, 14 Mm KH2PO4. Se prepar sub forma unei soluii 10X i se dilueaz
nainte de folosire. Soluia diluat are un pH de aproximativ 7,3. Se stocheaz la
temperatura camerei pe termen nelimitat; ii) tampon de liz: 0,32 M sucroz; 10 mM Tris-
HCl pH 7,5; 5 mM MgCl2; 1% Triton X-100; iii) SDS 10%; iv) proteinaz K 10 mg/ml;
v) tampon de extracie: 10 mM Tris-HCl, pH 8 i 2 mM EDTA; vi) tampon Tris-EDTA
(TE): Tris 10 mM, 1 mM EDTA, pH 7,5; vii) NaCl 5 M; viii) izopropanol; ix) ap
ultrapur; x) microcentrifug; xi) agitator; xii) termobloc.
Mod de lucru
1. O cantitate de 40 ml de lapte este centrifugat timp de 30 de minute la 2000 g i
4C. Ulterior, stratul superior de grsime i supernatantul sunt ndeprtate.
2. Sedimentul este resuspendat n 1 ml tampon fosfat salin i apoi centrifugat 10
minute la 400 g i 4C.
3. Sedimentul este resuspendat n 49 ml de tampon de liz, este agitat puternic i
apoi este centrifugat la 2500 g, timp de 10 minute, la 4C.
4. Supernatantul este ndeprtat prin nclinarea tubului iar sedimentul este
resuspendat n soluie de splare. Se agit uor i se centrifugheaz la 2500 g, timp de 10
minute, la 4C. Etapa de splare poate fi repetat.
5. Sedimentul splat este resuspendat n 3 ml tampon de extracie la care se adaug
100 l de SDS 10% i 40 l de proteinaz K. Amestecul este incubat o or la 65C.
6. Se adaug 500 l soluie clorur de sodiu i se agit energic timp de 20-30 de
secunde. Se centrifugheaz 10 minute la 3500 g.
7. Supernatantul este transferat ntr-un tub nou de centrifug i peste acesta se
adaug 6 ml de izopropanol rece. Se agit tubul prin nclinare pentru a precipita ADN.
8. Centrifugare la 3500 g, 10 minute. Supernatantul este ndeprtat, iar sedimentul
ADN este resuspendat ntr-un volum adecvat de tampon TE sau ap ultrapur.

I.10. Izolarea ARN total cu guanidin-tiocianat (metoda Chomczynski)

Principiul metodei
Celulele n cultur sau fragmentele de esut sunt bine omogenizate ntr-o soluie
denaturant care conine guanidin-tiocianat. Acesta este unul dintre cei mai eficieni
ageni denaturani ai proteinelor. Omogenatul este ulterior amestecat n mai multe etape
cu soluii de acetat de sodiu, fenol i cloroform/ alcool izoamilic. n urma centrifugrii, n
faza superioar apoas separat, se va regsi ARN total, iar n faza inferioar, organic, se
vor gsi proteinele i ADN. ARN astfel separat va fi precipitat cu izopropanol i ulterior,
splat cu etanol 75%.
La baza metodei st proprietatea ARN de a rmne solubilizat ntr-o soluie apoas
care conine guanidin-tiocianat i amestec de fenol/ cloroform/ alcool izoamilic, in jurul
valorii de pH 4,0. n aceleai condiii proteinele i fragmentele mici de ADN (cu mrimi
ntre 50 pb i 10 Kpb) trec n faza organic, iar fragmentele mai mari de ADN se regsesc
la interfaa celor dou faze.
Se recomand ca extracia ARN prin aceasta metod s se realizeze din esuturi i
celule proaspete. Dac acest lucru nu este posibil apare necesitatea crioconservrii n azot
lichid imediat dup prelevare. Toate soluiile sunt preparate cu ap tratat cu DEPC
(dietil-pirocarbonat), inhibitor specific al ribonucleazelor. De asemenea, recipientele de
lucru sunt splate cu acelai tip de ap.

Material biologic: probe din diferite tipuri de esuturi, celule animale n cultur.
Reactivi i aparatur: i) soluie denaturant: Guanidin-tiocianat 4 M, Citrat de
sodiu 25 mM, 0,5% N-lauroilsarcozin, 2-mercaptoetanol 0,1 M. Pentru prepararea
soluiei stoc se amestec 293 ml de ap cu 17,6 ml soluie citrat de sodiu 0,75 M (pH 7) i
cu 26,4 ml soluie N-lauroilsarcozin 10%. Se adaug apoi 250 g guanidin-tiocianat i se
nclzete sub agitare continu la 650C, pentru dizolvare. Soluia se poate stoca timp de
maxim 3 luni la temperatura camerei. Soluia de lucru se prepar prin adugarea a 0,35 ml
2-mercaptoetanol la 50 ml de soluie stoc. Se poate stoca maxim o lun la temperatura
camerei; ii) izopropanol 100%; iii) etanol 75% (preparat cu ap tratat cu DEPC); iii)
soluie acetat de sodiu 2 M (pH 4). Se adaug 16,42 g acetat de sodiu anhidru n 40 ml
ap i apoi se mai adaug 35 ml acid acetic glacial. Se aduce la pH 4 cu acid acetic
glacial, iar apoi se completeaza la 100 ml cu ap; iv) soluie de fenol saturat n ap: se
dizolv 100 g fenol n 100 ml ap la 650C. La final se nltur faza apoas superioar. Se
poate stoca la 40C i ntuneric timp de o lun; v) amestec cloroform/ alcool izoamilic 49:1
(v/v); vi) ap tratat cu DEPC: se adaug 0,2 ml DEPC la 100 ml ap. Se amestec
puternic cteva minute, iar solutia obinuta se autoclaveaz pentru a inactiva eventualele
urme de DEPC; vii) minicentrifug; viii) agitator; ix) termobloc.
ATENIE: Fenolul este toxic i cauzeaz arsuri sau iritaii n zonele de contact.

Mod de lucru
1a. Pentru esuturi: se adaug 500 l de soluie de denaturare la 50 mg de esut i
se omogenizeaz energic.
1b. Pentru culturi de celule: se centrifugheaz suspensia celular i se nltur
supernatantul. Se adaug 500 l de soluie de denaturare la 104 celule i se agit
aproximativ 10 minute cu pipeta automat prin aspersie-dispersie.
2. Omogenatul se transfer ntr-un tub steril de 2 ml. Se adaug 50 l de soluie de
acetat de sodiu si 500 l fenol i se vortexeaz puternic timp de 20-30 de secunde.
3. Se adaug 100 l de amestec cloroform/ alcool izoamilic i se vortexeaz
puternic timp de 20-30 de secunde. Tuburile se incubeaz 15 minute pe ghea.
5. Centrifugare 20 minute la 10000 g i 40C. Faza apoas superioar se transfer
ntr-un tub nou.
6. Se realizeaz precipitarea ARN adugnd un volum egal de izopropanol 100%.
Tuburile se incubeaz 30 de minute la -200C.
7. Centrifugare 10 minute la 10000 g i 40C. Supernatantul este nlturat.
Sedimentul este resuspendat i dizolvat n 200 l de soluie de denaturare i este transferat
ntr-un tub nou.
8. Se realizeaz precipitarea ARN adugnd 300 l izopropanol 100%. Tuburile se
incubeaz 30 de minute la -200C.
10. Centrifugare 10 minute la 10000 g i 40C. Supernatantul este nlturat.
Sedimentul ARN este resuspendat n 900 l etanol 75%, vortexat i incubat 10 - 15
minute la temperatura camerei.
11. Centrifugare 5 minute la 10000 g i 40C. Supernatantul este nlturat.
Sedimentul ARN este uscat la 370C, 10 15 minute. Acesta nu trebuie uscat total
deoarece aceasta va duce la scderea solubilitii ARN.
 12. Sedimentul ARN este solubilizat n 100-200 l ap tratat cu DEPC. Se
incubeaz 10-15 minute la 550C. ARN astfel obinut este pstrat la -800C.

I.11. Izolarea ARN din snge

Principiul metodei
Tehnica se bazeaz pe extracia ARN dup metoda adaptat de Chomczynski i
Sacchi n 1987. La baza metodei st proprietatea ARN de a rmne solubilizat ntr-o
soluie apoas care conine guanidin-tiocianat i amestec de fenol/ cloroform/ alcool
izoamilic, la pH acid. n aceleai condiii proteinele i fragmentele mici de ADN trec n
faza organic, iar fragmentele mai mari de ADN se regsesc la interfaa celor dou faze.
n cadrul metodei este recomandat folosirea sngelui proaspt, recoltat pe
anticoagulant. De asemenea, este necesar tratarea tuturor soluiilor de lucru i a
recipientelor cu ap care conine DEPC (dietil-pirocarbonat).

Material biologic: probe proaspete de snge recoltate pe anticoagulant.

Reactivi i aparatur: i) tampon de liz al eritrocitelor: sucroz 1,6 M, Triton X-
100 5%, MgCl2 25 mM, Tris-HCl 60 mM (pH 7,5). Se pstreaz la 4C i se utilizeaz
rece; ii) tampon de extracie: guanidin tiocianat 5,25 M, Tris-HCl 50 mM (pH 6,4), EDTA
20 mM, Triton X-100 1%, 2-mercaptoetanol 0,1% (se adaug extemporaneum); iii) acetat
de sodiu 2 M (pH 4); iv) fenol (saturat cu soluie Tris-HCl 1 M, EDTA 0,1 M), pH 8; v)
amestec cloroform/ alcool izoamilic 24:1; vi) izopropanol; vii) etanol 70%; viii) ap
ultrapur; vii) microcentrifug; viii) agitator; ix) termobloc.

Mod de lucru
1. ntr-un tub de microcentrifug se amestec 100 l de snge cu 1 ml de tampon
de liz al eritrocitelor. Se las la temperatura camerei timp de 5-10 minute, cu agitare
ocazional, pn cnd eritrocitele sunt lizate n totalitate.
 2. Centrifugare 45 de secunde la 13000 rpm. Se nltur supernatantul prin
nclinarea tubului. Sedimentul de celule este reluat prin agitare n lichidul rezidual rmas
n tub.
3. Se adaug 200 l tampon de extracie peste celulele resuspendate i se amestec
cu vrful pipetei. Peste celulele resuspendate se adaug 20 l acetat de sodiu 2 M i se
agit uor.
4. Se adaug 220 l fenol i se agit uor prin inversie. Peste amestec se adaug 60
l de amestec cloroform/ alcool izoamilic i se agit puternic timp de 20-30 de secunde.
Tuburile se plaseaz pe ghea 15 minute.
5. Centrifugare 5 minute la 13000 rpm. Faza superioar apoas se transfer ntr-un
tub nou de microcentrifug. Se adaug 200 l de izopropanol rece, se agit puternic i se
las 30 de minute la -20C.
6. Centrifugare 15 minute la 13000 rpm. Supernatantul este nlturat, iar
sedimentul este resuspendat n 200 l tampon de extracie.
7. Se spal sedimentul cu 400 l de etanol 70% rece. Centrifugare 5 minute la
13000 rpm. Supernatantul se arunc prin nclinarea uoar a tubului.
8. Sedimentul se usuc n curent de aer i se resuspend ntr-un volum adecvat de
ap ultrapur. Soluia este incubat 15 minute la 50C pentru solubilizarea ARN i apoi
este stocat la -80C, evitndu-se ciclurile de nghe-dezghe.
CAPITOLUL III
METODE DE ANALIZ ALE BAZELOR AZOTATE I ACIZILOR
NUCLEICI

III.1. Spectrele de absorbie ale bazelor azotate

Principiul metodei
Bazele purinice i pirimidinice, nucleozidele i nucleotidele corespunztoare pot fi
uor detectate datorit absorbiei lor n UV. Bazele purinice i derivaii lor nucleozidici i
nucleotidici au o absorbie mai mare dect pirimidinele i derivaii lor.
Spectrul de absorbie n UV pentru fiecare baz azotat sau nucleotid depinde de
pH. La pH 7, lungimea de und la care se nregistreaz maximul de absorbie pentru
bazele azotate se situeaz n jurul valorii de 260 nm.

Reactivi i aparatur: i) Soluii de baze azotate 10 g/ml; ii) spectrofotometru

UV-VIS.

Mod de lucru: se realizeaz spectrul de absorbie pentru toate soluiile de baze

azotate n intervalul 200400 nm.

Rezultate i discuii
n urma realizrii spectrelor se vor observa maximele de absorbie pentru fiecare
soluie de baz azotat n parte. Valorile acestor maxime pot varia ntre anumite limite n
funcie de pH.
n figurile 7 i 8 sunt prezentate spectrele de absorbie cele patru baze azotate
ntlnite n structura ADN, la pH 6. Se pot observa maximele de absorbie cuprinse n
intervalul 260 - 270 nm.
Figura 7: Spectrele de absorbie ale unor soluii de citozin i adenin la pH 6.

Figura 8: Spectrele de absorbie ale unor soluii de guanin i timin la pH 6.

III.2. Spectrul de absorbie al ADN. Determinarea spectrofotometric a
puritii i concentraiei ADN.

Principiul metodei
ADN extras din diferite surse biologice trebuie verificat pentru estimarea puritii
i integritii nainte de a fi utilizat n diferite manipulri moleculare.
Aprecierea gradului de puritate al unui extract ADN se realizeaz prin evaluarea
valorii absorbanei la diferite lungimi de und (260 i 280 nm), la un spectrofotometru
UV, n cuve de cuar cu drum optic cunoscut.
Folosirea acestor cuve este absolut necesar deoarece cuarul permite trecerea
radiaiilor luminoase din spectrul UV.
n paralel, se recomand i determinarea ntregului spectru de absorbie al probei n
domeniul 200 - 400 nm, pentru a evidenia prezena altor maxime la lungimi de und
diferite de cele de interes, care pot aparine eventualilor contaminani.
Verificarea puritii ADN se realizeaz spectrofotometric pe baza urmtoarelor
considerente:
i) moleculele de ADN mono- sau dublucatenar prezint absorban maxim la
lungimi de und cuprinse ntre 257 i 260 nm;
ii) proteinele care pot impurifica extractul au absorbana maxim la 280 nm;
iii) glucidele rmase eventual n extract au absorbanta maxima la la 230 nm;
iv) oligonucleotidele rezultate din fragmentarea ADN n timpul extraciei prezint
absorbana maxim la 220 nm.
Determinarea concentraiei ADN dintr-un extract se bazeaz pe citirea absorbanei
la 260 nm i pe folosirea urmtoarelor formule:
A260 = 1 corespunde la 50 g ADN dc/ml;
A260 = 1 corespunde la 33 g ADN mc/ml.

Reactivi i aparatur: i) soluie de ADN de concentraie necunoscut; ii)

spectrofotometru UV-VIS.
 Mod de lucru
Se determin spectrul de absorbie pentru soluia de ADN n intervalul 200400
nm i se identific maximul de absorbie. Se citesc absorbanele soluiei de ADN la 260,
230 i 280 nm i se calculeaz valorile rapoartelor A260/A280 i A260/A230 pentru a
determina gradul de puritate al soluiei. Cu ajutorul valorii de absorban la 260 nm se
calculeaz concentraia soluiei de ADN folosind formulele de mai sus.

Rezultate i discuii
n figura 9 este prezentat spectrul de absorbie al unei soluii de ADN cu
identificarea maximului la 260nm. Eventualele maxime de absorbtie pot fi datorate
potenialilor contaminani din soluia de ADN.

Figura 9: Spectrul de absorbie al unei soluii de acid deoxiribonucleic.

n funcie de valorile A260 i A280 se poate stabili gradul de contaminare proteic

sau cu ARN a extractului ADN. Raportul optim A260/A280 este cuprins ntre 1,8 i 2. Un
raport mai mic de 1,8 ne indic prezena proteinelor n timp ce un raport mai mare de 2
este un indiciu al contaminrii cu ARN.
 Raportul A260/A230 ofer informaii asupra gradului de contaminare cu polizaharide
a extractului ADN. Valoarea normal a acestuia este 2. Un raport mai mic indic o
contaminare cu polizaharide.

III.3. Efectele hipocromic i hipercromic ale ADN

Principiul metodei
Absorbana unei soluii de ADN la 260 nm reprezint mai puin de 40% din
valoarea obinut prin nsumarea absorbanelor tuturor bazelor azotate componente,
datorit interveniei fortelor de stivuire care contribuie la mascarea acestora n structura
macromoleculei de ADN. Fenomenul poart numele de efect hipocromic al ADN. Prin
nclzirea i/sau denaturarea moleculei de ADN se observ apariia efectului hipercromic.
Efectul se concretizeaz prin creterea absorbanei i este cauzat att de ruperea
legaturilor de hidrogen, ct i de dispariia forelor de stivuire din structura
macromoleculei.

Reactivi i aparatur: i) soluie de ADN 50 g/ml; ii) spectrofotometru UV-VIS.

Mod de lucru
Se msoar absorbana soluiei de ADN la 260 nm, la temperatura camerei. Se
nclzete soluia de ADN la fierbere timp de 5 minute i se plaseaz apoi direct pe
ghea. Dup 5-10 minute se citete absorbana.

III.4. Verificarea integritii ADN prin electroforez n gel de agaroz

Principiul metodei
Electroforeza n gel de agaroz constituie o metod standard pentru separarea,
purificarea i identificarea moleculelor de ADN, inclusiv din amestecuri de unde acestea
nu pot fi separate adecvat prin alte tehnici.
 Pentru verificarea integritatii ADN genomic, precum i pentru estimarea gradului
de contaminare cu ARN, extractul este supus unei electroforeze n gel de agaroz, n
sistem submers pe plac orizontal. La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcina
electric global negativ. Ca urmare, dac sunt plasai ntr-un cmp electric, moleculele
acestora vor migra ctre anod.
Vizualizarea moleculelor de ADN se va realiza folosind bromura de etidiu. Acest
fluorocrom este un agent intercalant care se inser ntre planurile formate de bazele
azotate la nivelul macromoleculei de ADN. Prin excitarea bromurii de etidiu n lumina
UV ( = 250 - 310 nm) se obine o emisie n domeniul vizibil, la 520 nm (culoare roz-
portocalie).

Material biologic: probe de ADN genomic. Se pot folosi n scop comparativ probe
pstrate n condiii optime i probe lsate cteva zile la temperatura camerei (n cazul
acestora poate fi evideniat fenomenul de fragmentare).
Reactivi i aparatur: i) tampon de electroforez: TAE 1X TRIS 0,040 M, acid
acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepar ca soluie 10X care este apoi diluat nainte
de folosire; ii) tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X; iii)
soluie de bromur de etidiu 10 mg/ml; iv) agaroz; v) tanc de electroforez orizontal
pentru separare de acizi nucleici; vi) surs de curent; vii) transiluminator UV.
ATENIE: Bromura de etidiu este toxic i are un puternic efect mutagen.

Mod de lucru
1. ntr-un pahar Erlenmeyer se cntresc 0,4 g agaroz. Peste ea se adaug 40 ml
tampon TAE 1X (concentraia final a agarozei 1%). Paharul se acopera cu o folie de
plastic sau cu staniol i se nclzete la fierbere pn la dizolvarea total a agarozei.
2. Soluia obinut este lsat la rcit pn la o temperatur de 50-60 oC. n acest
timp se vor aduga 2 l bromur de etidium pentru a permite vizualizarea ulterioar a
ADN.
 3. Se izoleaz tvia aparatului de electroforeza cu band adeziv. Se monteaz
pieptenul astfel nct dinii acestuia s nu atinga tavia i apoi se toarn gelul cald (50oC).
Se las 30-40 de minute la temperatura camerei pentru solidificare.
4. Se ndeprteaz banda adeziv i pieptenul cu mare atenie, iar gelul solidificat
complet se introduce n aparat.
5. Se amestec proba de analizat cu tamponul sau i se ncarc cu mare atenie n
godeuri cu o pipet automat.
6. Se pune capacul aparatului i se conecteaz la sursa de curent fixat la o tensiune
constant (aproximativ 3V/cm). Durata migrrii este de 50-60 de minute.
7. La finalizarea migrrii moleculele de ADN se vor vizualiza cu ajutorul unui
transiluminator UV.

Rezultate i discuii
Moleculele de ADN genomic migreaz limitat deoarece sunt extrem de
voluminoase. naintarea prin gelul de agaroz este foarte nceat datorit rezistenei opus
de acesta i imposibilitii moleculelor de a ptrunde n porii gelului.

Figura 10: Electroforez de ADN genomic n gel de agaroz n scopul evidenierii integritii acestuia.
Liniile 1 6: ADN genomic nefragmentat.
 n cazul unor molecule de ADN integre, nefragmentate, acestea vor putea fi
observate sub forma unei benzi compacte, n apropierea godeurilor de start (Figura 10).
Cu ct banda este mai groas i mai intens, cu att proba de ADN este mai concentrat i
mai nefragmentat.
n cazul unui ADN genomic degradat, fragmentat, benzile nu vor fi compacte i
vor aprea sub forma unor dre/comete (Figura 11). Aceste dre/comete sunt cu att
mai lungi i mai intense, cu ct ADN este mai degradat. Ele apar datorit fragmentelor
mici de ADN rezultate n urma scindrii macromoleculelor iniiale. Degradarea probelor
de ADN genomic apare n urma pstrrii acestora n condiii neadecvate, procesul putnd
merge pn la degradarea total a ADN.

Figura 11: Electroforez de ADN genomic n gel de agaroz n scopul evidenierii integritii acestuia.
Liniile 4, 5: ADN genomic nefragmentat; liniile 1, 2, 8: ADN genomic parial degradat, linia 6: ADN
genomic puternic degradat, liniile 3, 7: ADN genomic degradat aproape n totalitate.

III.5. Electroforeza ADN n gel de poliacrilamid

Principiul metodei
Electroforeza reprezint o metod fizico-chimic, analitic i preparativ care se
bazeaz pe fenomenul migrrii unor particule ncrcate electric, ntr-un mediu lichid sau
fixat pe suport solid, sub aciunea unui cmp electric extern.
 Gelul de poliacrilamid are proprieti optime de separare electroforetic. Este
stabil, transparent, flexibil si se obine prin copolimerizarea acrilamidei cu N,N-metilen-
bisacrilamidei, n prezena de N,N,N,N-tetrametiletilendiaminei (TEMED) i a
persulfatului de amoniu drept catalizatori.
Practic, gelul de poliacrilamid poate fi considerat o sit molecular n care
mrimea porilor depinde de concentraiile iniiale ale monomerilor i de condiiile n care
se desfoar reacia de polimerizare (sistem catalitic, temperatur).

Material biologic: probe ADN genomic, produi PCR.

Reactivi i aparatur: i) soluie stoc acrilamid/bis-acrilamid 29:1 (30% m/v); ii)
tampon de ncrcare 5X. Pentru un volum de 50 ml se amestec reactivii prezentai n
tabelul 1; iii) N,N,N,N-Tetrametilendiamin (TEMED); iv) persulfat de amoniu 10%; v)
soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; vi) ap ultrapur; vi) tampon de electroforez TBE
10X: TRIS 900 mM, acid boric 890 mM, EDTA x 2H2O, sare tetrasodic 18 mM. Se
prepar sub forma unei soluii 10X care este apoi diluat de zece ori nainte de folosire.
Se stocheaz la temperatura camerei; vii) tanc de electroforez vertical pentru acizi
nucleici; viii) surs de curent; ix) agitator; x) plit cu agitare magnetic i nclzire; xi)
transiluminator UV.

Tabel 1: Reactivii i cantitile necesare pentru prepararea tamponului de ncrcare 5X.

Reactivi Volum (50 ml) Concentraie final
Glicerol 80% 47 ml 75%
Albastru de bromfenol 125 mg 0,25%
Xylen Cyanol 125 mg 0,25%
TRIS 1 M (pH 7,4) 500 l 10 mM
NaCl 5 M 100 l 10 mM
EDTA 0,5 M 1000 l 10 mM
SDS 10% 500 l 0,1%

ATENIE: Acrilamida este un agent neurotoxic. Poate provoaca iritaii ale pielii,
ochilor i tractusului respirator i are potenial cancerigen. Bis-acrilamida este toxic i
trebuie evitat inspirarea acesteia n timpul cntririi.
 ATENIE: N,N,N,N-Tetrametilendiamin este toxic. Cauzeaz arsuri i iritaii
atunci cnd intr n contact cu pielea, mucoasele sau ochii.
ATENIE: Bromura de etidiu este toxic i are un puternic efect mutagen.

Mod de lucru
1. Se cur cu ap distilat i cu etanol 70% spaiatorii i placile de sticl folosite
la turnarea gelului. Etanolul este folosit pentru degresarea total a plcilor, acest lucru
fiind necesar pentru evitarea formrii bulelor de aer n momentul turnrii gelului. La
manipularea acestora este obligatorie folosirea mnuilor. Plcile sunt lsate la uscat.
Atunci cnd plcile sunt perfect uscate se trece la asamblarea lor.
2. ntr-un pahar Berzelius steril, sub agitare continu, se prepar gelul de
poliacrilamid respectnd indicaiile prezentate n tabelul 2. Volumul total al soluiei,
avnd procentajul de poliacrilamid dorit, este de 12 ml, suficient pentru un minigel cu
grosimea de 1 mm pe modelul aparatelor de electroforez n sistem vertical livrate de
firmele BioRad sau Hoefer. Gelul trebuie turnat imediat dup adugarea persulfatului de
amoniu i a TEMED, n caz contrar existnd riscul ca acesta s polimerizeze n pahar.

Tabel 2: Reactivii i cantitile necesare pentru prepararea gelurilor de poliacrilamid de diferite

concentraii.
Concentraia Acrilamid H 2O TBE 10X Persulfat de TEMED
gelului 30% amoniu 10%
8% 3,2 ml 7,6 ml 1,2 ml 200 l 10 l
10% 4 ml 6,8 ml 1,2 ml 200 l 10 l
12% 4,8 ml 6 ml 1,2 ml 200 l 10 l

ATENIE: Dac se dorete obinerea altor concentraii de poliacrilamid se vor

reface calculele adugndu-se cantitile adecvate de reactivi.
Gelurile pot fi realizate i cu soluii stoc de acrilamid/bis-acrilamid avnd alte
raporturi ale monomerilor (ex. 19:1 sau 37,5:1), dar n aceste cazuri mobilitatea
moleculelor de ADN va fi diferit.
 3. Imediat dup preparare gelul este turnat ntre plcile pregtite n etapele 1 i 2.
La finalul turnrii se agaug piptenul astfel nct s se evite formarea bulelor de aer ntre
gel i dinii acestuia. Excesul de gel se va utiliza pentru a completa spaiile ramase libere
ntre piepten i plcile de sticl.
4. Polimerizarea se realizeaz aproximativ o or, la temperatura camerei, iar gelul
bine izolat cu folie de plastic poate fi pstrat la 40C timp de 2-3 zile.
5. Gelul este introdus cu atenie n aparatul de electroforez. Dupa adugarea
tamponului de electroforez TBE 1X se ndeprteaz pieptenul avnd grij s nu se
deterioreze godeurile.
6. Probele ADN i markerul de mas molecular sunt amestecate cu o cantitate
corespunztoare de tampon de ncrcare diluat i sunt introduse n godeuri cu ajutorul
unei seringi sau a unei micropipete.
ATENIE: Trebuie evitat formarea bulelor de aer n momentul ncrcrii
probelor n godeuri. Acestea pot bloca parial sau total migrarea moleculelor de ADN in
gel. Se recomanda ca timpul de ncrcare a probelor s fie relativ scurt pentru a evita
difuzia acestora.
7. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete migrarea.
Voltajul se fixeaz la valori cuprinse ntre 1 i 8 V/cm. n cazul unei tensiuni mai mari pot
aprea fenomene de supranclzire zonal a gelului, acestea determinnd deformarea
fragmentelor de ADN.
8. La finalul migrrii se oprete sursa de curent, se scoate gelul din tanc i se
detaeaz plcile de sticl i spaiatorii. Se procedeaz cu foarte mare atenie deoarece
gelul de poliacrilamid este extrem de fragil i se poate rupe. Obligatoriu se folosesc
mnui.
9. Gelul este scufundat ntr-un vas cu soluie de bromur de etidiu i lsat la
colorare cteva minute dup care este splat ntre 10 i 30 minute ntr-un vas cu ap.
10. Vizualizarea moleculelor de ADN se realizeaz cu un ajutorului unui
transiluminator UV.
 Rezultate i discuii
Tehnica poate fi folosit pentru separarea i identificarea produilor PCR sau
pentru evidenierea produilor reaciilor de restricie enzimatic. De asemeanea, tehnica
poate fii utilizat i pentru separarea i, ulterior, purificarea din gel a unor produi de
amplificare PCR n vederea secvenierii acestora.
Gelurile de poliacrilamid prezint o rezoluie mult mai crescut dect gelurile de
agaroz i de aceea pot fi folosite pentru separarea si evidentierea unor fragmente de
ADN mici i foarte apropiate ca mrime. n tabelul 3 sunt prezentate rezoluiile gelurilor
de poliacrilamid de diferite concentraii i distana estimat de migrare a coloranilor
adaugati n tamponul de ncrcare a probei.

Tabel 3: Rezoluiile gelurilor de poliacrilamid la diferite concentraii i distana aproximativ de migrare

a albastrului de bromfenol i a xilen cianolului.
Acrilamid (%) Mrimea Distana de migrare Distana de migrare
fragmentelor a albastrului de a xilen cianolului
separate (pb) bromfenol (pb) (pb)
3,5 100 1000 100 460
5 100 500 65 260
8 60 400 45 160
12 50 200 20 70
20 5 100 12 45

III.6. Verificarea integritii ARN prin electroforez n gel denaturant de

agaroz

Principiul metodei
Electroforeza n gel de agaroz constituie o metod standard pentru separarea i
identificarea moleculelor de ARN. La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcina
electric global negativ. Ca urmare, dac sunt plasai ntr-un cmp electric, moleculele
acestora vor migra ctre anod.
Spre deosebire de ADN, moleculele de ARN prezint un procent crescut de
structuri secundare la nivelul conformaiei, fapt care impune folosirea unui gel denaturant
pentru evideniere. Formaldehida, care are rolul de agent denaturant, asigur distrugerea
structurilor secundare astfel nct migrarea moleculelor de ARN se realizeaz efectiv doar
pe baza sarcinii i masei moleculare a acestora. Acest tip de electroforez asigur doar
separarea i evidenierea moleculelor mari de ARN (ARN ribozomal). Vizualizarea ARN
se realizeaz utiliznd bromura de etidiu.

Material biologic: probe de ARN.

Reactivi i aparatur: i) tampon de electroforez: MOPS 1X MOPS (Acid 3-
[N-Morfolino]-propan-sulfonic) 40 mM (pH 7), acetat de sodiu 10 mM, EDTA (acid
etilen-diamino-tetraacetic) 1 mM. Se prepar ca soluie 10X care este diluat nainte de
folosire; ii) tampon de ncrcare: formamid 80%, TRIS (Tris-[hidroximetil]-
aminometan) 45 mM, acid boric 45 mM, EDTA 1 mM; iii) soluie de bromur de etidiu
10 mg/ml; iv) agaroz; v) formaldehid 37%; vi) formamid; vii) ap ultrapur; viii) tanc
de electroforez pentru acizi nucleici; ix) surs de curent; x) transiluminator UV.
ATENIE: Bromura de etidiu este toxic i are un puternic efect mutagen.

Mod de lucru
1. ntr-un pahar Erlenmeyer se cntresc 0,5 g agaroz, peste care se adaug 36 ml
de ap. Paharul se acopera cu o folie de plastic sau cu staniol i se nclzete pn la
dizolvarea total a agarozei
2. Peste agaroza dizolvat se adaug 5 ml tampon MOPS 10X i 9 ml formaldehid
37%. Soluia obinut este lsat la rcit pn la o temperatur de 50-60 oC.
3. Se izoleaz tvia aparatului de electroforeza cu band adeziv. Se monteaz
pieptenul astfel nct dinii acestuia s nu atinga tavia i apoi se toarn gelul cald (50oC).
Se las 30-40 de minute la temperatura camerei pentru solidificare.
4. Se ndeprteaz banda adeziv i pieptenul cu mare atenie, iar gelul solidificat
complet se introduce n tancul de electroforez.
5. Se amestec proba ARN de analizat cu 2 l MOPS 10X, 4 l formaldehid 37%,
10 l formamid i 0,1 l soluie bromur de etidiu.
 6. Amestecul este incubat 5 minute la 65oC. Se adaug 2 l tampon de ncrcare i
apoi amestecul se ncarc n godeuri.
7. Se pune capacul aparatului i se conecteaz la sursa de curent. Sursa este fixat
la 80 V constant i la o durat a migrrii de aproximativ 40 de minute.
9. La finalizarea migrrii moleculele de ARN se vizualizeaz cu ajutorul unui
transiluminator UV.

Rezultate i discuii
Electroforeza n gel de agaroz este utilizat cu succes pentru evaluarea integritii
ARN total extras din diferite probe biologice.
Stabilitatea moleculelor de ARN este mult mai sczut n comparaie cu ADN.
Procesul degradrii acestora este mult mai frecvent i reprezint un impediment major
pentru experimentele ulterioare. n cazul unor moleculede ARN integre se vor observa
dou benzi clare, corespunztoare ARNr 28S i ARNr 18S. Banda pentru ARNr 28S
trebuie s fie aproximativ de dou ori mai intens dect cea pentru ARNr 18S (Figura 12).
Dac benzile separate in gel nu sunt foarte clare i bine delimitate se poate trage concluzia
c ARN este degradat/fragmentat.

Figura 12: Electroforez ARN n gel denaturant de agaroz.

CAPITOLUL IV
REACIA PCR VARIANTE I TEHNICI DERIVATE

Reacia de polimerizare n lan (PCR) a fost pus la punct n 1985 de ctre Kary
Mullis i colaboratorii si. Tehnica PCR este cu siguran metoda care a cunoscut cea mai
rapid i spectaculoas dezvoltare din istoria biochimiei, iar K. Mullis a primit premiul
Nobel pentru chimie n 1993 deoarece aceasta tehnic a reuit sa revoluioneze
dezvoltarea biologiei moleculare avnd aplicabilitate larg n domenii din ce n ce mai
diverse: genetic, microbiologie, virusologie, hematologie, oncologie, etc..
n decursul timpului au fost dezvoltate serie de interpretri ale conceptului de baz
i introduse inovaii att la nivelul etapelor ct i la nivelul aparaturii utilizate n vederea
realizrii practice i automatizrii tehnicii. PCR se bazeaz pe o tehnologie in vitro care
imit capacitatea natural de replicare a ADN i care const n generarea rapid a unor
copii multiple a unei secvene nucleotidice int (ADN sau ARN). Numrul de copii ale
secvenei int crete exponenial cu fiecare ciclu de amplificare, deoarece fiecare
secven nucleotidic nou sintetizat constituie o matri pentru o nou copie.
Produii PCR, care reprezint copiii ale moleculelor de ADN/ARN int originale,
sunt denumii ampliconi. Aceast metod permite detectarea cu specificitate foarte mare a
unor concentraii foarte sczute ale secvenei int. Cu toata simplitatea principiului
tehnicii i faptul c realizarea practic a cunoscut evoluii de excepie, exist numeroase
etape care pot introduce erori n rezultatele obinute dac nu sunt pe deplin controlate.
Utilizatorul trebuie s neleag i s integreze logic etapele care trebuie parcurse pentru
obinerea unor rezultate finale corespunztoare scopului n care este folosit tehnica.
Proprietatea ADN polimerazelor de a sintetiza noi catene de ADN pornind de la
primeri oligonucleotidici este utilizat n tehnica PCR pentru a amplifica de aproximativ
un milion de ori secvena int, prin replicri succesive.
Pentru a se putea realiza practic acest lucru este necesar alegerea unor secvente
oligonucleotidice (primeri sintetici), capabile s hibridizeze la capetele secvenei de
amplificat i folosirea unei ADN polimeraze termostabile care permite automatizarea
procesului de amplificare conducnd la acumularea exponenial a secvenei int la
fiecare ciclu de amplificare. O reacie PCR se realizeaz n trei etape diferite:
I. Denaturarea ADN matri.
II. Hibridizarea primerilor pe baz de complementaritate.
III. Sinteza unei noi catene avnd drept matri catena int de ADN.
Prima etap consta n denaturarea termic a macromoleculei de ADN dublu-
catenare. Astfel, temperatura amestecului de reacie, care conine i ADN, este ridicat
pn la 94-96C, determinnd ruperea punilor de hidrogen stabilite pe baz de
complementaritate ntre cele dou catene i a forelor de stivuire care apar ntre planurile
bazelor azotate. Dup aceast etap, n soluie, vom regsi ADN monocatenar.
n etapa a doua are loc hibridizarea primerilor sintetici la catena de ADN. Primerii
sunt molecule oligonucleotidice monocatenare, scurte de ADN, desemnate artificial pe
baz de complementaritate cu secvena din ADN care urmeaz a fi amplificat.
Hibridizarea primerilor se efectueaz prin scderea temperaturii amestecului de reacie
pn la o valoare care permite refacerea punilor de hidrogen dintre acetia i catena
matri.
Desemnarea primerilor este un proces laborios de care depinde reuita reaciei
PCR. La alegerea acestora trebuie respectate cteva reguli generale:
a) lungimea optim a primerilor trebuie s fie cuprins ntre 18 i 33 de nucleotide.
b) primerii trebuie s conin un numr aproximativ egal din cele patru baze
azotate, evitndu-se pe ct posibil regiunile cu repetiii nucleotidice. Respectarea acestei
reguli va conduce la eliminarea potenialelor regiuni cu structuri secundare.
c) perechile de primeri trebuie alese astfel nct s nu prezinte complementaritate
la nivel intra- i interindividual, fiind astfel permis reducerea la minim a posibilelor
interacii dintre primeri (ex. formarea de dimeri de primeri).
d) distana dintre doi primeri la nivelul matriei trebuie s fie mai mic de 5 kpb. S-
a observat o eficien foarte sczut a reaciei n cazul n care lungimea produsului de
amplificare depete 2-3 kpb.
 e) pentru utilizarea acestora n condiii bune trebuie stabilit cu exactitate
temperatura optim de hibridizare.
n cea de-a treia etap are loc sinteza unei noi catene de ADN complementar cu
matria, pornind de la primeri, cu ajutorul unei ADN polimeraze i n prezena
deoxinucleotid trifosfailor. La final, n amestecul de reacie, se regsesc moleculele de
ADN dublucatenare, de aceeai lungime cu distana dintre cei doi primeri la nivelul
catenei matri.
Sinteza noilor catene poate fi repetat prin reluarea celor trei etape ntr-un nou
ciclu de amplificare. Fiecare caten nou sintetizat devine matri pentru un nou ciclu de
amplificare, astfel nct secvena int de ADN este selectiv amplificat dup fiecare ciclu
de reacie. Produsul de reacie sau amplicon conine la capete secvenele primer folosite la
amplificare.

IV.1. Realizarea reaciei PCR n gradient de temperatur pentru optimizarea

hibridizrii primerilor

Principiul metodei
La nceputul oricrui experiment care utilizeaza tehnica PCR este necesar
parcurgerea unei etape extrem de importante care const n optimizarea temperaturii de
hibridizare a primerilor prin realizarea unei reacii PCR n gradient de temperatur. n
aceasta reacie, ADN matri este hibridizat concomitent la temperaturi diferite cu aceeai
primeri n scopul stabilirii temperaturii optime, care s permit eliminarea amplificrilor
parazite i realizarea cu un randament maxim a reaciei PCR. Totodat, n decursul unei
astfel de reacii de optimizare, pot fi variate i intervalele de timp n care sunt parcurse
treptele de temperatur, ct i numrul de cicluri de amplificare.

Material biologic: probe de ADN genomic de diferite proveniene.

Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide, 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR
10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz 5 U/l;
v) ap ultrapur; vi) primer sens, 20 M i primer antisens, 20 M; vii) aparat PCR cu
gradient de temperatur (termocicler); viii) microcentrifug; ix) agitator.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez TAE 1X
TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepar ca soluie 10X i este
diluat nainte de folosire; ii) tamponul probei care conine albastru de bromfenol 0,3% i
glicerol 30% n TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marker de mas
molecular; v) agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii)
surs de curent; viii) transiluminator UV; ix) plit cu nclzire i agitare magnetic.

Mod de lucru
1. Se adaug reactivii prezentai n tabelul 4 ntr-un tub de centrifug pentru a
obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.

Tabel 4: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR n gradient.

Componente Volum (l)
Tampon PCR 10X 2,5
MgCl2 1,5
Amestec de nucleotide 2
ADN Polimeraz 0,1
Primer sens ntre 0,1 0,2
Primer antisens ntre 0,1 0,2
Ap deionizat ntre 13,5 - 13,7
Volum total 20

2. Se adaug 20 l din amestecul de reacie pentru fiecare prob care va fi supus

unei anumite temperaturi de hibridizare a primerilor. Ulterior se adaug cte 5 l ADN
genomic, diluat corespunztor (50 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor
pentru omogenizare.
3. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR si se realizeaza programarea aparatului n
conformitate cu programul prezentat n tabelul 5.
 Tabel 5: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare

Aparat
Etapa iniial 30 - 45 de cicluri Extensie Etapa
de PCR
Denaturare Hibridizare Extindere final final
10 min. 30 secunde 30 secunde 1 minut 10 minute
o o o
IQ 95 C 95 C Temperatura 72 C 72oC
Cycler 1 ciclu poate varia ntre 1 ciclu 4 oC
50 oC i 65 oC.

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz

pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu
o pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei,
timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul
migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.

Rezultate i discuii
n funcie de profilul, de numrul i intensitatea benzilor rezultate n urma reaciei
se stabilete temperatura optim de hibridizare a primerilor. Tot pentru optimizarea
reaciei se poate varia i timpul etapelor de polimerizare i de extensie final sau/i
numrul de cicluri de amplificare.
Dou electroforeze ale produilor unor reacii PCR, n gradient de temperatur sunt
prezentate n continuare. n ambele figuri, se observ clar influena temperaturii de
hibridizare a primerilor asupra PCR. n figura 13, se observ formarea produilor de
amplificare nespecifici, pentru primele trei temperaturi de hibridizare. Acest fapt este
datorat hibridizrii nespecifice a primerilor, la nivelul altor situsuri dect cele pentru care
au fost desemnai. Aceeai situaie este observat i n figura 14, n cazul primelor patru
temperaturi setate. n urma analizei rezultatelor se poate afirma c temperaturile optime
de hibridizare se ncadreaz n intervalul 56 - 60 oC (pentru primul exemplu) i ntre 58 i
60 oC (pentru exemplul al doilea).

Figura 13: Reacie PCR n gradient de temperatur. 1 52oC; 2 52,7oC; 3 53,7oC; 4 55,1oC; 5
57,2oC; 6 58,6oC; 7 60 oC; 8 marker de mas molecular 100 pb.

Figura 14: Reacie PCR n gradient de temperatur. 1 52 oC; 2 52,7 oC; 3 53,7 oC; 4 55,1 oC; 5
57,2 oC; 6 58,6 oC; 7 59,6 oC; 8 60 oC; 9 marker de mas molecular 50 pb.

IV.2. Touch-Down PCR cu adugare de adjuvant

Principiul metodei
Aceasta modalitate de amplificare urmrete eliminarea la maxim a produilor
nespecifici de reacie care apar mai ales n cazul moleculelor de ADN bogate n GC i
datorate n principal suprancolcirilor ADN. Pentru realizarea acestui obiectiv
amplificarea ncepe cu cicluri de hibridizare la temperaturi crescute, acestea scznd
treptat ctre sfritul reaciei. De asemenea, se folosesc ca adjuvani diverse substane
chimice (ex. DMSO), care au rolul de a se lega n zonele bogate n GC i de a relaxa
suprancolcirile.

Material biologic: probe de ADN genomic.

Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide, 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR
10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz 5 U/l;
v) ap ultrapur; vi) dimetil sulfoxid (DMSO); vii) primer sens, 20 M i primer antisens,
20 M; viii) aparat PCR cu gradient de temperatur; ix) hot cu flux de aer; x)
microcentrifug; xi) agitator.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez TAE 1X
TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepar ca soluie 10X i este
diluat nainte de folosire; ii) tamponul probei care conine albastru de bromfenol 0,3% i
glicerol 30% n TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marker de mas
molecular; v) agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii)
surs de curent; viii) transiluminator UV sau sistem de videodocumentare; ix) plit cu
nclzire i agitare magnetic.

Mod de lucru
1. Reactivii prezentai n tabelul 7 se adaug ntr-un tub de microcentrifug pentru
obinerea amestecului de reacie. Vortexare i centrifugare uoar n vederea unei bune
omogenizri.
2. La 20 l amestec de reacie se adaug 5 l ADN purificat, diluat corespunztor
(circa 50 ng/reacie). Vortexare i centrifugare uoar.
3. Tuburile se aeaz n aparatul de amplificare i acesta este programat in
conformitate cu programul prezentat n tabelul 8.
 Tabel 7: Reactivi, cantitile i concentraiile necesare realizrii reaciei PCR.
Componente Volum (l) i Volum (l) i Volum (l) i Volum (l) i
concentraie concentraie concentraie concentraie
Tampon PCR 2,5 (1X) 2,5 (1X) 2,5 (1X) 2,5 (1X)
10X
MgCl2 1,5 (1,5mM) 1,5 (1,5mM) 1,5 (1,5mM) 1,5 (1,5mM)
dNTP 2 (0,8mM) 2 (0,8mM) 2 (0,8mM) 2 (0,8mM)
DMSO 0 (0%) 0,5 (2%) 1,25 (5%) 2,5 (10%)
ADN polimeraz 0,1 (0,5U) 0,1 (0,5U) 0,1 (0,5U) 0,1 (0,5U)
Primer sens 0,6 (0,4 M) 0,6 (0,4 M) 0,6 (0,4 M) 0,6 (0,4 M)
Primer antisens 0,6 (0,4 M) 0,6 (0,4 M) 0,6 (0,4 M) 0,6 (0,4 M)
Ap ultrapur 12,7 12,2 11,45 10,2
Volum total 20 20 20 20

Tabel 8: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
Etapa 25 de cicluri 10 cicluri Extindere Etapa
de PCR
iniial final final
Denaturare Anelare Extindere Denaturare Anelare Extindere

GeneAmp 5 min. 60 sec. 60 sec. 1 minut i 60 sec. 60 sec. 1 minut 1 minut

o o o o o o
9700 95 C 94 C 63 C* 30 sec 94 C 50 C 72 C 72oC
1 ciclu - se scade 72oC
o 4oC
0,5 C /
ciclu

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz

pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu
o pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant (3 V/cm) i la temperatura
camerei, timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La
finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui
transiluminator UV.
 Rezultate i discuii
Eficiena reaciei de amplificare depinde de modul n care au fost selectai primerii
i de poziia de la nivelul macromoleculei de ADN la care acetia hibridizeaz. n cazul
hibridizrii ntr-o zon extrem de bogat n GC, care prezint un procent mare de
suprancolciri, chiar i n urma optimizrii prin touch-down PCR, se pot obine mai
multe benzi de ADN, corespunztoare mai multor produi de amplificare.
Metoda este foarte eficient dac se pornete de la nceput cu un numr limitat de
amplificri nespecifice. De asemenea, adugarea adjuvailor nu este ntotdeauna o
necesitate putndu-se ncerca doar optimizarea prin variaie de temperatur.
n figura 15 este prezentat o electroforez a produilor de amplificare pentru o
reacie Touch-Down PCR la care s-a adugat adjuvant.
Se poate observa clar mbuntirea amplificrii prin obinerea unui numr din ce
n ce mai sczut de produi nespecifici i prin intensificarea benzilor determinat de
creterea concentraiei produsului de interes. Optimizarea poate conduce pn la
eliminarea total a produilor nespecifici de amplificare.

Figura 15: Electroforez a produilor obinui prin Touch-Down PCR cu adugare de adjuvant. 1
marker de mas molecular; 3, 5, 7 martori negativi, 2, 4, 6, 8 produii reaciilor Touch-Down.
Banda de interes este marcat cu sgeat.
IV.3. Tehnica RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Principiul tehnicii se bazeaz pe compararea profilelor de restricie rezultate n

urma digestiei ADN obinut prin extracie, clonare sau amplificare cu endonucleaze de
restricie. Eventualele mutaii care apar la nivelul secvenei ADN pot crea sau modifica un
situs de restricie avnd drept rezultat obinerea de fragmente de restricie diferite.
Enzimele de restricie, au fost descoperite n urma studierii fenomenului de
rezisten bacterian la atacul bacteriofagilor determinat de sinteza unor enzime de
restricie-modificare cu rol n degradarea materialului genetic fagic i protejarea celui
propriu. Descoperirea, purificarea i caracterizarea unui numr foarte mare de astfel de
enzime a impus adoptarea unei nomenclaturi universale. Astfel, pentru denumirea lor se
folosete un cod de trei litere, n format italic, prima liter semnificnd genul, iar celelalte
dou specia bacterian de la care a fost izolat enzima. (ex: Eco Escherichia coli). n
unele cazuri, o a patra liter, n format normal, va indica tulpina bacterian.
Dac o anumit tulpin bacterian are mai mult de un sistem de restricie-
modificare, acestea se vor identifica prin numere romane. (ex. Bgl I i Bgl II).
Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN
specifice, scurte, recunoaterea fiind urmat de legare i apoi clivare, fie la nivelul
situsului, fie la o distan oarecare de acesta. Sistemele de restriie-modificare au fost
mprite n trei categorii: I, II i III. Categoriile I i III constau n enzime care au att
funcii de restricie ct i funcii de metilare. Ambele tipuri recunosc secvene specifice,
nemetilate, de ADN dublu catenar. Enzimele din categoria I cliveaz ADN ntr-o manier
situs-nespecific, iar cele din categoria III taie la nivelul unor situsuri specifice situate la o
distan de 25-27 nucleotide de secvena de recunoatere. n categoria II sunt incluse toate
enzimele cu capacitate de restricie-modificare (pot ndeplini i funcia de metilare) care
acioneaz exact la nivelul situsurilor de recunoatere pe care le scindeaz sau modific.
Experimental, se recomand ca pentru o anumit secven ADN s se identifice
posibilele situsuri de restricie caracteristice genotipului normal. Ulterior se verific dac
mutaiile pe care dorim s le identificm afecteaz vreunul dintre aceste situsuri. Acestea
pot modifica un situs de restricie deja existent sau pot genera un situs nou. n abordarea
modern, tehnica RFLP se realizeaz prin amplificarea zonei de interes prin reacie PCR
i digestia cu enzime de restricie a ampliconilor obinui. Ea poate fi folosit pentru
genotipare individual, identificarea de polimorfisme normale i patologice i
identificarea profilelor de restricie ale microorganismelor.

IV.3.1 Diagnostic genetic prin RFLP

A. Diagnosticarea deficienei de adeziune leucocitar bovin

Principiul metodei
Deficiena de adeziune leucocitar bovin (BLAD - Bovine Leukocyte Adhesion
Deficiency) este o boal autozomal recesiv, congenital, caracterizat fenotipic prin
infecii bacteriene recurente, ntrzierea vindecrii rnilor, cretere neregulat, fiind
asociat i cu neutrofilie.
Baza molecular a BLAD este reprezentata de prezena unei mutaii punctiforme
(adenin trece n guanin) n poziia 383 de la nivelul ARNm/ADNc care determin
substituia acidului aspartic cu glicina n poziia 128 a proteinei de adeziune D128G
(Shuster et al., 1992, Jorgensen et al., 1993, Gerardi, 1996, Meylan et al., 1997).
Vacile afectate de BLAD prezint ulcere severe la nivelul membranelor mucoase
orale, parodontoz sever, pierderea dinilor, pneumonie cronic i diaree recurent sau
cronic. Ele mor la vrste tinere datorit complicaiilor (Nagahata et al., 1993, 1997,
Ackermann et al., 1996, Ribeiro et al., 2000).
Pentru diagnosticare s-au desemnat primeri specifici cu ajutorul crora se poate
amplifica zona n care a fost detectat mutaia care duce la apariia maladiei. Produsul de
amplificare obinut, care conine situsul la care poate aprea mutaia, este supus digestiei
cu ajutorul enzimei de restricie Taq I. Fragmentele rezultate n urma clivrii sunt
vizualizate prin electroforez n gel de agaroz i apoi analizate pentru stabilirea
genotipurilor.
 Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la exemplare de bovine.
Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide, 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR
10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz 5 U/l;
v) ap ultrapur; vi) primer sens CCTTCCGGAGGGCCAAGGGCT, 20 M i primer
antisens CTCGGTGATGCCATTGAGGGC, 20 M; vii) aparat PCR; viii)
microcentrifug; ix) agitator.
Reactivi pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie: 60 mM TRIS-HCl,
1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH 7,5; ii) albumin seric bovin
(BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleaza de restricie Taq I 10 U/l; iv)
microcentrifug; v) agitator; vi) termobloc.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez TAE 1X
TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepar ca soluie 10X i este
diluat nainte de folosire; ii) tamponul probei care conine albastru de bromfenol 0,3% i
glicerol 30% n TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marker de mas
molecular; v) agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii)
surs de curent; viii) transiluminator UV; ix) plit cu nclzire i agitare magnetic;

Mod de lucru
Amplificarea prin PCR
1. Reactivii prezentai n tabelul 9 se amestec ntr-un tub de microcentrifug
pentru a obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
2. Se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte un tub de centrifug 200 l
pentru fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5 l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor
(circa 50 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul PCR i acesta se programeaz in conformitate cu
programul prezentat n tabelul 10.
 Tabel 9: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.
Componente Volum (l)

Tampon PCR 10X 2,5

MgCl2 1,5
dNTP 2
Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,2
Primer antisens 0,2
Ap ultrapur 13,5
Volum total 20

Tabel 10: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat Etapa 45 de cicluri Extensie Etapa
de PCR iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 1 minut 15 minute
9700 95oC 95oC 57oC 72oC 72oC
1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz
pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se
ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei,
timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul
migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.
Reacia de restricie
1. Se pipeteaz reactivii prezentai n tabelul 11 ntr-un tub de microcentrifug
pentru a obine amestecul de restricie. Se vortexeaz i se centrifugheaz.
 2. Digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore. Deoarece enzima Taq I este
termostabil, reacia de restricie se poate desfura i 2 ore la 65C.

Tabel 11: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)
Tampon de restricie 10X 2
BSA acetilat 0,5
Produs PCR 15
Taq I 1,5
Ap deionizat 1
Volum total 20

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor rezultai n

urma digestiei cu enzime de restricie
Dup terminarea reaciei de restricie se realizeaz o electroforez n gel de
agaroz pentru vizualizarea produilor.
Gelul de agaroz 3% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
Produii de restricie se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o
pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant (3 V/cm) i la temperatura
camerei, timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La
finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui
transiluminator UV.

Rezultate i discuii
Pentru diagnosticarea deficienei de adeziune leucocitar bovin produsul PCR,
avnd mrimea de 134 pb, a fost supus digestiei cu enzima de restricie Taq I. Situsul de
restricie al enzimei este TCGA.
Genotipul homozigot normal prezint dou benzi, de 108 i 26 pb, datorit
existenei situsului de restricie al Taq I la nivelul fragmentului amplificat.
 n cazul apariiei mutaiei punctiforme care declaneaz maladia (A/G) situsul de
restricie este modificat. Astfel, genotipul heterozigot purttor, care poseda o copie
normal i una mutant a genei, prezint trei benzi de 108, 26 i 134 pb, iar cel homozigot
recesiv o singur band de 134 pb (Figura 16).
n practic, prin analiza profilelor de restricie se pot identifica indivizii purttori,
afectai sau normali, realizndu-se astfel diagnosticarea diferitelor efective de animale.

Figura 16: Electroforez pentru evidenierea produilor de restricie n vederea diagnosticrii BLAD. 1
martor negativ; 2, 3 indivizi purttori; 4, 5, 6 indivizi homozigoi normali; 7 fragment nedigerat; 8
marcher de mas molecular 50 bp (Promega).

B. Diagnosticarea deficienei n uridin-monofosfat sintaz bovin

Principiul metodei
Deficiena n uridin 5monofosfat sintaza (DUMPS Deficiency of Uridine
Monophosphate Synthase) este o maladie genetic care afecteaz biosinteza pirimidinelor
i se transmite autozomal recesiv (Shanks, 1992, Kuhn, 1994).
Uridin 5monofosfat sintaza catalizeaz conversia acidului orotic n UMP. UMP
este precursorul tuturor pirimidin nucleotidelor precum i un constituent normal n laptele
de vac (Shanks, 1989). Ca atare, enzima este absolut necesar pentru sinteza de novo a
pirimidin nucleotidelor, componente ale ADN i ARN.
 Creterea i dezvoltarea homozigoilor purttori ai acestei maladii este oprit,
ducnd la moartea embrionului n a 40 zi post-concepie (Shanks, 1990, Robinson, 1993).
Animalele heterozigote sunt purttoare ale alelei care cauzeaz aparitia DUMPS (Harlizius,
1996). Jumtate din urmaii rezultai din mperecherea dintre animale heterozigote i
animale normale sunt normali, cealalt jumtate sunt purttori. Purttorii genei mutante
sunt identificai prin testarea activitii enzimei uridin 5monofosfat sintaz eritrocitar.
Activitatea acestei enzime n ficat, splin, rinichi, muchi i glanda mamar este mai
sczut (Shanks 1990), reprezentnd aproximativ jumtate din activitatea normal
(Robinson, 1990).
n urma numeroaselor cercetri s-a determinat secvena genei care codific pentru
uridin 5monofosfat sintaz i s-au pus la punct teste de diagnostic pentru indivizii
purttori. Genotipic, DUMPS este cauzat de o mutaie punctiform (C trece n T) la
nivelul codonului 405, n exonul 5 (Viana, 1998) al genei care codific enzima.
Pentru diagnosticarea prezenei mutaiei punctiforme s-au desemnat primeri specifici
cu ajutorul crora se poate amplifica zona de interes. Produsul de amplificare obinut, care
conine situsul la care poate aprea mutaia, este supus digestiei cu ajutorul enzimei de
restricie Ava I. Fragmentele rezultate n urma clivrii sunt vizualizate prin electroforez n
gel de agaroz i apoi analizate pentru stabilirea genotipurilor.

Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la exemplare de bovine din

diferite rase.
Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide, 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR
10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz 5 U/l;
v) ap ultrapur; vi) primer sens GCAAATGGCTGAAGAACATTCTG, 20 M i primer
antisens GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT, 20 M; vii) aparat PCR; viii)
microcentrifug; ix) agitator.
Reactivi i aparatur pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie: 60
mM TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH 7,5; ii)
albumin seric bovin (BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleaza de restricie Ava I
10U/l; iv) termobloc; v) microcentrifug; vi) agitator.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez TAE 1X
TRIS 40 mM, acid acetic 40 mM, EDTA 2 mM care se prepar ca soluie 10X i este
diluat nainte de folosire; ii) tamponul probei care conine albastru de bromfenol 0,3% i
glicerol 30% n TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marker de mas
molecular; v) agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii)
surs de curent; viii) transiluminator UV; ix) plit cu nclzire i agitare magnetic.

Mod de lucru
Amplificarea prin reacie PCR
1. Se amestec reactivii prezentai n tabelul 12 ntr-un tub de microcentrifug
pentru a obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.

Tabel 12: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.

Componente Volum (l)

Tampon PCR 10X 2,5

MgCl2 1,5
dNTP 2
Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,2
Primer antisens 0,2
Ap ultrapur 13,5
Volum total 20

2. Din amestecul de reacie se adaug 20 l n cte un tub de centrifug pentru

fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor
(circa 50 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul PCR. Se programeaz aparatul PCR la parametrii
prezentai n tabelul 13.
 Tabel 13: Etapele reaciei PCR.
Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
Etapa 45 de cicluri Extensie Etapa
de PCR
iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 1 minut 15 minute
o o o o
9700 95 C 95 C 58 C 72 C 72oC
1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz
pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se
ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei,
timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul
migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.
Reacia de restricie
1. ntr-un tub de microcentrifug se adaug reactivii din tabelul 14 pentru a obine
amestecul de restricie. Se vortexeaz i se centrifugheaz.
2. Digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore.

Tabel 14: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)
Tampon de restricie 10X 2
BSA acetilat 0,5
Produs PCR 15
Ava I 1,5
Ap deionizat 1
Volum total 20
 Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor rezultai n urma
digestiei cu enzime de restricie
Dup terminarea reaciei de restricie se realizeaz o electroforez n gel de
agaroz pentru vizualizarea produilor.
Gelul de agaroz 3% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
Produii de restricie se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o
pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant (3 V/cm) i la temperatura
camerei, timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La
finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui
transiluminator UV.

Rezultate i discuii
Pentru diagnosticarea DUMPS produsul PCR, avnd mrimea de 110 pb, a fost
supus digestiei cu enzima de restricie Ava I. Situsul de restricie al enzimei este
C(T/C)CG(A/G)G.

Figura 17: Electroforez pentru evidenierea produilor de restricie n vederea diagnosticrii DUMPS. 1
7: indivizi homozigoi normali; 8 marcher de mas molecular 50 bp (Promega).

n mod normal la nivelul fragmentului amplificat exist dou situsuri de restricie

deci genotipul homozigot normal prezint trei benzi de 54, 36 i 20 pb (Figura 17). n
cazul apariiei mutaiei punctiforme care declaneaz maladia (C/T), unul dintre cele dou
situsuri de restricie este modificat.
Astfel individul heterozigot purttor (una dintre cele dou copii ale genei este
normal, iar cealalt mutant) va prezenta patru benzi de 90, 54, 36 i 20 pb, iar cel
homozigot recesiv dou benzi de 90 i 20 pb.
Prin analiza profilelor de restricie se pot identifica indivizii purttori, afectai sau
normali, realizndu-se astfel diagnosticarea efectivelor de animale analizate.

IV.3.2 Evidenierea unor polimorfisme ADN prin tehnica RFLP

A. Evidenierea polimorfismului genei care codific pentru -lactoglobulin la

bovine

-lactoglobulina este una dintre cele mai importante proteine din laptele
mamiferelor. Proteinele sunt sintetizate de celulele epiteliale ale glandelor mamare i
joac un rol crucial n asigurarea calitii laptelui. Ele au un rol important n coagularea
laptelui, element esenial n producerea brnzeturilor i a untului, i confer valoare
nutritiv lactatelor.
Pn acum au fost descoperite 11 variante genetice care codific forme diferite ale
proteinei -lactoglobulin, expresia acestora influennd calitatea laptelui: A, B, C, D, E,
F, G, H, I, J i W. Variantele A i B prezint cel mai mare interes, deoarece au fost
asociate cu performanele de producie a laptelui i de asemenea cu procesarea eficient i
calitatea acestuia. Exemplarele homozigote BB furnizeaz un lapte bogat n grsime i n
proteine, foarte valoros n procesul de fabricare a brnzeturilor, n timp ce exemplarele
homozigote AA dau lapte cu un procent mic de grsime, dar n cantitate mai mare.
Metoda i propune identificarea alelelor A i B ale genei care codific pentru -
lactoglobulin. Pentru analiza polimorfismului genei s-au desemnat primeri specifici cu
ajutorul crora se poate amplifica zona n care a fost detectat mutaia punctiform
responsabil de apariia variantelor genetice.
Produsul de amplificare obinut, care conine situsul la care poate aprea mutaia,
este supus digestiei cu enzima de restricie Hae III. Fragmentele rezultate n urma clivrii
sunt vizualizate prin electroforez n gel de agaroz i apoi analizate pentru stabilirea
genotipurilor.

Material biologic: probe de ADN genomic.

Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide 10 mM din fiecare (dNTP); ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon
PCR 10X - 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) polimeraz ADN 5 U/l; v) ap
ultrapur; vi) primer sens GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA 20 M; vi) primer
antisens CCCAGGACACCGGCTCCCGGTATAT 20 M; vii) aparat de PCR; viii)
microcentrifug; ix) agitator.
Reactivi i aparatur pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie - 60 mM
TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH 7,5; ii) albumin
seric bovin (BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleaza de restricie Hae III 10U/l; iv)
termobloc; v) microcentrifug; vi) agitator.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez: TAE 1X
TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii 10X
care este apoi diluat; ii) tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n
TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marcher de mas molecular; v)
agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii) surs de curent; viii)
transiluminator UV; viii) plit cu nclzire i agitare magnetic.

Mod de lucru
Amplificarea prin PCR
1. ntr-un tub de microcentrifug se amestec reactivii prezentai n tabelul 15
pentru a obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugheaz uor.
 Tabel 15: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.
Componente Volum (l)

Tampon PCR 10X 2,5

MgCl2 1,5
dNTP 2
Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,2
Primer antisens 0,2
Ap ultrapur 13,5
Volum total 20

2. n tuburi de centrifug de 200 l se pun 20 l din amestecul de reacie pentru

fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor
(circa 50 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul PCR, iar acesta se programeaz dup parametrii
prezentai n tabelul 16.

Tabel 16: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
Etapa 45 de cicluri Extensie Etapa
de PCR
iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 1 minut 15 minute
o o o o
9700 95 C 95 C 57 C 72 C 72oC
1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz
pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
 Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri. Se
conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete electroforeza.
Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei, timp de 40 50 de
minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul migrrii, vizualizarea
benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.
Reacia de restricie
1. Reactivii prezentai n tabelul 17 se adaug ntr-un tub de microcentrifug pentru
a obine amestecul de restricie. Se vortexeaz i se centrifugheaz.
2. Digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore.

Tabel 17: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)
Tampon de restricie 10X 2
BSA acetilat 0,5
Produs PCR 16
Hae III 1,5
Volum total 20

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor rezultai n urma

digestiei cu enzime de restricie
Dup terminarea reaciei de restricie se realizeaz o electroforez n gel de
agaroz pentru vizualizarea produilor.
Gelul de agaroz 3% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
Produii de restricie se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o
pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant (3 V/cm) i la temperatura
camerei, timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La
finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui
transiluminator UV.
 Rezultate i discuii
Pentru identificarea alelelor A i B ale genei care codific pentru -lactoglobulin
la bovine, produsul PCR, avnd mrimea de 262 pb, a fost supus digestiei cu enzima de
restricie Hae III care recunoate situsul palindromic format din patru nucleotide GGCC.
Genotipul AA va prezenta dou benzi de 153 i 109 pb deoarece la nivelul
fragmentului amplificat exist un situs de restricie Hae III, corespunzator alelei A a
genei. Prezena mutaiei punctiforme (T/C) genereaz un nou situs de restricie iar
varianta genei care prezint aceast mutaie corespunde alelei B. Genotipul BB va
prezenta trei benzi de 109, 79 i respectiv 74 pb.
Dac se folosete separarea prin electroforez n gel de agaroz standard, benzile
de 79 i 74 pb migreaza mpreun, fiind foarte apropiate ca mrime, i nu vor putea fi clar
separate i evideniate. Ca atare, la vizualizarea gelului, se va observa n locul acestora o
singur band. Deci, n cazul genotipului BB se vor evidenia practic doar dou benzi, una
la 109 pb i alta pentru 74/79 pb. Din aceste considerente genotipul heterozigot AB va
prezenta trei benzi cu mrimea de 153, 109 i 74/79 pb (Figura 18).
Analiza profilelor de restricie permite identificarea genotipurilor AA, AB i BB
pentru toate exemplarele bovine supuse analizei.

Figura 18: Electroforez pentru evidenierea produilor de restricie n vederea evidenierii alelelor A i B
ale genei codificatoare pentru -lactoglobulin la bovine. 1 martor negativ; 2, 4 genotip BB; 3, 5
genotip AB; 6 fragment netiat; 7 marcher de mas molecular 50 bp (Promega).
B. Analiza polimorfismului locusului Extension la cabaline

Principiul metodei
La mamifere, melanina este principalul pigment sintetizat de organism. Ea apare
sub form de granule la nivelul unor celule specializate numite melanocite. Variaiile de
culoare ale robei la cai sunt datorate expresiei unor gene care, ai cror produi, prin
activitatea lor, controleaz tipul pigmentului din melanocite i/sau forma, numrul ori
aranjamentul granulelor de pigment. Melanina apare n dou forme moleculare:
eumelanina, de culoare neagr sau brun, i pheomelanina, de culoare roie sau galben.
Se consider c genele de la nivelul locilor Extension i Agouti, care controleaz
echilibrul dintre eumelanin i pheomelanin, sunt responsabile de apariia culorilor de
baz roib i neagr (Bowling, A.T., Ruvinsky, A., The Genetics of the Horse, 2000).
n acest context, receptorul pentru melanocortin (MC1R), codificat de gena
MC1R (locusul Extension), i peptida sa antagonist, proteina de semnalizare Agouti
(ASIP Agouti Signaling Protein), codificat de gena ASIP (locusul Agouti), controleaz
cantitatea i tipul de melanin din melanocite.
Deci, culoarea roib apare la cai n urma interaciei dintre genele ASIP i MC1R.
Marklund i colaboratorii au descoperit n 1996 o mutaie la nivelul genei MC1R care
determin sinteza unui receptor defectiv. Aceast protein este localizat n membrana
melanocitelor i are rolul de a lega hormonul care stimuleaz activarea melanocitelor. La
indivizii unde mutaia lipsete, procesul de stimulare determin producerea de eumelanin
n detrimentul pheomelaninei.
n cazul apariiei mutaiei, proteina receptor defectiv nu i mai poate ndeplini
rolul biologic de legare a hormonului stimulator i nu mai poate induce producerea de
eumelanin. n consecin, la nivelul melanocitelor, se produce i se acumuleaz
pheomelanin, aceasta determinnd apariia culorii roibe. Mutaia responsabil de aceste
modificri const n nlocuirea unei citozine cu timin, aceasta conducnd la substituirea
fenilalaninei din secvena proteic normal cu serina. Deci, pentru apariia culorii roibe
este necesar prezena genotipului homozigot recesiv (ee) la nivelul locusului Extension i
genotipurilor homozigot dominant (AA) sau heterozigot (Aa) la nivelul locusului Agouti.
Stabilirea genotipurilor de la nivelul locusului Extension se realizeaza prin tehnica
RFLP. Au fost desemnai primeri care s flancheze regiunea unde poate sa apara mutaia
punctiform la nivelul genei MC1R, iar ampliconii sunt supui digestiei enzimatice cu
endonucleaza de restricie Taq I. Produii de restricie sunt fost ulterior analizai folosind
electroforeza n gel de agaroz.

Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la cabaline din diferite rase.
Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X
care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz 5 U/l; v) ap
ultrapur; vi) primeri sens CCTACCTCGGGCTGACCACCAA i antisens
GAGAGGAGACTAACCACCCAGATG; vii) aparat PCR; viii) centrifug; ix) agitator.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez: TAE 1X
TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii 10X
care este apoi diluat; ii) tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n
TAE 1X; iii) soluie de bromur de etidiu 0,5g/ml; iv) marker de mas molecular; v)
agaroz; vi) tanc de electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii) surs de curent; viii)
transiluminator UV; ix) plit cu nclzire i agitare magnetic.
Reactivi i aparatur pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie care
conine 60 mM TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH
7,5; ii) albumin seric bovin (BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleaza de restricie Taq
I 10U/l; iv) termobloc; v) microcentrifug; vi) agitator.

Mod de lucru
Amplificarea prin PCR
1. ntr-un tub de microcentrifug se adaug reactivii prezentai n tabelul 18 pentru
a obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
 Tabel 18: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.
Componente Volum (l)

Tampon PCR 10X 2,5

MgCl2 1,5
dNTP 2
Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,5
Primer antisens 0,5
Ap ultrapur 12,9
Volum total 20

2. Din amestecul de reacie, n cte un tub de centrifug 200 l, se adaug 20 l

pentru fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor
(circa 50 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul PCR, iar acesta se programeaz la parametrii
prezentai n tabelul 19.

Tabel 19: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
Etapa 42 de cicluri Extensie Etapa
de PCR
iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 1 minut 10 minute
o o o o
9700 95 C 95 C 60 C 72 C 72oC
1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz
pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se
ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei,
timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul
migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.
Reacia de restricie
1. ntr-un tub de microcentrifug se adaug reactivii din tabelul 20 pentru a obine
amestecul de restricie. Se vortexeaz i se centrifugheaz.
2. Digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore. innd cont c enzima este
termostabil se poate realiza i o incubare de doar 2 ore la 650C.

Tabel 17: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)

Tampon de restricie 10X 2

BSA acetilat 0,5
Produs PCR 16
Taq I 1,5
Volum total 20

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor rezultai n urma

digestiei cu enzime de restricie
Dup terminarea reaciei de restricie se realizeaz o electroforez n gel de
agaroz pentru vizualizarea produilor.
Gelul de agaroz 3% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4.
Produii de restricie se amestec cu tamponul probei i se ncarc n godeuri cu o
pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant (3 V/cm) i la temperatura
camerei, timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La
finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui
transiluminator UV.
 Rezultate i discuii
Situsul de restricie pentru Taq I este TCGA. n cazul alelei prezenei alelei E nu
exist un situs activ de restricie pentru Taq I, iar fragmentul amplificat ramne netiat i
are lungimea de 459 pb. n cazul alelei e are loc nlocuirea citozinei cu timin i activarea
unui situs de restricie pentru Taq I ceea ce duce la clivarea fragmentului iniial n dou
fragmente de 184, respectiv 275 pb. Astfel, genotipul EE va prezenta o singur band la
459 pb, genotipul ee dou benzi la 275 i 184 pb, iar genotipul Ee trei benzi de 459, 275 i
184 pb (Figura 19).

Figura 19: RFLP pentru analiza locusului Extension: 1 marker de mas molecular 100 bp (Promega); 2
fragment netiat; 3, 6, 7 genotip ee; 4 genotip EE; 5, 8 genotip Ee.

IV.3.3 Identificarea speciei utiliznd tehnica RFLP

A. Identificarea speciilor de sturioni din genurile Acipenser i Huso

Principiul metodei
Aceast metod permite identificarea speciilor de sturioni prin amplificarea unei
regiuni din genomul mitocondrial (ARNtGlu/ citocrom b). Pentru diferenierea ntre speciile
de sturioni produsul PCR de 462 pb a fost digerat cu diferite endonucleaze rezultnd
profile de restricie specie specifice. Metoda permite diferenierea ntre 10 specii de
sturioni aparinnd genurilor Acipenser i Huso i prezint utilitate practic prin faptul c
poate fi aplicat pentru verificarea provenienei loturilor de caviar.

Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la sturioni din specii diferite.
Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X
care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz; v) ap
ultrapur; vi) primer sens AAAAACCACCGTTGTTATTCAACTA 20 M; vii) primer
antisens GCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA 20 M; viii) aparat PCR; xi)
microcentrifug; x) agitator.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez: TAE 1X
TRIS 0,040 M, Acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii
10X; ii) tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X; iii) soluie
de bromur de etidiu 10 g/ml; iv) marker de mas molecular; v) agaroz; vi) tanc de
electroforez orizontal pentru acizi nucleici; vii) surs de curent; viii) transiluminator UV;
ix) plit cu nclzire i agitare magnetic.
Reactivi i aparatur pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie care
conine 60 mM TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH
7,5; ii) albumin seric bovin (BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleazele de restricie
Rsa I i Tru9 I 10U/l; iv) termobloc; v) microcentrifug; vi) agitator.

Mod de lucru
Amplificarea prin reacie PCR
1. ntr-un tub de microcentrifug se amestec reactivii prezentai n Tabelul 18
pentru a obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
2. Se adaug 40 l din amestecul de reacie n cte un tub de centrifug 200 l
pentru fiecare exemplar testat. Se vor amplifica probe de ADN genomic provenind de la
speciile Acipenser stellatus i Huso huso.
 3. Se adaug 10 l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat
corespunztor (circa 60 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta se programeaz la parametrii
prezentai n Tabelul 19.

Tabel 18: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.

Componente Volum (l)

Tampon PCR 10X 5

MgCl2 3
dNTP 4
Polimeraz AmpliTaq Gold 0,2
Primer sens 1
Primer antisens 1
Ap ultrapur 25,8
Volum total 40

Tabel 19: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat Etapa 45 de cicluri Extensie Etapa

de PCR iniial Denaturare Anelare Extindere final final

GeneAmp 10 minute 30 sec. 30 sec. 1 minut 10 minute

9700 o
95 C o
95 C o
60 C o
72 C 72oC

1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz
pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se
ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei,
timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul
migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.
 Reacia de restricie
1. Se vor realiza dou reacii de restricie diferite pentru probele amplificate
aparinnd ambelor specii. Se prepar separat amestecurile de reacie respectnd
indicaiile din Tabelele 20 i 21. Se vortexeaz i se centrifugheaz.
2. Pentru ambele reacii de restricie, digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore.

Tabel 20: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)
Tampon de restricie 10X 2
BSA acetilat 0,5
Produs PCR 16
Tru9 I 1,5
Volum total 20

Tabel 21: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)
Tampon de restricie 10X 2
BSA acetilat 0,5
Produs PCR 16
Rsa I 1,5
Volum total 20

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor rezultai n urma

digestiei cu enzime de restricie
Dup terminarea reaciei de restricie se realizeaz o electroforez n gel de
agaroz pentru vizualizarea produilor.
Gelul de agaroz 3,5% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4. Produii de restricie se amestec cu tamponul probei i se
ncarc n godeuri cu o pipet automat. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de
curent i se pornete electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant (3 V/cm)
i la temperatura camerei, timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor
amplificate. La finalul migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul
unui transiluminator UV.
 Rezultate i discuii
Pentru identificarea corect a speciilor de sturioni din Marea Neagr au fost alese
trei enzime de restricie: Rsa I i Tru 9I. Digestia fragmentului ARNtGlu/ citocrom b cu
cele dou enzime de restricie, urmat de electroforeza n gel de agaroz 3,5% conduc la
obinerea unor profile electroforetice caracteristice fiecrei specii analizate. Fragmentele
mai mici de 50 pb nu au putut fi separate prin electroforez. Situsul de restricie pentru
Tru 9I este 5TTAA 3, iar pentru Rsa I este 5GTAC3.
La Acipenser stellatus, n urma digestiei produsului PCR cu enzima de restricie
Tru 9I, se obin trei fragmente de 387, 66 i 9 pb, dintre care doar primele dou vor putea
fi evideniate. La Huso huso, digestia produsului de amplificare cu enzima Tru 9I,
determin apariia a patru fragmente, de 292, 95, 66 i 9 pb. Pe gelul de agaroz se
evideniaz trei din cele patru fragmente, i anume de 292, 95 i 66 pb (Figura 20).
La Huso huso, n urma digestiei produsului PCR cu enzima Rsa I, s-au obinut trei
fragmente, de 317, 112 i 33 pb. La Acipenser stellatus, fragmentul ARNtGlu/ citocrom b a
rmas intact dup incubarea cu Rsa I deoarece la nivelul acestuia nu exist situsuri de
restricie ale enzimei (Figura 21).

Acipenser stellatus Huso huso

66 pb
95 pb

292 pb
387 pb

Figura 20: Profilul electroforetic dup digestia fragmentului ARNtGlu/ citocrom b cu enzima de restricie
Tru 9 I la Acipenser stellatus i Huso huso. M marker de mas molecular 50 bp (Promega); 1, 2, 3
fragmente de 387 i 66 pb caracteristice pentru Acipenser stellatus; 3, 4, 5 fragmente de 292, 95 i 66 pb
caracteristice pentru Huso huso.
 Acipenser stellatus Huso huso

462 pb
317 pb

112 pb

Figura 21: Profilul electroforetic dup digestia fragmentului ARNtGlu/ citocrom b cu enzima de restricie
Rsa I la Acipenser stellatus i Huso huso. 1 marker de mas molecular 50 bp (Promega); 2, 3, 4, 5
fragment de 462 pb caracteristice pentru Acipenser stellatus; 6, 7, 8 fragmente de 317 i 112 pb
caracteristice pentru Huso huso.

IV.4. Tehnica de analiz a fragmentelor marcate fluorescent

IV.4.1 Identificarea deleiilor folosind tehnica analizei fragmentelor marcate

fluorescent (diagnosticarea imunodeficienei severe combinate la cabaline)

Principiul metodei
SCID (Severe Combined Immunodeficiency) este o maladie autozomal recesiv
ntlnit la mamiferele superioare, inclusiv la om. La cai boala este cauzat de o deleie de
cinci perechi de baze la nivelul genei care codific subunitatea catalitic a protein kinazei
ADN dependente i a fost raportat numai la rasa Pur Snge Arab. Maladia se
caracterizeaz printr-o diminuare sever a numrului de limfocite B i T i prin lipsa
sintezei de anticorpi. Boala se manifest numai n cazul homozigoilor recesivi.
Conform Shin et al. (1997), n cazul apariiei deleiei are loc o deplasare a cadrului
de citire care va duce la activarea unui codon STOP (codonul TAA) avand drept rezultat
sinteza unei proteine trunchiate care nu-i poate ndeplini funcia biologic (Figura 22).
Imunodeficiena sever combinat este datorat unei deleii de 5 perechi de baze la
nivelul genei care codific subunitatea catalitic a protein-kinazei ADN dependente i
poate fi diagnosticat cu ajutorul tehnicii PCR, urmat de o electroforez capilar a
fragmentelor amplificate i detecie fluorescent a acestora.

Figura 22: Secvena parial a fragmentului amplificat n vederea diagnosticrii SCID, situsul de 5
nucleotide care sunt deletate n cazul prezenei maladiei i codonul STOP activat n urma deleiei.

Pentru aceasta se folosete o pereche de primeri marcai fluorescent cu colorantul

6-FAM n scopul amplificrii fragmentului care poate conine mutaia. Produii reaciei
de amplificare sunt apoi supui unei electroforeze capilare n prezena unui marker de
mas molecular si acesta marcat cu un fluorocrom.

Material biologic: probe de ADN genomic extrase de la cabaline din diferite rase.
Reactivi i aparatur: i) amestec de deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii)
clorur de magneziu 25mM; iii) tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500
mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; v) ap ultrapur; vi)
primer sens 6-FAM-GCAAAAGGAGACAGAATT 20M; vii) primer antisens
TGATGATGTCATCCCAGA 20 M; viii) standard de mas molecular Gene-Scan-500
ROX Size Standard; ix) formamid deionizat; x) aparat PCR; xi) analizator genetic
automat; xii) microcentrifug; xiii) agitator; xiv) termobloc.

Mod de lucru
1. Pentru obinerea amestecului de reacie se respect indicaiile prezentate n
tabelul 22. Reactivii se introduc ntr-un tub de centrifug de 0,5 ml care se vortexeaz i
se centrifugeaz uor.
 Tabel 22: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.
Componente Volum (l)
Tampon PCR 10X 2,5
MgCl2 1,5
dNTP 2
ADN Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,6
Primer antisens 0,6
Ap ultrapur 12,7
Volum total 20

2. Un volum de 20 l din amestecul de reacie se repartizeaz n cte un tub de

centrifug 200 l pentru fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5 l ADN de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor (circa
30-40 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta este programat la paramatrii
prezentai n tabelul 23.

Tabel 23: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat de
PCR Etapa 30 de cicluri Extensie Etapa
iniial final final
Denaturare Hibridizare Extindere

GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 1 minut 50 minute 4 oC
9700 95oC 95oC 53oC 72oC 72oC
1 ciclu 1 ciclu

Dup realizarea reaciei PCR probele se pregtesc pentru detectarea fragmentelor

amplificate:
1. Se amestec 0,5 l produs de amplificare cu 0,5 l din standardul de mas
molecular Gene-Scan-500 ROX Size Standard i 13 l formamid deionizat.
2. Imediat nainte de introducerea probelor n aparat se face denaturarea acestora
prin nclzire la 95C i apoi rcirea brusc pe ghea.
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat ABI Prism 310.
 Rezultate i discuii
n urma electroforezei capilare fragmantele rezultate sunt prelucrate cu ajutorul
programelor GeneScan Analysis i Genotyper (Applied Biosystems). Prelucrarea const n
atribuirea fiecrei alele a unei mrimi n perechi de baze cu ajutorul creia poate fi
individualizat i ulterior analizat. n funcie de mrimea fragmentelor de amplificare
obinute se poate stabilii cu certitudine dac individul analizat este sntos, purttor sau
bolnav.
Astfel, pentru un individ homozigot normal se obine un singur semnal cu mrimea
de 235 pb (Figura 23), n cazul individului homozigot purttor se vor obtine dou
semnale, unul la 235 pb i altul la 230 pb (datorit deleiei de 5 pb), iar dac individul
analizat este homozigot recesiv se va evidenia un singur semnal la 230 pb. Semnalul este
datorat prezenei a dou alele identice ca mrime, suprapuse.

Figura 23: Profilele pentru trei exemplare din rasa Pur Snge Arab diagnosticate normale pentru SCID.
IV.4.2 Identificarea inseriilor folosind tehnica analizei fragmentelor marcate
fluorescent (diagnosticarea Epidermolizei joncionale severe la cabaline)

Principiul metodei
JEB (Junctional Epidermolysis Bullosa) este o maladie autozomal cauzat de
inseria unei citozine la nivelul genei LAMC2 care codific subunitatea 2 a lamininei 5
(protein implicat n adeziunea celular). Inseria duce la decalarea cadrului de citire i la
sinteza unei proteine defective (Milenkovic et al., 2003). Boala a fost descoperit la caii
de traciune din Frana i Belgia. Se manifest prin apariia unor jonciuni dermo-
epidermale anormale care au drept consecin o fragilitate a tegumentului i mucoaselor.
Indivizii heterozigoi, purttori ai genei defective, nu manifest simptomele bolii, dar o
pot transmite n descenden.
Pentru a pune la punct o metod de diagnostic au fost folosii primeri care
flancheaz regiunea care poate conine inseria, primerul sens fiind marcat cu colorantul
fluorescent 6-FAM. Produii de amplificare sunt supui ulterior electroforezei capilare cu
detecie n fluorescen, n prezena unui standard de mas molecular.

Material biologic: probe de ADN genomic extras de la cabaline din diferite rase.
Reactivi i aparatur: i) amestec de deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii)
clorur de magneziu 25mM; iii) tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500
mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; v) ap ultrapur; vi)
primer sens 6-FAM TGTTACTCAGGGGATGAGAA 20 M; vii) primer antisens
CTGGGGGCAGTTATTGCAC 20 M; viii) standard de mas molecular Gene-Scan-
500 ROX Size Standard; ix) formamid deionizat; x) aparat PCR; xi) analizator genetic
automat; xii) microcentrifug; xiii) agitator; xiv) termobloc.

Mod de lucru
1. ntr-un tub de centrifug de 0,5 ml se adaug reactivii din tabelul 24 pentru a
obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
 Tabel 24: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.
Componente Volum (l)
Tampon PCR 10X 2,5
MgCl2 1,5
dNTP 2
ADN Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,6
Primer antisens 0,6
Ap ultrapur 12,7
Volum total 20

2. Cte 20 l din amestecul de reacie se adaug n cte un tub de centrifug de 0,2

l, pentru fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5 l ADN de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor (circa
30-40 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta se programeaz dup
parametrii prezentai n tabelul 25.

Tabel 25: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat de
PCR Etapa 30 de cicluri Extensie Etapa
iniial final final
Denaturare Hibridizare Extindere

GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 45 secunde 50 minute 4 oC
9700 95oC 95oC 57oC 72oC 72oC
1 ciclu 1 ciclu

Dup realizarea reaciei PCR probele se pregtesc pentru detectarea fragmentelor

amplificate:
1. Se amestec 0,5 l produs de amplificare cu 0,5 l din standardul de mas
molecular Gene-Scan-500 ROX Size Standard i 13 l formamid deionizat.
2. nainte de introducerea probelor n aparat se face denaturarea acestora prin
nclzire la 95C i apoi rcirea brusc pe ghea.
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat ABI Prism 310.
 Rezultate i discuii
Prelucrarea rezultatelor se realizeaz cu ajutorul programelor GeneScan Analysis
i Genotyper (AppliedBiosystems) i const n identificarea fiecrui fragment amplificat
corespunztor mrimi n perechi de baze a acestuia.
Pentru a evidenia prezena inseriei la exemplarele testate s-a analizat profilul
produilor de amplificare. Un individ homozigot normal va prezenta un singur semnal cu
mrimea de 169 pb, unul heterozigot purttor va avea dou semnale la 169 pb i la 170
pb, datorit inseriei C, iar unul homozigot recesiv un singur semnal la 170pb (Figura 24).

Figura 24: Profilele pentru dou exemplare de cabaline diagnosticate ca purttor (sus), respectiv normal
(jos) pentru JEB.

III.4.3 Identificarea mutaiilor punctiforme utiliznd tehnicile RFLP i de

analiz a fragmentelor marcate fluorescent (diagnosticarea Paraliziei
hiperkalemice periodice la cabaline)

Principiul metodei
HYPP (Hyperkalemic Periodic Paralysis) este o maladie autozomal descoperit
la rasa de cai Quarter Horse, dar i la om. Maladia este cauzat de o mutaie punctiform
(C trece n G) la nivelul genei care codific subunitatea alfa a canalului de sodiu din
membrana celulelor musculare striate. n urma mutaiei are loc nlocuirea fenilalaninei cu
leucin, iar aceast modificare duce la creterea excesiv a permeabilitii membranei
celulelor musculare pentru ionii de potasiu (Rudolph et al., 1992).
Manifestrile bolii sunt creterea frecvenei respiratorii, spasme musculare
necontrolate, stare de slbiciune general. n cazurile cele mai grave poate surveni
decesul. Efectele apar i la indivizii heterozigoi, dar sunt extrem de puternice la cei
homozigoi recesivi.
Boala poate fi diagnosticat cu ajutorul tehnicii RFLP, urmat de o electroforez
capilar a fragmentelor de restricie i de detecia n fluorescen a acestora. Pentru
aceasta se folosete o pereche de primeri marcai fluorescent cu 6-FAM n scopul
amplificrii fragmentului care poate conine mutaia. Produii reaciei de amplificare sunt
digerai cu endonucleaza de restricie Taq I i apoi supui unei electroforeze capilare n
prezena unui marker de mas molecular marcat cu un fluorocrom. n urma amplificrii
se obine un fragment de 100 pb care contine i situsul la nivelul caruia poate aprea
mutaia punctiform.

Material biologic: probe de ADN genomic extras de la cabaline din diferite rase.
Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de
deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25mM; iii) tampon PCR 10X
care conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; iv) ADN polimeraz AmpliTaq
Gold 5 U/l; v) ap ultrapur; vi) primer sens 6-FAM -
CGGGGGAGTGTGTGCTCAAGAT 20 M; vii) primer antisens
ACAATGGACAGGATGACAACCAC 20 M; viii) standard de mas molecular Gene-
Scan-500 ROX Size Standard; ix) formamid deionizat; x) aparat PCR; xi) analizator
genetic automat; xii) microcentrifug; xiii) agitator; xiv) termobloc.
Reactivi i aparatur pentru electroforez: i) tampon de electroforez: TAE 1X
TRIS 0,040 M, acid acetic 0,040 M, EDTA 0,002 M. Se prepar sub forma unei soluii
10X; ii) tamponul probei: albastru de bromfenol 0,3%, glicerol 30% n TAE 1X; iii)
soluie de bromur de etidium 10 g/ml; iv) marker de mas molecular; v) agaroz; vi)
tanc de electroforez orizontal; vii) surs de curent; viii) transiluminator UV.
Reactivi i aparatur pentru reacia de restricie: i) tampon de restricie care
conine 60 mM TRIS-HCl, 1 mM NaCl, 60 mM MgCl2, 10 mM DTT (ditiotreitol) pH
7,5; ii) albumin seric bovin (BSA) acetilat 10 g/l; iii) endonucleaza de restricie
Taq I 10U/l; iv) microcentrifug; v) agitator; vi) termobloc.

Mod de lucru
Amplificarea prin reacie PCR
1. Reactivii prezentai n tabelul 26 se amestec ntr-un tub de microcentrifug de
0,5 ml pentru a obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.

Tabel 26: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei PCR.

Componente Volum (l)
Tampon PCR 10X 2,5
MgCl2 1,5
dNTP 2
Polimeraz AmpliTaq Gold 0,1
Primer sens 0,6
Primer antisens 0,6
Ap ultrapur 12,7
Volum total 20

2. Pentru fiecare exemplar testat se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte

un tub de centrifug de 200 l.
3. Se adaug 5l ADN extras de la fiecare exemplar de testat, diluat corespunztor
(circa 50 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.
4. Tuburile se aeaz n aparatul PCR, iar acesta se programeaz respectnd
parametrii prezentai n tabelul 27.
 Tabel 27: Etapele reaciei PCR.
Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
Etapa 40 de cicluri Extensie Etapa
de PCR
iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 min. 30 sec. 30 sec. 1 minut 30 minute
o o o o
9700 95 C 95 C 57 C 72 C 72oC
1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Electroforeza n gel de agaroz n vederea vizualizrii produilor de amplificare

Dup terminarea reaciei PCR se realizeaz o electroforez n gel de agaroz
pentru vizualizarea produilor de amplificare.
Gelul de agaroz 2% se prepar n conformitate cu protocolul prezentat n
Capitolul II, protocolul II.4. Produii de amplificare se amestec cu tamponul probei i se
ncarc n godeuri. Se conecteaz tancul de electroforez la sursa de curent i se pornete
electroforeza. Migrarea se desfoar la tensiune constant i la temperatura camerei,
timp de 40 50 de minute, n funcie de mrimea fragmentelor amplificate. La finalul
migrrii, vizualizarea benzilor de ADN se realizeaz cu ajutorul unui transiluminator UV.
Reacia de restricie
1. Reactivii din tabelul 28 sunt adugai ntr-un tub de microcentrifug pentru a
obine amestecul de restricie. Se vortexeaz i se centrifugheaz.
2. Digestia se desfoar la 37C, timp de 3 ore. Deoarece enzima Taq I este
termorezistent digestia se poate realiza i timp de 2 ore la 650C.

Tabel 28: Componentele i cantitile necesare efecturii reaciei de restricie.

Componente Volum (l)
Tampon de restricie 10X 1,5
BSA acetilat 0,4
Produs PCR 10
Taq I 1,1
Ap ultrapur 2
Volum total 15
 Detectarea fragmentelor marcate fluorescent:
1. Se amestec 1 l produs de amplificare cu 0,5 l din standardul de mas
molecular Gene-Scan-500 ROX Size Standard i 12,5 l formamid deionizat.
2. nainte de introducerea probelor n aparat se face denaturarea acestora prin
nclzire la 95C (2 minute) i apoi rcirea brusc pe ghea (cel puin 3 minute).
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat ABI Prism 310.

Rezultate i discuii
n vederea diagnosticrii maladiei au fost combinate tehnica RFLP i identificarea
fragmentelor marcate fluorescent n sistem automat.
n funcie de profilul fragmentelor de restricie obinute se poate stabilii cu
certitudine dac indivizii analizai sunt sntoi, purttori sau bolnavi. Mutaia
punctiform apare la nivelul situsului de restricie recunoscut de Taq I (TCGA). Astfel,
n absena mutaiei situsul de restricie este activ i zona amplificat este tiata n dou
fragmente de 65 i 35 pb. n prezena mutaiei (C/G), secvena recunoscut de enzim este
modificat, iar ampliconul rmne intact (100 pb).

Figura 25: Profilele pentru trei exemplare de cabaline diagnosticate ca fiind normale pentru HYPP.
 Analiza fragmentelor de restricie pentru un individ homozigot normal evidentiaza
obinerea unui singur semnal cu mrimea de 65 pb (Figura 25). n cazul unui individ
purttor se evideniaz dou semnale, unul pentru 65 pb i altul pentru 100 pb, iar pentru
un individ homozigot recesiv se evideniaz un singur semnal pentru 100 pb. n cazul
indivizilor homozigoi normali se obine un singur semnal deoarece doar primerul sens
este marcat fluorescent i astfel doar fragmentul de 65 pb din captul 5 poate fi detectat
de cititorul de fluorescen.

IV.5. Tehnica PCR multiplex

Tehnica utilizeaz pentru amplificare mai multe perechi de primeri simultan.

Principala problem pe care o pune aceast tehnic este alegerea seturilor de primeri. Este
foarte dificil alegerea mai multor perechi de primeri care s aib aproximativ aceiai
temperatur de hibridizare i care s nu formeze dimeri sau structuri secundare. De
asemenea, ei trebuie s asigure amplificri eficiente i s nu furnizeze produi secundari
de amplificare.

IV.5.1 Analiza prin PCR multiplex a microsateliilor la sturioni

Pentru analiza microsateliilor se realizeaz mai nti o reacie de amplificare de

ADN extras anterior, urmat de o electroforez capilar i de detecia n fluorescen a
produilor rezultai. Amplificarea se va realiza printr-o reacie PCR multiplex care
utilizeaz o combinaie de mai muli primeri cu secvene nucleotidice specifice
fragmentelor de interes. Rezultatul va fi amplificarea concomitent a acestor zone. Pentru
a putea funciona, metoda trebuie s utilizeze pentru amplificare primeri cu temperaturi
similare de hibridizare pentru genele studiate.
Amplificarea microsateliilor din ADN genomic extras de la Huso huso se va
realiza n dou reacii PCR multiplex: una pentru markerii Aox 23 i LS-57, iar alta
pentru LS-19, LS-34, LS-54, LS-68 i Aox 45. Cele 7 perechi de primeri necesari
amplificrii microsateliilor sunt marcai cu patru colorani fluoresceni diferii (Tabel 29).

Tabel 29: apte microsatelii specifici sturionilor i primerii marcai fluorescent necesari amplificrii.
Primer Secven Marcator Culoare
LS-19 F CATCTTAGCCGTCTGGGTAC 6-FAM Albastru
LS-19 R CAGGTCCCTAATACAATGGC
LS-34 F TACATACCTTCTGCAACG VIC Verde
LS-34 R GATCCCTTCTGTTATCAAC

LS-54 F CATCTAGTCTTTGTTGATTACAG NED Galben

LS-54 R CAAAGGACTTTGAAACTAGG

LS-57 F GCTTGGTTGCTAGTTTGC PET Rou

LS-57 R GTACAGTATGAGACCACAGGC

LS-68 F TTATTGCATGGTGTAGCTAAAC NED Galben

LS-68 R AGCCCAACACAGACAATATC

Aox 23 F CAGTGTGCTAGCTTCTCAATA 6-FAM Albastru

Aox 23 R GTTAGCTTAACCATGAATTGTG

Aox 45 F TTGTTCAATAGTTTCCAACGC PET Rou

Aox 45 R TGTGCTCCTGCTTTTACTGTC

Dup amplificare fragmentele obinute sunt supuse unei elecroforeze capilare cu

detecie n fluorescen. Concomitent cu migrarea acestora, este ncrcat i un standard de
mas molecular, marcat cu un fluorocrom diferit, acesta permind estimarea cu precizie
a mrimii fragmentelor amplificate.

Material biologic: probe de ADN genomic de morun.

Reactivi i aparatur: i) amestec de deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii)
clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500
mM KCl, pH 8,3; iv) polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; v) ap ultrapur; vi) primeri
sens i antisens 20 M din fiecare (Tabel 29); vii) formamid deionizat; viii) standard de
mas molecular Gene-Scan-500 LIZ Size Standard; ix) aparat PCR; x) analizator
genetic automat; xi) microcentrifug; xii) agitator; xiii) termobloc.
 Mod de lucru
Pentru fiecare animal testat au fost preparate dou reacii PCR multiplex. Dup
terminarea amplificrii se combin produii reaciilor multiplex i se pun ntr-un singur
tub de analiz pentru fiecare animal de testat.
Prepararea reaciei 2-plex:
1. Reactivii prezentai n tabelul 30 se adaug ntr-un tub de 0,5 ml pentru a obine
amestecul de reacie. Se agit i se centrifugheaz.

Tabel 30: Componentele i volumele amestecului de PCR pentru reacia 2-plex.

Componente Volum (l)
Tampon PCR 2,5
Clorur de magneziu 1,5
Amestec de nucleotide 3
ADN polimeraz AmpliTaq Gold 0,4
Perechile de primeri: Aox 23 i LS-57 0,3 din LS-57; 0,5 din Aox 23
Ap deionizat 11
Volum total 20

2. Pentru fiecare exemplar testat se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte

un tub de centrifug de 200 l.
3. Se adaug 5 l din ADN diluat corespunztor (40 ng/l) de la fiecare exemplar
de testat. Vortexare i centrifugare.
4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta este programat respectnd
parametrii prezentai n tabelul 32.
Prepararea reaciei 5-plex:
1. Reactivii prezentai n tabelul 31 se adaug ntr-un tub de 0,5 ml pentru a obine
amestecul de reacie. Se agit i se centrifugheaz.
2. Pentru fiecare exemplar testat se adaug 20 l din amestecul de reacie n cte
un tub de centrifug de 200 l.
3. Se adaug 5 l din ADN diluat corespunztor (40 ng/l) de la fiecare exemplar
de testat. Vortexare i centrifugare.
 4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta este programat respectnd
parametrii prezentai n tabelul 32.

Tabel 31: Componentele i volumele amestecului de PCR pentru reacia 5-plex.

Componente Volum (l)
Tampon PCR 2,5
Clorur de magneziu 1,5
Amestec de nucleotide 3
ADN polimeraz AmpliTaq Gold 0,4
Perechile de primeri: LS-19, LS-34, LS-54, 0,5 din LS-19, LS-68; 0,4 din LS-34, LS-
LS-68 i Aox 45 54; 0,5 din Aox 45
Ap deionizat 8,8
Volum total 20

Tabel 32: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
de PCR Etapa 40 de cicluri Extensie Etap
iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 minute 30 secunde 30 secunde 1 minut 60 minute
9700 95oC 95oC 53 oC 72oC 72oC 4 oC
1 ciclu 1 ciclu

Dup realizarea reaciei PCR probele se pregtesc pentru detectarea fragmentelor

amplificate:
1. Se prepar probele ce urmeaz s fie ncrcate n aparat i care vor conine 0,5
l din standardul de mas molecular Gene-Scan-500 LIZ Size Standard, 11,5 l
formamid deionizat i cte 1 l din produii de amplificare ai celor dou reacii PCR.
2. Imediat nainte de introducerea probelor n aparat se face denaturarea acestora
prin nclzire la 95C, 2 minute i apoi rcirea brusc pe ghea.
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat. Aici, fragmentele
amplificate din fiecare prob, sunt supuse unei electroforeze capilare, urmat de o detecie
n fluorescen a acestora cu ajutorul unui cititor LASER special. Profilele rezultate sunt
prelucrate cu ajutorul programelor GeneScan Analysis i Genotyper (Applied Biosystems).
 Rezultate i discuii
Pentru a putea interpreta corect rezultatele unei analize de microsatelii analiza
pornete de la profilul genetic neprelucrat rezultat n urma migrrii i separrii produilor
de amplificare. Prin prelucrarea acestuia se obine n final amprenta genetic a indivizilor.
Primerii folosii de noi realizeaz amplificarea unor microsatelii care prezint un
numr variat de repetiii di-, tri- sau tetranucleotidice. Acestea confer un aspect
caracteristic profilelor genetice obinute. De asemenea, trebuie menionat c numrul de
alele prezente pe un anumit locus depinde att de homo- sau heterozigoia exemplarului
analizat, ct i de gradul de poliploidie al genomului.
Astfel, la exemplarele homozigote care prezint o singur alel pe un anumit locus,
pe electroforegram o s apar un singur semnal. Exemplarele heterozigote prezint dou
alele diferite pe un anumit locus, deci pe electroforegram vor aprea dou semnale. n
cazul exemplarelor poliploide, numrul de alele pe un anumit locus poate fi mai mare de
dou, n funcie de gradul de poliploidie. n cazul morunilor locusul LS-57 este poliploid
(Figurile 26 - 29).

Figura 26: Profil specific pentru locii AOX 23 i LS-19 la Huso huso.

Figura 27: Profil specific pentru locusul LS-34 la Huso huso.

Figura 28: Profil specific pentru locii LS-68 i LS-54 la Huso huso.

Figura 29: Profil specific pentru locii AOX 45 i LS-57 la Huso huso.

IV.5.2 Analiza prin PCR multiplex a microsateliilor la suine

Principiul metodei
Pentru analiza microsateliilor s-au desemnat primeri specifici regiunilor care
urmeaz s fie amplificate, primerul sens fiind marcat cu un colorant fluorescent specific.
Amplificarea microsateliilor din ADN genomic extras de la suine se va realiza n dou
reacii PCR multiplex: una pentru markerii SW24, SO386 i SO005, iar alta pentru
SW936, SO228, SO155, SW911, SO355, SW240, SW857 i SO101. Cele 11 perechi de
primeri necesari amplificrii microsateliilor sunt marcate cu patru colorani fluoresceni
diferii i sunt prezentate n tabelul 33.
Dup amplificare prin PCR-multiplex, fragmentele obinute sunt supuse unei
elecroforeze capilare cu detecie n fluorescen. Concomitent cu migrarea acestora, este
ncrcat i un standard de mas molecular, marcat la rndul su cu un fluorocrom diferit
(LIZ), acesta permind estimarea cu o nalt precizie a mrimii fragmentelor amplificate.

Material biologic: probe de ADN genomic de la suine din diferite rase.

Reactivi i aparatur: i) amestec de deoxinucleotide 10 mM din fiecare; ii)
clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X care conine 100 mM TRIS-HCl, 500
mM KCl, pH 8,3; iv) polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; v) ap ultrapur; vi) primeri
sens i antisens 20 M din fiecare (Tabel 33); vii) formamid deionizat; viii) standard de
mas molecular Gene-Scan-500 LIZ Size Standard; ix) aparat PCR; x) analizator
genetic automat; xi) microcentrifug; xii) agitator; xiii) termobloc.

Tabel 33: 11 loci specifici suinelor i coloranii fluoresceni cu care sunt marcai primerii sens.

Microsatelit Colorant Culoare Secvena primerilor

SW936 6-FAM Albastru F TCTGGAGCTAGCATAAGTGCC

R GTGCAAGTACACATGCAGGG

SO228 6-FAM Albastru F GGCATAGGCTGGCAGCAACA

R GTTCCGCCCTCACAGACCCAAAT

SO155 6-FAM Albastru F TGTTCTCTGTTTCTCCTCTGTTTG

R GTTAAAGTGGAAAGAGTCAATGGCTAT

SW911 VIC Verde F CTCAGTTCTTTGGGACTGAACC

R CATCTGTGGAAAAAAAAAGCC

SO355 VIC Verde F TCTGGCTCCTACACTCCTTCTTGATG

R GTTTGGGTGGGTGCTGAAAAATAGGA

SW240 NED Galben F AGAAATTAGTGCCTCAAATTGG

R AAACCATTAAGTCCCTAGCAAA

SW857 NED Galben F TGAGAGGTCAGTTACAGAAGACC

R GATCCTCCTCCAAATCCCAT

SO101 NED Galben F GAATGCAAAGAGTTCAGTGTAGG

R GTCTCCCTCACACTTACCGCAG

SW24 PET Rou F CTTTGGGTGGAGTGTGTGC

R ATCCAAATGCTGCAAGCG

SO386 PET Rou F GAACTCCTGGGTCTTATTTTCTA

R GTCAAAAATCTTTTTATCTCCAACAGTAT

SO005 PET Rou F TCCTTCCCTCCTGGTAACTA

R GCACTTCCTGATTCTGGGTA
 Mod de lucru
Pentru fiecare animal testat au fost preparate dou reacii PCR multiplex. Dup
terminarea amplificrii se combin produii reaciilor multiplex i se pun ntr-un singur
tub de analiz pentru fiecare animal de testat.
Prepararea reaciei 3-plex:
1. Reactivii prezentai n tabelul 34 se adaug ntr-un tub de centrifug pentru a
obine amestecul de reacie. Se agit i se centrifugheaz.

Tabel 34: Componentele i volumele amestecului de PCR pentru reacia 3-plex.

Componente Volum (l)
Tampon PCR 2,5
Clorur de magneziu 1,5
Amestec de nucleotide 2
ADN polimeraz AmpliTaq Gold 0,3
Primeri sens i antisens 0,6 din SW24; 0,5 din SO386; 0,5 din SO005
Ap deionizat 10,5
Volum total 20

2. Un volum de 20 l din amestecul de reacie se adaug n cte un tub de

centrifug pentru fiecare exemplar testat. Se adaug 5 l din ADN diluat corespunztor
(50 ng/l) de la fiecare exemplar de testat. Vortexare i centrifugare.
3. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta se programeaz respectnd
parametrii prezentai n tabelul 36.
Prepararea reaciei 8-plex:
1. Reactivii prezentai n tabelul 35 se adaug ntr-un tub de 0,5 ml pentru a obine
amestecul de reacie. Se agit i se centrifugheaz.
2. Un volum de 20 l din amestecul de reacie se adaug n cte un tub de 0,2 ml
pentru fiecare exemplar testat.
3. Se adaug 5 l din ADN diluat corespunztor (50 ng/l) de la fiecare exemplar
de testat. Vortexare i centrifugare.
4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta se programeaz respectnd
parametrii prezentai n tabelul 36.
 Tabel 35: Componentele i volumele amestecului de PCR pentru reacia 8-plex.
Componente Volum (l)
Tampon PCR 2,5
Clorur de magneziu 1,5
Amestec de nucleotide 3
ADN polimeraz 0,4
Primeri sens i antisens 0,3 din SW936; 0,4 din SO228; 0,5 din SO155; 0,3 din SW911;
0,4 din SO355; 0,4 din SW240; 0,4 din SW857; 0,4 din SO101
Ap deionizat 8,8
Volum total 20

Tabel 36: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat Etapa 34 de cicluri Extensie Etap
de PCR iniial Denaturare Anelare Extindere final final
GeneAmp 10 minute 30 secunde 30 secunde 1 minut 60 minute
9700 95oC 95oC 60oC 72oC 72oC 4 oC
1 ciclu 1 ciclu

Dup realizarea reaciei PCR probele se pregtesc pentru detectarea fragmentelor

amplificate:
1. Se prepar probele ce urmeaz s fie ncrcate n aparat i care vor conine 0,5
l din standardul de mas molecular Gene-Scan-500 LIZ Size Standard, 10,5 l
formamid deionizat, 0,8 l din produii de amplificare ai reaciei 8-plex i 1,2 l din
produii reaciei 3-plex.
2. Imediat nainte de introducerea probelor n aparat se face denaturarea acestora
prin nclzire la 95C, 2 minute i apoi rcirea brusc pe ghea.
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat. Fragmentele amplificate,
sunt supuse unei electroforeze capilare, urmat de o detecie n fluorescen. Profilele
rezultate sunt prelucrate cu ajutorul programelor GeneScan Analysis i Genotyper.

Rezultate i discuii
Cei 11 microsatelii au fost amplificai prin dou reacii multiplex i ampliconii
migrai ntr-o singur rulare. n figurile 30 - 33 sunt prezentate rezultatele obinute pentru
un singur exemplar.
Figura 30: Profil specific pentru locii SW936, SO155 i SO228.

Figura 31: Profil specific pentru locii SW240, SW857 i SO101.

Figura 32: Profil specific pentru locii SW24, SO386 i SO005.

Figura 33: Profil specific pentru locii SW911 i SO355.

IV.5.3 Aplicaii ale tehnicii PCR multiplex - Genotiparea la cabaline n
vederea testrii paternitii

Principiul metodei
n cazul tehnicii de genotipare se realizeaz mai nti o reacie PCR multiplex
utilizand ADN genomic, urmat de o electroforez capilar i de detecia n fluorescen a
produilor rezultai.
Pentru reacia PCR multiplex se utilizeaz o combinaie de mai muli primeri cu
secvene specifice fragmentelor de interes. Rezultatul va fi amplificarea concomitent a
acestor zone. Pentru a putea funciona, metoda trebuie s utilizeze pentru amplificare
primeri cu temperaturi similare de hibridizare la secvenele ADN de interes.
Amplificarea microsateliilor din ADN extras s-a realizat cu ajutorul kitului
StockMarks For Horses.
Kitul conine 17 perechi de primeri necesari amplificrii a 17 microsatelii, marcai
cu patru colorani fluoresceni diferii (6-FAM, NED, VIC i PET). Cei 17 microsatelii
sunt amplificai printr-o singur reacie PCR multiplex. Temperaturile de hibridizare i
concentraiile primerilor sunt ajustate astfel nct s permit amplificarea celor 17
microsatelii ntr-o singur reacie PCR.
Dup amplificare, pentru a putea fi vizualizate, fragmentele obinute sunt supuse
unei elecroforeze capilare cu detecie n fluorescen. Concomitent cu migrarea acestora,
este ncrcat i un standard de mas molecular, marcat la rndul su cu un fluorocrom
diferit (LIZ), acesta permind estimarea cu o nalt precizie a mrimii fragmentelor
amplificate.
Marcarea microsateliilor i a standardului de mas molecular cu cei cinci
colorani fluoresceni diferii permite practic vizualizarea acestora n cadrul aceleiai
migrri.
Cei 17 microsatelii amplificai cu ajutorul kitului StockMarks sunt prezentai n
tabelul 37.
 Tabel 37: 17 loci specifici cabalinelor amplificai cu ajutorul kitului StockMarks.
Locus Colorant Culoare Mrimea estimat a
fragmentelor (pb)
VHL20 6-FAM Albastr 83102
HTG4 6-FAM Albastr 116137
AHT4 6-FAM Albastr 140166
HMS7 6-FAM Albastr 167187
HTG6 VIC Verde 74103
AHT5 VIC Verde 126147
HMS6 VIC Verde 154170
ASB23 VIC Verde 276212
ASB2 VIC Verde 237268
HTG10 NED Galben 83110
HTG7 NED Galben 114128
HMS3 NED Galben 146170
HMS2 NED Galben 215236
ABS17 PET Roie 104-116
LEX3 PET Roie 137-160
HMS1 PET Roie 166-178
CA425 PET Roie 224-247

Material biologic: probe de ADN genomic de la familii de cabaline din diferite

rase.
Reactivi i aparatur: i) StockMarks for Horses Kit (Applied Biosystems):
amestec de 17 perechi de primeri marcai fluorescent; tampon PCR StockMarks care
conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2, pH 8,3; amestec de nucleotide
1,25 mM din fiecare; control ADN 10 ng/l; polimeraz AmpliTaq Gold 5 U/l; ii)
standard de mas molecular Gene-Scan-500 LIZ Size Standard (Applied Biosystem);
iii) formamid deionizat; iv) aparat PCR GeneAmp PCR System 9700
(AppliedBiosystems); v) analizator genetic automat ABI Prism 310 (Applied Biosystems);
vi) microcentrifug; vii) agitator; viii) termobloc.
 Mod de lucru
Pentru fiecare animal testat este preparat o singur reacie PCR multiplex.
1. Reactivii prezentai n tabelul 38 se adaug ntr-un tub de centrifug pentru a
obine amestecul de reacie. Se vortexeaz i se centrifugheaz.

Tabel 38: Componentele i volumele amestecului de PCR pentru reacia multiplex.

Componente Volum (l)
Tampon PCR StockMarks 2,5
Amestec de nucleotide 4
ADN polimeraz AmpliTaq Gold 0,5
Amestec de primeri (17 perechi) 4
Ap deionizat 3
Volum total 14

2. Un volum de 14 l din amestecul de reacie este repartizat n cte un tub de PCR

de 0,2 ml pentru fiecare animal testat.
3. Se adaug 1 l din ADN izolat de la fiecare animal de testat, diluat
corespunztor (5-10 ng/reacie). Se vortexeaz i se centrifugheaz.
4. Tuburile se aeaz n aparatul de PCR, iar acesta se programeaz respectnd
parametrii indicai n tabelul 39.

Tabel 39: Etapele reaciei PCR.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat de
PCR Etapa 30 de cicluri Extensie Etap
iniial final final
Denaturare Hibridizare Extindere
GeneAmp 10 min. 30 secunde 30 sec. 1 minut 60 minute
9700 95oC 95oC 60oC 72oC 72oC
1 ciclu 1 ciclu 4 oC

Dup realizarea reaciei PCR multiplex probele se pregtesc pentru detectarea

fragmentelor amplificate:
 1. Se amestec 1 l produs de amplificare cu 0,5 l din standardul de mas
molecular Gene-Scan-500 LIZ Size Standard i cu 11,5 l formamid deionizat.
2. Imediat nainte de introducerea probelor n aparat se face denaturarea acestora
prin nclzire la 95C i apoi rcirea brusc pe ghea.
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat ABI Prism 310. Aici
fragmentele amplificate din fiecare prob sunt supuse unei electroforeze capilare, urmat
de o detecie n fluorescen a acestora cu ajutorul unui cititor LASER special.
4. Rezultatele sunt prelucrate cu ajutorul programelor GeneScan Analysis i
Genotyper (Applied Biosystems). n urma analizei se vor obine amprentele genetice ale
fiecrui exemplar.

Rezultate i discuii:
Polimorfismul microsateliilor reflect motenirea genetic i permite detectarea
diferenelor ntre diferii indivizi. Prin urmare, acetia sunt extrem de utili pentru
stabilirea identitii i verificarea paternitii dac sunt folosii ca markeri ADN.
Pentru verificarea paternitii, microsateliii trebuie s fie diferii, s prezinte un
grad nalt de polimorfism, s prezinte un nivel mutaional sczut, s fie uor de marcat i
s poat fi amplificai ntr-o singur reacie PCR multiplex. Setul de markeri utilizai
pentru testele de paternitate a fost realizat la ceva timp dup nceputul proiectului de
cartare a genomului cailor, cnd erau cunoscui relativ puini microsatelii, dar a fost
completat ulterior prin adugarea de noi markeri, crescndu-se astfel eficiena acestuia.
Pentru a putea interpreta corect rezultatele unei analize de microsatelii trebuie s
inem cont de mai multe aspecte. Practic analiza pornete de la profilul genetic
neprelucrat rezultat n urma migrrii i separrii produilor de amplificare (Figura 34).
Prin prelucrarea acestuia se obine n final amprenta genetic a indivizilor.
Primerii din kitul StockMarks realizeaz amplificarea unor microsatelii care
prezint un numr variat de repetiii dinucleotidice. Acestea confer un aspect
caracteristic profilelor genetice obinute.
Figura 34: Profil genetic neprelucrat pentru un singur exemplar.

De asemenea, trebuie menionat c numrul de alele prezente pe un anumit locus

depinde de homo- sau heterozigoia individului analizat. Astfel, la indivizii homozigoi
care prezint o singur alel pe un anumit locus pe electroforegram o s apar un singur
semnal. Indivizii heterozigoi prezint dou alele diferite pe un anumit locus, deci pe
electroforegram vor aprea dou semnale. Aliura semnalelor obinute depinde i ea de
mrimea microsateliilor amplificai.
Pentru a realiza interpretarea corect a testelor se desemneaz iniial alelele
produilor. Acestea trebuie s fie motenite, cte una una de la fiecare genitor n parte.
Dac nu exist nici o nepotrivire la nivelul tuturor locilor analizai putem afirma c
produsul aparine cu o probabilitate de peste 99,999% acelui cuplu de genitori.
n Figurile 35 - 38 i n Tabelul 40 sunt prezentate comparativ rezultatele unui test
de paternitate realizat cu un set de 17 microsatelii la o familie de cai din rasa Cal de Sport
Romnesc.
Figura 35: Profilele exemplarelor analizate pe locii VHL20, HTG4, AHT4 i HMS7.

Figura 36: Profilele exemplarelor analizate pe locii HTG6, AHT5, HMS6, ASB23 i ASB2.
Figura 37: Profilele exemplarelor analizate pe locii HTG10, HTG7, HMS3 i HMS2.

Figura 38: Profilele exemplarelor analizate pe locii ASB17, LEX3, HMS1 i CA425.
 Tabel 40: Alelele prezente la iap (23), produs (38) i armsar (53).
Locus/Exemplar Armsar Produs Iap
VHL20 94, 94 94, 96 86, 96
HTG4 130, 130 130, 130 126, 130
AHT4 148, 158 158, 158 148, 158
HMS7 179, 181 179, 181 179, 179
HTG6 86, 96 80, 86 80, 86
AHT5 132, 136 136, 136 130, 136
HMS6 160, 168 168, 168 168, 168
ASB23 190, 190 188, 190 188, 190
ASB2 238, 244 238, 250 248, 250
HTG10 86, 90 86, 94 94, 98
HTG7 118, 118 118, 126 124, 126
HMS3 148, 148 148, 164 158, 164
HMS2 216, 222 216, 226 226, 236
ASB17 98, 118 98, 98 98, 112
LEX3 152, 152 152, 162 154, 162
HMS1 182, 182 182, 182 174, 182
CA425 234, 238 238, 238 238, 238

n practic se ntlnesc i cazuri de excludere, n care produsul nu aparine unuia

sau ambilor prini. n astfel de cazuri el nu va avea alelele comune cu genitorii. Pentru a
avea un caz de excludere, la analiza alelelor, trebuie s ntlnim cel puin dou nepotriviri
ntre genitori i produs. Dac exist o singur excludere nu putem afirma cu siguran c
produsul nu aparine acelui cuplu pentru c aceasta poate fi rezultatul unei mutaii.

IV.6. Tehnica RT-PCR (PCR revers transcris)

Principiul metodei
Tehnica permite punerea n eviden a prezenei moleculelor de ARNm ntr-un
esut sau organ.
 Principiul const n extragerea ARN total din esuturile sau organele studiate i
copierea acestora ntr-o molecula de ADN complementar cu ajutorul transcriptazei
inverse i n prezena unor primeri adecvai. Moleculele de ADN obinute servesc drept
matri pentru o reacie PCR care folosete un cuplu de primeri specifici pentru secvena
ADN de interes. n reacie se folosete o ADN polimeraz ARN-dependent. Hibridul
ARN:ADN obinut n reacia de revers transcriere este supus unei reacii de degradare a
catenei ARN cu ribonucleaz, iar dup aceea, la catena ADN rmas intact, este ataat
un primer complementar cu captul 3 al acesteia. Dup sinteza celei de-a doua catene de
ADN moleculele sunt supuse unei reacii de PCR normale.

Material biologic: probe de ARN total.

Reactivi i aparatur: i) iScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad): 5X iScript
Reaction Mix; ap lipsit de nucleaze; enzim iScript Reverse Transcriptase; ii)
agitator; iii) microcentrifug; iv) aparat PCR.

Mod de lucru
1. Se amestec componentele prezentate n tabelul 41 n cte un tub de 0,5 ml. Se
agit i se centrifugheaz uor.

Tabel 41: Reactivi, cantiti i concentraii necesare realizrii reaciei RT-PCR.

Componente Volum (l) Cantitate

5X iScript Reaction Mix 4 1X

iScript Reverse Transcriptase 1
Ap nuclease-free x
ARN total x 100 fg - 1g
Volum total 20

2. Se aeaz tuburile n aparatul PCR i acesta se programeaz respectnd

parametrii prezentai n tabelul 42.
3. Dup realizarea reaciei RT-PCR probele se pstreaz la -20 oC.
 Tabel 42: Etapele reaciei RT-PCR.
Aparat de PCR Timpii i temperaturile de incubare
5 minute 45 minute 5 minute
25 oC 42 oC 95 oC 4 oC
Progene

IV.7 Tehnica Real-Time PCR

Real-Time RT-PCR este o metod folosit pentru detectarea nivelului de expresie

a genelor (cantitatea de ARNm) cu ajutorul moleculelor fluorescente. Metodele
tradiionale folosesc gelul de agaroz pentru detectarea produilor PCR. Aceasta ridic
diverse probleme de rezoluie, sensibilitate sau precizie.
Metoda Real-Time PCR detecteaz acumularea ampliconului pe parcursul ntregii
reacii de amplificare, permind monitorizarea n timp real a probei. Tehnica nglobeaz
mecanismele de amplificare i detecie ntr-o singur etap. Acest lucru este obinut n
urma folosirii diferiilor compui fluoresceni care au capacitatea de a corela concentraia
produilor PCR cu intensitatea culorii. Cu ct numrul de copii din secvena de interes
este mai mare, la nceputul reaciei, cu att mai puine cicluri de amplificare vor fi
necesare pentru a genera numrul minim de ampliconi care pot fi detectai.

IV.7.1 Cuantificarea relativ a expresiei genei leptinei la suine

Principiul metodei
Practic experimentul urmrete modificrile expresiei genei care codific pentru
leptin la diferite rase de suine i n diferite tipuri de esuturi. Cuantificarea ampliconilor
se va realiza utiliznd un compus chimic fluorescent (SYBR Green). Acesta are
capacitatea de a se intercala ntre bazele azotate, iar atunci cnd este ncorporat la nivelul
ADN are o fluorescen de 200 de ori mai crescut dect atunci cnd este liber n soluie.

Material biologic: probe de ADNc (obinute prin RT-PCR).

 Reactivi i aparatur: i) primeri specifici leptina sens
TTGGCCCTATCTGTCCTACG (20M); antisens TTTCTGGAAGGCAGACTGGT
(20M); GAPDH sens GGGCATGAACCATGAGAAGT (20M); antisens
TCTTCTGGGTGGCAGTGAT (20M); ii) iQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad):
SYBR Green Super Mix (100mM KCl, 40mM Tris-HCl 0,4 mM (pH 8,4); ADN
polimeraz iTaq 50 U/ml, 6 mM MgCl2, SYBR Green I, 20 nM fluorescein,
stabilizatori); iii) agitator; iv) centrifug de plci; v) aparat Real-Time PCR.

Mod de lucru
Calcularea eficienei amplificrii genei int (leptina) i genei de referin
(GAPDH gliceraldehid fosfat dehidrogenaz)
Pentru calcularea eficienei se realizeaz 5 diluii seriale ale ADNc: 10X (10
ng/reacie), 102X (1 ng/reacie), 103X (0,1 ng/reacie), 104X (0,01 ng/reacie), 105X
(0,001ng/reacie). Ulterior se parcurg urmtorii pai:
1. Componentele prezentate n tabelele 43 i 44 se amestec n tuburi de
centrifug. Se agit i se centrifugheaz uor. Se prepar dou amestecuri de reacie
separate, unul pentru gena de referin i altul pentru gena int.

Tabel 43: Amestecul de reacie pentru gena leptinei.

Componente Volum (l) Concentraie
iQ SYBR Green Supermix 12,5
Primer sens leptin 0,5 0,4M
Primer antisens leptin 0,5 0,4M
Ap fr nucleaze 7,4
Volum total 21

Tabel 44: Amestecul de reacie pentru gena GAPDH.

Componente Volum (l) Concentraie
iQ SYBR Green Supermix 12,5
Primer sens GAPDH 0,5 0,4M
Primer antisens GAPDH 0,5 0,4M
Ap fr nucleaze 7,4
Volum total 21
 Tabel 45: Schema reaciei Real-Time PCR.
Timpii i temperaturile de incubare
Aparat
Etapa 45 de cicluri Curba de melting Etapa
de PCR
iniial Denaturare Hibridizare Extindere final

5 minute 30 secunde 30 secunde 25secunde 1 minut 1 minut Creterea temperaturii

o o o o o o
IQ 95 C 95 C 61 C 72 C 95 C 55 C cu 0,5 oC/ciclu
20oC
Cycler 1 ciclu 1 ciclu 1 ciclu 85 cicluri

2. n godeurile plcuei de reacie se adug cte 21l din amestecurile de reacie.

3. Se adaug 4 l ADNc, diluat corespunztor i se omogenizeaz prin amestecare
cu vrful pipetei.
4. Plcua este sigilat cu o folie termorezistent i se centrifugheaz uor.
5. Se aeaz plcua n aparatul PCR i acesta este programat respectnd parametrii
prezentai n tabelul 45.
Fiecare diluie se lucreaz n triplicat, iar la finalul reaciei se realizeaz o analiz a
datelor cu programul iCycler. n urma analizei se obine curba standard i eficiena
reaciei pentru fiecare gen analizat (Figurile 39 i 40).

Figura 39: Calcularea eficienei i a curbei standard pentru gena leptinei.

Figura 40: Calcularea eficienei i curbei standard pentru gena GAPDH.

Cuantificarea relativ a expresiei genei pentru leptin

1. Componentele prezentate n tabelele 43 i 44 se amestec n tuburi de
centrifug. Se agit i se centrifugheaz uor. Se prepar dou amestecuri de reacie
separate, unul pentru gena de referin i altul pentru gena int.
2. n godeurile plcuei de reacie se adug cte 21l din ambele amestecuri de
reacie.
3. Se adaug 4 l ADNc, diluat corespunztor (10 ng/reacie) i se omogenizeaz
prin amestecare cu vrful pipetei.
4. Plcua este sigilat cu o folie termorezistent i se centrifugheaz uor.
5. Se aeaz plcua n aparatul PCR i acesta este programat ca n Tabelul 45.
Fiecare prob a fost lucrat n triplicat; iar pentru fiecare ras s-au ales cte trei
exemplare. Rezultatele obinute au fost prelucrate cu programul iCycler.

Rezultate i discuii
Dup rularea probelor se obin profilele din Figurile 41 - 43. Din curba
exponenial de amplificare se obine valoarea Ct (ciclul la care intensitatea fluorescenei
probele intersecteaz fluorescena prag, iar din curba de melting se determin existena
unei contaminri cu ADN genomic, prezena dimerilor de primeri i a amplificrilor
nespecifice.

Figura 41: Curba exponeial de amplificare.

Figura 42: Curba de melting pentru produii de amplificare ai genei pentru leptin.
Figura 43: Curba de melting pentru produii de amplificare ai genei pentru GAPDH.

Dup obinerea valorilor Ct se realizeaz analiza rezultatelor. Astfel, se scrie

ecuaia amplificrii pentru fiecare prob, att pentru gena int ct i pentru gena de
referin. Dac A reprezint proba analizat, iar B proba control, pentru o singur gen de
referin vom avea ecuaia:
NCt=No(1+E)Ct unde,
NCt = numrul de molecule de ADNc la ciclul Ct;
No = numrul iniial de molecule de ADNc;
E = eficiena reaciei PCR;
deci pentru probele noastre:
(NCt)Aref=NoAref (1+E) CtAref (NCt)Bref=NoBref (1+E) CtBref
(NCt)Atar=NoAtar (1+E)CtAtar (NCt)Btar=NoBtar (1+E)CtBtar
Deoarece gena de referin este diferit de gena int, iar produsul de amplificare
are o mrime diferit i va ngloba un numr diferit de molecule de SYBR Green, cele
dou valori (NCt)Atar, (NCt)Aref nu sunt egale i se va introduce un factor de corecie notat
cu k*. Astfel, ecuaia devine:
(NCt)Atar = k* (NCt)Aref .
 Normalizarea se realizeaz prin calcularea raportului dintre NoTar i NoRef pentru
fiecare prob:
NoAtar/NoAref = k*[(1+E)CtAref /(1+E)CtAtar ] proba A - tratat
NoBtar/NoBref = k*[(1+E)CtBref /(1+E)CtBtar] proba B - control
n cazul unei eficiene de 100% se obine formula de mai jos:
NoAtar/NoAref = k*2CtAref-CtAtar = k*2Ct proba A analizat
NoBtar/NoBref = k*2CtBref-CtBtar = k*2Ct proba B control
Pentru determinarea diferenei de expresie a genei int ntre cele dou probe se
realizeaz raportul acestora: proba A/proba B. Vom avea ecuaia:
probaA/probaB = 2Ct
n cazul unei valori de 1 se consider c gena are acelai nivel de expresie n cele
dou condiii (control versus analizat); pentru o valoarea >1 gena este supraexprimat n
proba A analizat comparativ cu proba B control, iar pentru o valoare <1 gena este
subexprimat n proba A comparativ cu proba B.
CAPITOLUL V. SECVENIALIZAREA ADN

V.1 Secvenializarea prin metoda Dye-terminator

Principiul metodei
Una dintre metodele folosite pentru secvenializare este dye-terminator.
n cazul acestei metode un primer oligonucleotidic este desemnat pe baz de
complementaritate cu secvena pe care dorim s o secvenializm. Plecnd de la
extremitatea 3-OH a primerului mperecheat, o ADN polimeraz sintetizeaz catena
complementar n prezen de deoxinucleotide (dNTP) i dideoxinucleotide (ddNTP).
Fiecare dintre aceste dideoxinucleotide sunt marcate cu cte un colorant fluorescent
diferit. La fiecare ncorporare a unui ddNTP elongarea catenei este stopat, ceea ce
genereaz o colecie de fragmente de mrimi diferite, dar care se termin cu un ddNTP
marcat corespunztor.
Dac se pstreaz o proporie corect ntre prezena dNTP i ddNTP, se vor obine
fragmente nou sintetizate de toate lungimile, terminate printr-un ddNTP diferit.
Fluorescena acestora va fi analizat cu ajutorul unui detector LASER care excit
marcatorul fluorescent, radiaia acestuia fiind preluat de o camer special. Semnalul
este prelucrat de programe specializate de calculator obinndu-se n final
electroforegrama corespunztoare secvenei analizate.
n cazul experimentului de fa am realizat amplificarea unui fragment de ADN la
nivelul cruia este posibil apariia unei mutaii punctiforme care s conduc la
declanarea deficienei de adeziune leucocitar bovin.
Baza molecular a maladiei este reprezentata de prezena unei mutaii punctiforme
(adenin trece n guanin) de la nivelul ARNm/ADNc al genei CD18 care determin
substituia acidului aspartic cu glicina n poziia 128 a proteinei de adeziune D128G
(Shuster et al., 1992, Jorgensen et al., 1993, Gerardi, 1996, Meylan et al., 1997).

Material biologic: probe de ADN genomic.

 Reactivi i aparatur pentru reacia de amplificare: i) amestec de deoxi-
nucleotide 10 mM din fiecare; ii) clorur de magneziu 25 mM; iii) tampon PCR 10X care
conine 100 mM TRIS-HCl, 500 mM KCl, pH 8,3; ADN polimeraz AmpliTaq Gold 5
U/l; iv) ap ultrapur; v) primeri sens i antisens 20 M; vi) aparat PCR; vii)
spectrofotometru UV/VIS; ix) agitator.
Reactivi i aparatur pentru purificare i precipitare: i) Wizard PCR Preps DNA
Purification System (Promega); ii) izopropanol 80%; iii) formamid deionizat; iv) soluie
acetat de sodiu 3 M, pH 4,6; v) etanol 95% i 70%; vi) ap deionizat; vii) centrifug de
vid; viii) microcentrifug; ix) agitator; x) pomp de vid; xi) plit cu nclzire i agitare
magnetic.
Reactivi i aparatur pentru reacia de secvenializare: i) tampon BigDye 5X; ii)
BigDye Terminator v3.1. Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) care conine: amestec
de deoxinucleotid trifosfai, amestec de dideoxinucleotid trifosfai marcai fluorescent,
ADN polimeraz; vii) agitator; viii) termobloc; ix) microcentrifug.

Mod de lucru
Iniial se realizeaz o reacie PCR folosind primeri specifici nemarcai fluorescent,
prin care se amplific fragmentul ce urmeaz a fi secveniat. Amplificarea se realizeaz
printr-o reacie PCR clasic.
Dup terminarea reaciei PCR se trece la purificarea produilor de amplificare
folosind kitul Wizard PCR Preps.
1. ntr-un tub de centrifug de 1,5 ml se adaug 100 l de tampon de purificare.
2. Peste acesta se adaug ntre 30 i 300 l produs PCR i se vortexeaz puternic.
3. Se adaug 1 ml de rain de purificare i se vortexeaz puternic cte un minut de
trei ori la rnd.
4. Se pregtete o coloan de purificare, prin ataarea unei minicolonie la suportul
special, pentru fiecare produs care trebuie purificat.
5. Amestecul rin-ADN se pipeteaz n coloane i apoi acestea sunt conectate la
pompa de vid.
 6. Pompa de vid este ndeprtat i se spal coloana cu 2 ml izopropanol 80 %. Se
reconecteaz coloana la vid.
7. Rina este uscat prin meninerea la vid timp de 30 de secunde. Coloana se
ndeprteaz i se transfer ntr-un tub de centrifug nou.
8. Centrifugare 2 minute la 10000 rpm.
9. Coloana se transfer ntr-un alt tub de centrifug curat, se adaug 50 l ap
ultrapur sau tampon TE i se incubeaz 1 minut la temperatura camerei.
10. Centrifugare 20 de secunde la 10000 rpm pentru a elua fragmentele de ADN.
ADN purificat poate fi pstrat la 4 0C pe termen scurt sau la 20 0C pentru un timp mai
ndelungat.
Dup realizarea purificrii, produii obinui sunt analizai la spectrofotometru
pentru stabilirea concentraiei i a raportului de puritate A260/A280.
n urmtoarea etap se trece la realizarea reaciei de amplificare specific pentru
secvenializare. Trebuie precizat c pentru secvenierea catenei sens se adaug n
amestecul de reacie numai primerul sens, iar pentru secvenierea catenei antisens numai
primerul antisens, dar niciodat ambii.
1. Amestecul de reacie se prepar prin adugarea componentelor prezentate n
tabelul 46. Se vortexeaz i se centrifugeaz uor.

Tabel 46: Reactivi i cantiti necesare realizrii reaciei de amplificare specific pentru secvenializare.
Componente Cantiti
Amestec de nucleotide i dideoxi-nucleotide marcate fluorescent 4 l
Proba ADN purificat 8 ng
Tampon BigDye 5x 2 l
Primer sens sau antisens 3,2 pmol
Ap deionizat pn la un volum final de 20 l

2. Tuburile se pun n aparatul PCR programat la parametrii indicai n tabelul 47.

La finalizarea reaciei trebuie realizat precipitarea produilor obinui. Aceast
etap este absolut necesar deoarece n urma reaciei de amplificare rmn nencorporate
multe dideoxinucleotide marcate fluorescent. Acestea trebuie eliminate complet nainte ca
probele s fie s fie supuse electroforezei capilare. Excesul de dideoxinucleotide poate
afecta rezultatele prin creearea unor zone cu fluorescen puternic la nivelul
electroforegramelor. Precipitarea se poate realiza folosind una dintre metodele de mai jos.

Tabel 47: Schema reaciei de amplificare specific pentru secvenializare.

Timpii i temperaturile de incubare
Aparat de
PCR Etapa 25 de cicluri Etapa final
iniial
Denaturare Hibridizare Extindere
4 oC
GeneAmp 1 minut 10 secunde 5 secunde 4 minute
9700 96oC 96oC 50oC 60oC

Precipitarea folosind acetat de sodiu/etanol

1. Amestecul de reacie se transfer ntr-un tub de centrifug de 1,5 ml i se adaug
2,5 ml acetat de sodiu 3 M, pH 4,6 i 50 l etanol 95%.
2. Se agit puternic i se incubeaz la temperatura camerei 15-20 minute pentru
precipitarea produilor de reacie.
Un timp de precipitare mai mic de 15 minute va cauza pierderea produilor de
reacie cu lungimi mici.
3. Centrifugare 20 minute, la 4oC i 14000 g.
4. Se arunc cu atenie supernatantul prin aspersie cu micropipeta sau prin
nclinarea tubului. Sedimentul este greu vizibil.
Este foarte important ca supernatantul s fie eliminat n ntregime deoarece
dideoxinucleotidele nencorporate sunt dizolvate la nivelul lui.
5. Se adaug 250 l etanol 70%, apoi se vortexeaz.
6. Centrifugare 5 minute la 13400 rpm.
7. Se ndeprteaz supernatantul la fel ca n pasul 4.
8. Sedimentul este uscat la centrifuga de vid timp de 10-15 minute sau prin lsare 1
minut la 900C, n termobloc.
 Precipitarea folosind izopropanol
1. Amestecul de reacie se transfer ntr-un tub de centrifug de 1,5 ml i se adaug
80 l izopropanol 75%, rece.
2. Se agit puternic i se las tuburile 15 20 de minute la temperatura camerei
pentru precipitarea produilor de reacie.
Un timp de precipitare mai mic de 15 minute va cauza pierderea produilor de
reacie cu lungimi mici.
3. Centrifugare 20 de minute la 13400 rpm.
4. Se arunc cu atenie supernatantul prin aspersie cu micropipeta sau prin
nclinarea tubului. Sedimentul este greu vizibil.
Este foarte important ca supernatantul s fie eliminat n ntregime deoarece
dideoxinucleotidele nencorporate sunt dizolvate la nivelul lui.
5. Se adaug 250 l izopropanol 75% i se amestec puternic.
6. Centrifugare 5 minute la 13400 rpm.
7. Se ndeprteaz supernatantul la fel ca n pasul 4.
8. Sedimentul este uscat la centrifuga de vid timp de 10-15 minute sau prin lsare 1
minut la 900C, n termobloc.
Precipitarea folosind etanol
Folosind acest tip de precipitare, urme de dideoxinucleotide marcate vor rmne la
nivelul probelor, acestea putnd fii ulterior observate la nceputul electroforegramelor
(pn la lungimea de 40 de baze). De asemenea, recuperarea fragmentelor scurte s-ar
putea realiza cu dificultate.
1. Amestecul de reacie se transfer ntr-un tub de centrifug de 1,5 ml i se adaug
16 l de ap deionizat i 64 l etanol 95%, rece. Concentraia final a etanolului trebuie
s fie de aproximativ 60%.
2. Se agit puternic i se las tuburile 15 20 de minute la temperatura camerei
pentru precipitarea produilor de reacie.
Un timp de precipitare mai mic de 15 minute va cauza pierderea produilor de
reacie cu lungimi mici.
 3. Centrifugare 20 de minute la 13400 rpm.
4. Se arunc cu atenie supernatantul prin aspersie cu micropipeta sau prin
nclinarea tubului. Sedimentul este greu vizibil.
Este foarte important ca supernatantul s fie eliminat n ntregime deoarece
dideoxinucleotidele nencorporate sunt dizolvate la nivelul lui.
5. Se adaug 250 l etanol 70% i se amestec puternic.
6. Centrifugare 10 minute la 13400 rpm.
7. Se ndeprteaz supernatantul la fel ca n pasul 4.
8. Sedimentul se usuc la centrifuga de vid timp de 10-15 minute sau prin lsare 1
minut la 900C, n termobloc.
Pregtirea probelor pentru electroforeza capilar
1. Precipitatul se resuspend n 15l formamid deionizat. Se vortexeaz 30
secunde i se centrifugheaz uor.
2. Coninutul se denatureaz prin nclzire 3 minute, la 95oC i apoi plasare pe
ghea 5 minute.
3. Probele se introduc n analizatorul genetic automat.

Rezultate i discuii
Electroforegramele rezultate n urma migrrilor sunt prelucrate cu ajutorul
programului Sequencing Analysis 5.1 (AppliedBiosystems) obinndu-se secvenele de
nucleotide ale acestora.
Exist mai multe aplicaii importante ale secvenializrii acizilor nucleici. Una
dintre ele este obinerea de novo a secvenelor i ulterior introducerea acestora n bazele
de date internaionale. O alt aplicaie este identificarea mutaiilor sau a polimorfismelor
de secven. n cazul de fa am realizat amplificarea zonei de interes de la nivelul ADN
genomic bovin n vederea evidenierii mutaiei punctiforme ce duce la declanarea
deficienei de adeziune leucocitar bovin.
n figura 45 este prezentat secvena revers (complement) a unui individ normal,
iar n figura 46 secvena unui heterozigot purttor. n ultimul caz se poate observa clar
prezena mutaiei punctiforme nucleotidei notat cu N. Secvenele prezentate n imagini
sunt obinute prin amplificarea cu primerul antisens, acest fapt genernd apariia secvenei
complementare i deci a polimorfismului complementar T trece n C. Individul
haterozigot analizat prezint o copie normal a genei (prezint A, respectiv T n cazul
complementului) i o copie mutant (prezint G, respectiv C n cazul complementului). n
figura 47 este prezentat alinierea secvenei mutante cu secvena normal a genei.

Figura 45: Secven complementar caracteristic indivizilor normali pentru BLAD.

Figura 46: Secven complementar caracteristic indivizilor haterozigoi purttori pentru BLAD.

Figura 47: Alinierea secvenei normale i mutante la nivelul genei implicate n declanarea BLAD.
 BIBLIOGRAFIE SELECTIV

Alberts B., Bray D., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P.
(2002) Molecular Biology of The Cell, 4th ed. Ed., Garland Science Taylor&Francis
Group, New York.
Ackermann M.R., M.E. Kehrli, J.A. Laufer,L.T. Nusz: Alimentary and respiratory
tractlesions in eight medically fragile Holstein cattlewith bovine leukocyte adhesion
deficiency (BLAD). Vet. Pathol. 33: 273-281, 1996.
dAngelo, F., Santillo, A., Sevi, A., Albenzio, M. (2007) Technical Note: A Simple
Salting-Out Method for DNA Extraction from Milk Somatic Cells: Investigation into the
Goat CSN1S1. Gene J. Dairy Sci. 90:35503552.
Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D., Seidman J. G., Smith J. A.,
Struhl K. (2002) Short protocols in molecular biology 5th Ed., John Wiley & Sons, S.U.A.
Bowling, A.T. and Ruvinsky, A. (2000) The Genetics of the Horse, CABI
Publishing, Wallingford, U.K.
Chomczynski, P. and Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid
guanidine thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162:156-159, 1987.
Clark D. (2005) Molecular Biology, Elsevier Academic Press.
Costache M., Dinischiotu A. (2004) Acizi nucleici Structur i organizare, Ed.
Ars Docendi, Romnia.
Davis L.G., Dibner M.D., and Battery J.F. (1999) Basic Methods in Molecular
Biology, Elsevier Academic Press.
Gerardi A.S. Bovine leukocyte adhesion deficiency: a brief overview of a modern
disease and its implications. Folia Vet. 40: 65-69, 1996.
Harlizius B., S. Schrber, I. Tammen, D. Simon: Isolation of the bovine uridine
monophosphate synthase gene to identify the molecular basis of DUMPS in cattle. J.
Anim. Breed. Genet. 113: 303-309, 1996.
John M. S. Bartlett and David Stirling, Methods in Molecular Biology, Vol. 226:
PCR Protocols, Second Edition, Humana Press Inc.
 Jones, A. S. 1953. The isolation of bacterial nucleic acids using cetyl
trimethlyammonium bromide (cetavlon). Biochim. Biophys. Acta. 10:607-612.
Jorgensen C.B., J.S. Agerholm, J. Pedersen, P.D. Thomsen: Bovine leukocyte
adhesion deficiency in Danish Hosltein-Friesian Cattle. I. PCR screening and allele
frequency Estimation. Acta Vet. Scand. 34: 231-236, 1993.
Kuhn M.T. and R.D. Shanks: Association of deficiency of uridine monophosphate
synthase with production and reproduction. J. Dairy Sci. 77: 589-597, 1994.
Lewin B. (2004) Genes VIII, Pearson Education, S.U.A.
Lodish H., Berk A., Zipursky S. L., Matsudaira P., Baltimore D., and Darnell J.
(2000) Molecular Cell Biology, 4th ed. Ed., W. H. Freeman and Company, New York.
Marklund, L., Johansson-Moller, M., Sandberg, K. and Andersson, L. (1996) A
missense mutation in the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor (MC1R) is
associated with the chestnut coat colour in horses. Mammalian Genome 7, 895-899.
Meylan M., R. Abegg, H. Sager, T.W. Jungi, J. Martig: Fallvorstellung: Bovine
Leukozyten-Adhsions-Defizienz (BLAD) in der Schweiz. Schweiz. Arch. Tierheilk. 139:
277-281, 1997.
Milenkovic, D., Chaffaux, S., Taourit, S. and Grard Gurin, G. (2003) A mutation
in the LAMC2 gene causes the Herlitz junctional epidermolysis bullosa (H-JEB) in two
French draft horse breeds. Genet. Sel. Evol. 35, 249-256.
Murray, M.G. and Thompson, W.F. 1980. Rapid isolation of high-molecular-
weight plant DNA. Nucl. Acids Res. 8:4321- 4325.
Nagahata H., H. Nochi, K. Tamoto, H. Taniyama, H. Noda, M. Morita, M.
Kanamaki, G.J. Kociba: Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency in Holstein Cattle. Can.
J. Vet. Res. 57: 255-261, 1993.
Nagahata H., T. Miura, K. Tagaki, M. Othake, H. Noda, T. Yasuda, K. Nioka:
Prevalence and Allele Frequency Estimation of Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency
(BLAD) in Holstein-Friesian Cattle in Japan. J. Vet. Med.Sci. 59: 233-238, 1997.
 Ribeiro L.A., E.E. Baron, M.L. Martinez, L.L. Coutinho: PCR screening and allele
frequency estimation of bovine leucocyte adhesion deficiency in Holstein and Gir cattle in
Brazil. Genet. Mol. Biol. 23: 831-834, 2000.
Robinson J.L., R.D. Shanks: Review. The inherited deficiency of uridine
monophosphate synthase in dairy cattle. J. CAAS 1: 1-4, 1990.
Robinson J.L., R.G. Popp, R.D. Shanks, A. Oosterhof, J.H. Veerkamp: Testing for
deficiency of uridine monophosphate synthase among Holstein-Frisian cattle of North
America and Europe. Livest. Prod. Sci. 36: 287-298, 1993.
Robinson, J.L., Dombrowski, D.B., Harpestad, G.W. and Shanks, R.D.,1984.
Detection and prevalence of UMP synthase deficiency among dairy cattle. J. Heredity, 75:
277-280.
Rudolph J.A., Spier S.J., Byrns G., Rojas C.V., Bernoco D., Hoffman E.P. (1992)
A sodium channel Phe to Leu mutation in periodic paralysis in Quarter Horses: a common
defect disseminated by selective breeding of a popular sire. Nature Genetics 2, 144-147.
Shan-Rong Shi, Richard J. Cote, Lin Wu, Cheng Liu, Ram Datar, Yan Shi,
Dongxin Liu, Hyoeun Lim, Clive R. Taylor (2002) DNA Extraction from Archival
Formalin-fixed, Paraffin-embedded Tissue Sections based on the Antigen Retrieval
Principle: Heating Under the Influence of pH. The Journal of Histochemistry &
Cytochemistry, Volume 50 (8): 10051011.
Shanks R.D. and J.L. Robinson: Deficiency of uridine monophosphate synthase
among Holstein cattle. Cornell. Vet. 80: 119-122,1990.
Shanks R.D., D.ST.A. Bragg, E.P. Barton: Uridine Monophosphate synthase of
Jersey Bulls. J. Dairy Sci. 72: 722-725, 1989.
Shanks R.D., D.A. Bragg, J.L. Robinson: Deficiency of uridine monophosphate
synthase in Holstein cattle: inheritance and body measurements. J. Anim. Sci. 64: 695-
700,1987.
Shanks R.D., J.L. Robinson: Embryonic mortality attributed to inherited deficiency
of uridine monophosphate synthase. J. Dairy Sci. 72: 3035-3039, 1989.
 Shanks R.D., M.M. Greiner: Relationship between genetic merit of Holstein bulls
and deficiency of uridine 5-monophosphate synthase. J. Dairy Sci. 75: 2023-2029, 1992.
Shanks R.D.: Reproductive consequences of deficiency of uridine monophosphate
synthase in Holstein cattle. Am. J. Vet. Res. 51: 800-802, 1990.
Shin, E.K., Perryman, L.E. and Meek, K. (1997) A kinase-negative mutation of
DNA-PK(CS) in equine SCID results in defective coding and signal joint formation.
Journal of Immunology 158, 3565-3569.
Stryer A. (2003) Biochemistry 5th Ed., Freeman and Comapany, New York.
Taggart, J. B., Hynesp, A., Prodohl, A., Ferguson, A. 1992. A simplified protocol
for routine total DNA isolation from salmonid fishes. J. of Fish Biology 40:963-965.
Shuster D.E., M.E. Kehrli, M.R. Ackermann, R.O. Gilbert: Identification and
prevalence of a genetic defect that causes leucocyte adhesion deficiency in Holstein
cattle. PNAS 80: 225-229, 1992.
Viana J.L., A. Fernandez, A. Iglesias, G. Santamarina: Diagnstico y control de las
principales enfermedades genticas (citrulinemia, DUMPS y BLAD) descritas en ganado
Holstein-Frisn. Med. Vet. 15: 538-544, 1998.
Watson J. D., Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M., Losick R. (2004)
Molecular biology of the gene, 5th Ed., Pearson Education, S.U.A.