TEHNICI ELECTROFORETICE DE VIZUALIZARE A ADN ului

Electroforeza reprezinta una dintre cele mai eficiente metode utilizate in biologia moleculara pentru separarea, identificarea si purificarea fragmentelor de ADN (acid deoxiribonucleic). Probele de ADN sunt plasate intr-o matrita solida (gel de agaroza sau poliacrilamida), cu rol activ de sita moleculara, moleculele migrand prin gel sub influenta unui camp electric extern. In absenta interactiilor externe, macromoleculele de ADN exista intr-o forma relaxata, miscarea lor fiind de tip Brownian. Sub influenta unui camp electric extern, moleculele se vor alinia la directia campului electric si vor migra spre anod printr-o miscare dirijata. Mobilitatea si implicit separarea fragmentelor de ADN depind de o serie de parametrii externi cum ar fi compozitia si concentratia gelului, a tamponului de lucru, temperatura si intensitatea campului electric.

Electroforeza in gel de agaroza

Este cea mai simpla si mai des folosita metoda de a separa si analiza moleculele de ADN. Agaroza este o polizaharida, care topita in prezenta unui tampon (TAE sau TBE) isi ordoneza lanturile proteice, iar in urma racirii amestecului se formeaza un matrix, o retea cu ochiuri prin care moleculele de ADN trec cand sunt impinse de curentul electric. Dimensiunile ochiurilor retelei gelului de agaroza depind de concentratia acesteai in solutia finala, iar aceasta concentratie influenteaza migrarea moleculeleor de ADN.

 APLICATII

ELECTROFOREZA IN GEL DE AGAROZAsi integritatii ADN - Estimarea cantitatii

- Estimarea dimensiunii fragmentelor de AND ( de ex. In urma restrictiei enzimatice pentru cartare) - Analiza produsilor de PCR

PRINCIPIUL METODEI

- Separarea fragmentelor de ADN

- agaroza subst gelatinoasa extrasa din unghii de pasari - dizolvata intr-un tampon si ulterior racita formeaza o retea ale carei ochiuri depind de concentratia solutiei - ADN-ul este incarcat negativ aplicarea unui curent electric il impinge de la catod (-) spre anod (+) - fragmentele de ADN migreaza conform dimensiunii lor: cele mai mici mai repede si cele mai mari mai incet

VIZUALIZARE

- BrEt agent intercalar fluorescent

proba