IZOLARE ADN

ETAPE
Distrugerea initiala a tesutului
- Tampon (Tris) – pentru mentinerea pH-ului
- EDTA – pentru chelatarea cationilor divalenti (Ca2+, Mg2+) – inhibarea
actiunii DN-azelor
- o enzima (K) – distrugere proteine
- detergent (SDS) – solubilizarea proteine membranare si denaturare proteine

Solubilizarea comp. celulare

- fenol/cloroform – separarea proteinelor de ADN

Precipitarea si purificare
- Alcool rece (izopropanol)

Cuantificare AND
- Spectofotometric
- electroforeza in gel de agaroza

TEHNICI DE EXTRACTIE A ADNului

Din probe biologice proaspete

 Din materiale fosile

TEHNICI DE CUANTIFICARE A ADN-ului

Analiza spectrofotometrica
 reprezinta una dintre primele metode de evidentiere cantitativa si calitativa a
materialului genetic in urma extragerii lui dintr-un tesut/proba biologica.
 are la baza proprietatea multor substante, o data excitate cu o sursa de radiatii
electromagnetice (UV, lumina etc), sa absoarba la anumite valori, dependent
de complexitatea si structura lor anatomica.
 se poate estima cantitatea de material genetic dintr-o proba, gradul de
contaminare al acesteia cu proteine, oligozaharide, lipide si ARN, precum si
cantitatea aproximativa a acestora.

Analiza “slot – blot”

 este specifica pentru ADN-ul uman si al altor primate datorita unei probe de
40 pb care este complementara cu secventa unui satelit alfa – specific
primatelor, D17Z1, localizat pe cromozomul 17

Late metode de cuantificare

 Metoda “Pico Green”
 Amplificarea unui singur STR
 TEHNICI ELECTROFORETICE DE VIZUALIZARE A ADN – ului

• Electroforeza reprezinta una dintre cele mai eficiente metode utilizate in

biologia moleculara pentru separarea, identificarea si purificarea fragmentelor
de ADN (acid deoxiribonucleic).
• Probele de ADN sunt plasate intr-o matrita solida (gel de agaroza sau
poliacrilamida), cu rol activ de sita moleculara, moleculele migrand prin gel
sub influenta unui camp electric extern.
• In absenta interactiilor externe, macromoleculele de ADN exista intr-o forma
relaxata, miscarea lor fiind de tip Brownian. Sub influenta unui camp electric
extern, moleculele se vor alinia la directia campului electric si vor migra spre
anod printr-o miscare dirijata.
• Mobilitatea si implicit separarea fragmentelor de ADN depind de o serie de
parametrii externi cum ar fi compozitia si concentratia gelului, a tamponului
de lucru, temperatura si intensitatea campului electric.

Electroforeza in gel de agaroza

Este cea mai simpla si mai des folosita metoda de a separa si analiza
moleculele de ADN.
Agaroza este o polizaharida, care topita in prezenta unui tampon (TAE sau
TBE) isi ordoneza lanturile proteice, iar in urma racirii amestecului se
formeaza un matrix, o retea cu ochiuri prin care moleculele de ADN trec cand
sunt impinse de curentul electric.
Dimensiunile ochiurilor retelei gelului de agaroza depind de concentratia
acesteai in solutia finala, iar aceasta concentratie influenteaza migrarea
moleculeleor de ADN.
 ELECTROFOREZA IN GEL DE AGAROZA

• APLICATII
Estimarea cantitatii si integritatii ADN
- Estimarea dimensiunii fragmentelor de AND ( de ex. In urma restrictiei
enzimatice pentru cartare)
- Analiza produsilor de PCR

• PRINCIPIUL METODEI
- Separarea fragmentelor de ADN inainte de alte analiza ( southern sau
northen blotting)
- agaroza – subst gelatinoasa extrasa din unghii de pasari
- dizolvata intr-un tampon si ulterior racita formeaza o retea ale carei ochiuri
depind de concentratia solutiei
- ADN-ul este incarcat negativ – aplicarea unui curent electric il impinge de la
catod (-) spre anod (+)
- fragmentele de ADN migreaza conform dimensiunii lor: cele mai mici mai
repede si cele mai mari mai incet

• VIZUALIZARE
- BrEt – agent intercalar fluorescent