Detectia microorganismelor patogene prin Metoda PCR

Identificarea microrganismelor patogene prin analiza secventelor genice conservate

metoda PCR: principiu, procedura standard de operare, metoda de laborator, avantaje, limitari

PCR = Polymerase Chain Reaction

Reactia de polimerizare in lant a Acidului Dezoxiribonucleic (ADN) Este o tehnica prin care se genereaza multiple copii identice, pornind de la (ipotetic) 1 singura molecula de ADN - template. Mai multe molecule sunt mai usor de detectat / analizat si de prelucrat ulterior (transfer pe membrana, hibridizare, secventiere etc) Copiaza in vitro procesul biologic de Replicare a ADN

Reacia PCR a fost

descoperit n 1983 de ctre Kary B.Mullis i dupa 1988 a cunoscut o dezvoltare exploziv i o rafinare extraordinar, fiind reacie care a revoluionat Biologia Molecular a Acizilor Nucleici.

Dezvoltarea tehnicii are la baz

descoperirea Taq-Polimerazei, enzimacheie a reaciei, o polimeraz stabil la temperaturi nalte (~ 94C), la care molecula de ADN, n mod normal dublu catenare, disociaz i astfel fiecare caten poate fi copiat.

Principiul tehnicii PCR

Moleculele de ADN se separa ...

Polimeraza + primeri+ amestec de dNTP-uri (monomerii)+ MgCl2

n prezena enzimei Taq-

Fiecare caten se las copiat, dnd natere unei catenesurori, complet nou i identic

La rindul lor, noile catene se vor separa i vor servi drept matrie
Astfel,din 1 molecula iniial dubl catenar 2 molecule dublu catenare 4 molecule... Dup 32 de cicluri: > 1 milion de catene identice.

Denaturarea moleculei de ADNmatrita

ADN-ul este o macromolecula polimeric, alctuit din 2 catene complementare ,antiparalele.

La 94C, cele 2 catene se separ denaturarea

Alinierea primerilor

Primerii = oligonucleotide, complementare cu capetele fragmentului de amplificat; folosite ca amorsa pentru polimerizarea dNTP-urilor

Taq -polymeraza recunoaste

capatul primer-ului atast la catena-matrita si incepe elongarea lui

Nucleotidele se asaza pe baza de complementaritate la matrita si vor fi legate intre ele de catre Taq- polimeraza

...Denaturare

/ aliniere / elongare repetate in cateva zeci de cicluri succesive ...

Detectarea / recunoasterea ampliconilor

-Ulterior, ampliconii (fragmentele ADN obtinute) se detecteaza prin electroforeza in gel de agaroza

-avand aceeasi dimensiune, toate moleculele vor avea acceasi mobilitate electroforetica si vor genera benzi la aceeasi distanta;

-greutatea moleculara a ampliconilor se poate afla prin compararea cu un marker de greutate care migreaza in paralel.

Real-Time PCR Reactia de polimerizare in lant a ADN, monitorizata in timp real

In PCR-ul in timp real (Real-Time PCR), produsul de amplificare este detectat prin

intermediul colorantilor fluorescenti (probe).

In chimia reactiei sunt incluse diferite tipuri de sonde oligonucleotidice care, intr-o anumita etapa a amplificarii, se prind specific fie de produsul amplificarii, fie de fragmentultinta ce urmeaza a fi copiat.

FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer; fenomenulfenomenul are loc numai cand fluorescent fluorescent-ul si quencer quencer-ul sunt apropiatiapropiati

Fluorescenta emisa se cumuleaza si creste in intensitate pe masura ce cantitatea de ampliconi creste

Monitorizarea intensitatii fluorescentei chiar in timpul reactiei PCR permite detectia si cuantificarea produsului acumulat, fara a fi nevoie de a mai deschide tuburile dupa terminarea reactiei.

Asadar, un instrument de Real-Time PCR este in acelasi timp si un analizor in sine (spre deosebire, un PCR simplu realizeaza doar etapa de amplificare, urmand ca analiza si detectia produsilor sa fie facuta intr-o etapa post PCR)

Aplicatii ale tehnicii Real Real-Time PCR

Detectia calitativa (prezent / absent) si cantitativa (cuantificare absoluta) a unor agenti infectiosi (microorganisme si virusuri)

Caracterizarea unei gene de interes intr-un genom (nivel de expresie) = cuantificare relativa
Confirmarea unor maladii metabolice de supra- sau sub-exprimare a unei gene ( fata de un nivel normal)

Efectele unui tratament-pilot asupra exprimarii unei gene-tinta (fata de o gena house-keeping - al carei nivel de transcriere nu se modifica in urma tratamentului)
Discriminarea alelelor

Detectia SNP-urilor (Single Nucleotide Polymorphism

Etapele analizei calitative prin Real-Time PCR

Precultivarea esantionului de proba (5-10 h) - optional dar recomandabil, in functie de natura probei

Extractia ADN
Verificarea calitatii ADN-ului extras Reactia PCR Rezultat:prezent/ absent

Etapele analizei cantitative prin Real-Time PCR

Extractia ADN Verificarea calitatii ADN-ului extras (spectrofotometric si / sau electroforetic) Reactia PCR Rezultat:Nr. Copii/ g (ml)

Analiza foloseste strategia Absolute quantification: cu ajutorul unei curbe standard se genereaza un rezultat = o valoare absoluta

Avantajele Detectiei microorganismelor prin PCR:

Materialul genetic (ADN-ul) este componenta celulara cea mai stabila (nu se modifica cu starea fiziologica, mediul de cultura sau varsta celulei) si definitorie pentru caracterul de speciespecie. Secventa codificata in ADN sta la bazabaza tuturor reactiilor metabolice si a celorlalte trasaturi fenotipice (caractere de cultura, forma si aranjamentul celulelor dupa diviziune etc) care se constituie in criteriicriterii taxonomice si au condus la cheile de identificare actuale.

De aceea, verificarea prezentei unei anumite secvente de ADN tipica pentru o specie/tulpina de microorganism este dovada cea mai obiectiva a prezentei lui, metoda detectand practic baza fizica (biologica) a criteriilor taxonomice.
Detectarea prezentei unui fragment tipic urmarit constituie dovada inechivoca a prezentei acelui microorganism.

Tehnica este inalt sensibila putand detecta (intr-o reactie optimizata) chiar 1 singura molecula de ADN int

Detecteaza si formele viabile dar necultivabile precum si celulele moarte dar intacte (Poate surprinde aplicarea unui tratament de decontaminare a unui material care a fost initial infectat cu microorganismul respectiv conditii de igien)
este foarte specifica (nu lasa loc de interpretari subiective), cu conditia ca primerii sa fie proprii doar unor anumite specii sau grupuri de microorganisme

tehnica este rapida, evitand timpii mari de incubare