2.

TEHNICI DE ANALIZA A ACIZILOR NUCLEICI

Analiza relaţiei fundamentale dintre genotip şi fenotip s-a bazat multă vreme pe analiza fenotipică, deci pe
studiul manifestărilor genei sau explorarea produselor sale de expresie. Recent a devenit posibilă analiza
genotipică prin explorarea directă a ADN. Deşi prezintă numeroase dificultăţi, analiza genotipică are o
valoare teoretică şi practică deosebită.

În planul cercetărilor fundamentale analiza genotipică permite:

•  studiul structurii genei;

•  stabilirea hărţii complete a genomului uman; elucidarea mecanismelor de expresie genică şi în
special a modalităţilor de reglaj, cheia unor procese biologice fundamentale: diferenţierea celulară,
morfogeneza, senescenţa, funcţia sistemului nervos sau a sistemului imun.

În medicina practică analiza genotipică este folosită pentru:

•  studiul patologiei moleculare produsă de mutaţiile ADN, indiferent dacă este vorba de o patologie
ereditară (boli genetice) sau somatică (cancere);
•  diagnosticul genotipic prenatal sau presimptomatic al unor boli chiar şi atunci când gena şi
efectele ei nu sunt cunoscute sau nu sunt evidente;
•  recunoaşterea unei infecţii virale latente.

Pentru a identifica şi studia o genă dintr-o colecţie (bibliotecă/bancă) de fragmente de ADN clonate sau
pentru a pune diagnosticul molecular al unei boli la o anumită persoană este necesară o sondă genotipică
adecvată care să permită fie recunoaşterea directă a genei fie a unor markeri genotipici (secvenţe necodante)
situaţi în vecinătatea genei. Această recunoaştere se bazează pe principiul hibridizării moleculare a acizilor
nucleici.

CLONAREA ACELULARA A ADN ( METODA PCR )

În anul 1985, în analiza genotipică s-a produs o nouă mini-revoluţie metodologică prin introducerea
tehnicii "polymerase chain reaction" (PCR). Cu această metodă se poate amplifica selectiv o secvenţă scurtă
de ADN sau ARN, a cărei structură nucleotidică este parţial cunoscută. Amplificarea este considerabilă (de
miliarde de ori) şi rapidă (în câteva ore), permiţând obţinerea unei cantităţi suficiente de material genetic
necesar pentru analiză.

Amplificarea selectivă in vitro a unui fragment de ADN cu secvenţă cunoscută se realizează pe baza prin-
cipiului extensiei unei amorse ("primer sau amplimer"). Tehnica foloseşte două oligonucleotide de sinteză
care reproduc o secvenţă de 15-25 nucleotide situate la capătul 3' a celor două catene ale segmentului de
ADN; ele sunt numite amorse deoarece declanşează sinteza ADN, după "matriţa" fragmentului ADN iniţial
(de amplificat); reacţia necesită, evident, prezenţa ADN-polimerazei.

Într-un prim timp, segmentul de ADN ce trebuie amplificat este denaturat termic (la 95oC), obţinându-se
un amestec de fragmente monocatenare. Apoi, în al doilea timp, se produce (la 50- 60oC) poziţionarea şi
hibridarea amorselor la secvenţele complementare (situate în poziţia 3') de pe fiecare catenă.

După aceea, în a treia etapă are loc polimerizarea nucleotidelor sub acţiunea unei ADN-polimeraze ter-
mostabilă(la 72oC) şi fiecare amorsă este alungită (extinsă) în sensul 5' → 3', formându-se o secvenţă com-
plementară catenei copiate (matriţă). La fiecare circa 3-10 minute rezultă o nouă dublare a secvenţei iniţiale
de ADN.

PCR este o reacţie în lanţ deoarece catenele de ADN nou sintetizate vor acţiona ca matriţe pentru sinteza
ADN în ciclurile următoare de denaturare termică, hibridizare amorselor şi polimerizare (extensia amorselor
sau sinteza enzimatică ADN); se produce astfel o amplificare exponenţială a cantităţii de ADN: după N
cicluri se obţin teoretic 2N exemplare din segmentul iniţial de ADN.

După 30 de cicluri, fără să fie necesară adăugarea de amorse sau enzimă proaspătă, acest segment este
amplificat de circa un miliard de ori. Prin această "clonare acelulară" plecând de la o cantitate infimă de
ADN (chiar de la o singură celulă) se poate obţine, prin PCR, o cantitate suficientă de ADN-ţintă, care poate
fi vizualizată prin fluorescenţă în UV (după colorare cu bromură de etidium) şi /sau analizată direct.

Avantajele clonării acelulare a ADN prin PCR sunt determinate în primul rând de simplitatea sa (nu
necesită nici o altă manipulare, în afara variaţiilor termice necesare diferitelor etape ale reacţiei, şi deaceea
se pretează la automatizare, folosind un termociclor); în al doilea rând, PCR este o metodă rapidă, sensibilă,
eficace şi ieftină.

Dezavantajele majore ale PCR sunt:

- necesitatea unor informaţii prealabile despre secvenţa capetelor terminale ale ADN ţintă (pentru a
fabrica oligonucleotide specifice),
- mărimea mică (0.1-5 kb în tehnicile uzuale de PCR) şi
- cantitea limitată de produs,
- precum şi infidelitatea replicării ADN (frecvenţa relativ crescută a erorilor de împerechere, care
depinde de precizia ADN-polimerazei şi de existenţa sau nu a capacităţii de corecţie a erorilor)

Metoda PCR a fost aplicată cu succes la studiul diverselor tipuri de secvenţe de ADN:

- genomic,
- mitocondrial,
- exogen (în special viral),
- precum şi la molecule de ARNm, după ce în prealabil s-a obţinut cu ajutorul transcriptazei inverse o
moleculă de ADN complementar unui mesager (RT-PCR sau reverse transcripase PCR).

Tehnica PCR a revoluţionat atât analiza genetică, cât şi diagnosticul molecular al bolilor genetice, prin
detecţia directă a mutaţiilor sau diagnosticul indirect prin polimorfismul RFLP sau al markerilor
minisatelitici. In acest scop s-au elaborat numeroase variante ale PCR.

HIBRIDIZAREA MOLECULARA A ACIZILOR NUCLEICI

Hibridizarea moleculară se bazează pe capacitatea unor molecule monocatenare de acid nucleic de a

forma, pe bază de complementaritate, molecule bicatenare. Tehnicile standard folosesc o sondă monocate-
nară de acid nucleic (cu o structură cunoscută), pentru a identifica o secvenţă similară într-un amestec com-
plex şi heterogen de molecule de acid nucleic “ţintă” (de obicei imobilizat pe un suport solid).

Dacă ţinta este o moleculă de ADN dublu-catenară atunci catenele trebuie mai întâi separate (prin
încălzire sau tratament alcalin). În condiţii adecvate, sonda genotipică se fixează specific şi stabil pe
secvenţa sa complementară din ţintă. Pentru a identifica şi izola hibridul molecular sonda este marcată cu un
trasor radioactiv sau cu un compus fluorescent. Aceasta va permite detectarea secvenţei / genei ce posedă o
secvenţă ADN omologă sondei folosite.

Fenomenul este de o specificitate extraordinară pentru că o sondă este capabilă să recunoască o secvenţă
unică printre milioane de alte secvenţe.

Mai recent s-a introdus şi se foloseşte mai frecvent hibridizarea inversă care se deosebeşte de hibridizarea
standard a acizilor nucleici prin faptul că sonda nemarcată este fixată pe un suport solid iar acidul nucleic
"ţintă" este marcat şi se află într-o soluţie apoasă.
 a). Analiza ADN genomic uman prin metoda de transfer Southern

Obiectivul principal al metodei – cunoscută sub numele de Southern blot - este de a evidenţia, cu
ajutorul unei sonde specifice prezenţa sau absenţa unui fragment de ADN omolog (“ţintă”), obţinut din ADN
genomic, cu o anumită enzimă de restricţie.

Pentru aceasta, ADN extras din nucleii celulari este digerat cu una sau mai multe enzime de restricţie,
fragmentele sunt separate după mărime prin electroforeză în gel de agaroză, denaturate şi apoi transferate
(prin “sugere”/blotting) şi imobilizate pe o membrană solidă de nitroceluloză, pentru a fi hibridizate cu o
sondă monocatenară specifică, marcată radioactiv. Sonda se va fixa numai pe secvenţa omologă de ADN
(dacă este prezentă) iar poziţia ei pe membrană va permite evaluarea mărimii sale.

Metoda Southern comportă următoarele etape :

▫ extragerea ADN genomic dintr-o sursă accesibilă: limfocite din sângele periferic, celule din culturi de
fibroblaste, celule amniotice sau din vilozităţi coriale (pentru diagnosticul prenatal), celule obţinute prin
biopsii de organe;

▫ fragmentarea ADN genomic, prin clivare cu o enzimă de restricţie adecvată (sau un amestec de două
enzime), pentru a obţine circa un milion de fragmente mai mici de 20kb; aceasta presupune cunoaşterea
prealabilă a hărţii situsurilor de restricţie pentru domeniul genomic explorat şi alegerea celui mai adecvat
cuplu enzimă de restricţie - sondă.

▫ separarea fragmentelor, pe baza mărimii lor prin electroforeză în gel de agaroză, în care fragmentele mai
mici migrează mai repede decât cele mai mari; pentru separarea fragmentelor mai mari de ADN (40 kb →2-
3 Mb) se foloseşte electroforeza în câmp pulsatil;

▫ denaturarea (în mediu alcalin) fragmentelor bicatenare, pentru separarea celor două monocatene
complementare;

▫ transferarea moleculelor de ADN monocatenar de pe gelul de agaroză fragil pe un suport solid (filtru din
nitroceluloză sau nailon), prin capilaritate sau sugere ("blotting"); de aici derivă numele metodei "Southern
blot" sau "Southern transfer"; fragmentele monocatenare de ADN vor fi imobilizate pe membrană în poziţia
în care s-au găsit, după migrare, în gel;

▫ hibridizarea fragmentelor ADN de pe filtru cu o sondă monocatenară specifică unei gene sau a unui
marker genotipic, marcată radioactiv; sonda se va împerechea / asocia numai cu secvenţa complementară
dintr-unul sau două fragmente de ADN genomic;

▫ spălarea: hetroduplexul format de fragmentul de ADN şi sondă este puternic fixat pe filtru şi deci rezistent
la o spălare intensă (care îndepărtează fragmentele nehibridate de pe filtru);

▫ punerea în evidenţă a duplexului, printr-un semnal persistent, după contactul filtrului cu un film foto
(autoradiografie), care relevă poziţia şi mărimea fragmentului.

Rezultatele obţinute prin metoda Southern se compară cu profilul normal al domeniului genomic
explorat de sondă şi astfel se pot evidenţia două tipuri de mutaţii:

- deleţii sau
- inserţii genice de mai mult de 50-100 pb, detectate prin modificarea lungimii fragmentelor realizate
de enzima de restricţie; dacă deleţia este totală atunci gena dispare şi sonda nu dă nici un semnal;
 - mutaţii punctiforme, ce afectează o singură bază şi creează sau distrug un situs de restricţie intragenic
pentru o anumită enzimă, antrenând o modificare a lungimii fragmentelor de restricţie.

Cu toate că rezultatele obţinute prin metoda Southern par reduse ca informaţie (semnal prezent sau
absent; situs prezent sau absent) analiza genotipică realizată cu această tehnică are o valoare practică,
deoarece permite diagnosticul prenatal sau presimptomatic al unor mutaţii genice morbide, precum şi
identificarea heterozigoţilor.

Metoda Southern nu permite evidenţierea unor modificări mici din structura ADN (microdeleţii, mutaţii
punctiforme ale unei pb). În aceste cazuri, sonda de ADN nu va putea face distincţie între gena normală şi
gena cu alterări minime ale secvenţei nucleotidice. Trebuie să subliniem că metoda Southern are şi alte
inconveniente:

- este laborioasă,

- complexă,

- costisitoare şi

- prezintă numeroase dificultăţi de interpretare.

b). Analiza cu sonde oligonucleotidice specifice unei alele (ASO).

În această metodă, o soluţie apoasă de ADN genomic nefracţionat este depusă sub forma unor pete direct
pe o membrană de nitroceluloză (dot-blot) sau indirect printr-o fantă (slot-dot); picătura este uscată şi ADN
imobilizat pe membrană este denaturat (prin tratarea filtrului cu o soluţie de alcali) şi expus la o soluţie ce
conţine sonda monocatenară marcată; aceasta se va hibridiza, formîndu-se un heteroduplex ţintă-sondă ce va
fi pus în evidenţă autoradiografic.

Această metodă, mai simplă şi mai rapidă decat Southern blot (nu necesită fracţionarea ADN), foloseşte
deobicei sonde ce corespund unei secvenţe mici (20 pb) din structura genei, numite şi sonde oligonucleo-
tidice specifice (ASO de la "Alelele Specific Oligonucleotides") sau pe scurt, oligonucleotide. Aceste sonde
scurte sunt mult mai "sensibile" la alterările minime ale secvenţei genice, putând depista modificări ale unei
singure perechi de baze.

De aceea, ele sunt folosite pentru depistarea unor mutaţii specifice, cunoscute deja într-o anumită boală
genetică. Cu alte cuvinte, se poate stabili dacă acea mutaţie este prezentă sau absentă într-o probă de ADN
obţinut de la un pacient oarecare. Sensibilitatea sondelor ASO este evident superioară metodei Southern,
care nu poate depista leziunile minime ale ADN.

Trebuie totuşi să subliniem că lipsa de hibridizare între versiunea ASO mutantă şi ADN pacientului nu
înseamnă automat că aceasta este normal: el poate avea o altă mutaţie în genă, în altă regiune decât cea
explorată printr-o anumită sondă ASO.

Analiza ASO este utilă numai în cazurile în care există o mare probabilitate (bazată pe alte date) ca o
familie sau un individ să posede o mutaţie cunoscută. Deci, tehnica se aplică în special pentru boli genetice
caracterizate printr-un număr mic de mutaţii, precis definite (de ex. hemocromatoza, drepanocitoza).

c). Analiza ARN m prin Northern blot.

Northern blot este o variantă a metodei Southern blot în care acidul nucleic ţintă este ARNm . Obiectivul
principal al metodei este obţinerea de informaţii privind profilurile de expresie (tipul celular, abundenţa
transcriptului) unei anumite gene (deja clonată).

Punerea în evidenţă a unui anumit ARN mesager se bazează pe hibridarea moleculară a ARN cu o sondă
complementară monocatenară (ADN c denaturat; oligonucleotide ADN antisens).

Moleculele de ARNm, de diferite lungimi (în funcţie de gena transcrisă), extrase din diferite ţesuturi, sunt
separate prin electroforeză în gel de agaroză denaturant (care suprimă structura secundară ce ar jena
migrarea şi hibridizarea).

Apoi ele sunt transferate pe un filtru de nitroceluloză şi hibridate cu o sondă de ADN marcată. Pe
autoradiogramă se observă una sau mai multe benzi a căror talie, număr şi intensitate sunt indicaţii preţioase.
Absenţa unei benzi ce ar fi trebuit evidenţiată de sondă ne indică faptul că gena nu este exprimată /
transcrisă datorită unei mutaţii. Existenţa unei mutaţii (de ex., deleţie) poate fi revelată printr-un fragment de
ARN m cu talie anormală.

Analiza ARN mesager este mult mai delicată şi mai dificilă decât cea a ADN deoarece:

- ARN este foarte vulnerabil la ARN-azele citoplasmatice;

- numeroase tipuri au o expresie celulară variabilă în funcţie de diferenţierea celulară (de ex. ARN m pentru
fenilalanin-hidroxilază nu este prezent decât în hepatocite, iar cel pentru tiroglobulină numai în celulele
tiroidiene);

- ARNm se găseşte în cantităţi foarte mici.

d). Hibridizarea in situ a ADN.

Analiza ADN se poate face şi prin hibridizarea in situ pe preparate cromosomice în pro- metafază
folosind sonde marcate (radioactiv sau cu molecule fluorescente - FISH) judicios alese, în funcţie de
obiectivul urmărit .

Dacă se bănuieşte o microdeleţie pentru o anumită regiune cromosomică, la limita vizibilităţii microscopice
se utilizează o sondă marcată corespunzătoare genelor din regiunea respectivă; absenţa semnalului
corespunzător sondei traduce deleţia regiunii.

Dacă se urmăreşte localizarea unei gene se foloseşte o sondă tip ADNc pentru o genă analogă identificată
deja la un animal de laborator. Hibridizarea in situ se foloseşte şi pentru evidenţierea ARN în secţiuni
histologice folosind deobicei o sondă de ARN, marcată (“ribosondă”), complementară unui ARNm.

e). Identificarea ADN al organismelor exogene

Orice infecţie sau infestare printr-un microorganism bacterian, viral, fungic sau parazitar poate fi detectată
într-un eşantion biologic prin hibridizare moleculară, dacă există sonde corespunzătoare genomului acestui
organism.

Hibridizarea moleculară oferă multiple avantaje faţă de metodele clasice:

- simplitate,
- rapiditate şi
- specificitate (perspective de automatizare);
- posibilitatea de a detecta agenţi infecţioşi dificil sau imposibil de cultivat in vitro;
- posibilitatea de depistare directă a unui agent patogen într-un amestec polimicrobian (în mijlocul
unei flore comensale) şi pe orice tip de eşantion patologic.

În practică metodele de hibridizare moleculară au găsit deja importante aplicaţii pentru caracterizarea
rapidă a germenilor cu creştere lentă (mycobacterii, treponeme, Brucella etc.), pentru identificarea virusului
hepatitei B, virusului papiloma (HPV) şi în special în cazurile de SIDA (HIV).
ANALIZA SECVENTEI NUCLEOTIDELOR DIN ADN ( SECVENTIALIZAREA ADN )

După izolarea şi amplificarea unui fragment de ADN (genă), etapa principală de analiză genotipică este
determinarea secvenţei nucleotidice, deci a informaţiei genetice a fragmentului respectiv.

Această acţiune este decisivă pentru a stabili structura genei precum şi secvenţa de aminoacizi a proteinei
codificată de genă (în cazul în care ea nu a fost identificată). De asemenea se poate determina tipul de mu-
taţie care a produs o boală genetică. Stabilirea secvenţei nucleotidice este utilă şi pentru sinteza oli-
gosondelor specifice pentru o alelă (ASO) şi a amorselor folosite în PCR, ambele fiind larg utilizate în diag-
nosticul molecular. Metoda cea mai folosită în prezent este metoda enzimatică a lui Sanger .

Metoda enzimatica (Sanger)

(1). Principiu.
Se sintetizează o catenă de ADN complementară fragmentului cu secvenţă necunoscută, utilizând ADN-
polimerază şi o amorsă radiomarcată (fixată la extremitatea 3' a fragmentului). Reacţia poate fi inhibată
(stopată) în dreptul unui anumit nucleotid, prin folosirea unor analogi nucleotidici de tipul
dideoxinucleotidelor (care au pierdut gruparea 3'-OH).

ADN polimeraza poate adăuga un astfel de nucleotid, dar după ce acesta a fost încorporat, reacţia se
opreşte datorită absenţei grupării 3'-0H din dideoxinucleotid, necesară polimerizării. Se realizează astfel
fragmente cu o lungime egală distanţei dintre amorsă şi locul unde s-a incorporat un anumit
dideoxinucleotid.

(2). Descrierea metodei:

Molecula de ADN ce trebuie secvenţializată este separată în cele două catene. Fiecare catenă este clonată
într-un vector monocatenar (fagul M 13), fiind inserată (cu capătul 3’) într-un anumit situs, după o secvenţă
(primer) cunoscută şi marcată radioactiv sau fluorescent, ce are rolul de amorsă.

Aceste monocatene de ADN servesc ca matriţă pentru sinteza unei catene noi, complementare, folosind
ADN polimeraza şi nucleotidele necesare sintezei. Reacţia se desfăşoară concomitent în patru eprubete, în
fiecare se va stabili localizarea unui anumit nucleotid folosind ca analog inhibitor, un anumit
dideoxiribonucleotid.

De ex. în eprubeta ce va stabili localizarea G se va adauga ddGTP; atunci când dideoxiribonucleotidul
respectiv este încorporat în catena în curs de formare, sinteza se opreşte. Când polimeraza întâlneşte
următorul nucleotid C fenomenul se repetă şi rezultă un fragment cu 4 nucleotide şi respectiv 9 nucleotide.

Apoi proba este analizată prin electroforeză în gel; se observă o serie de benzi la poziţii ce corespund
localizării fiecărui nucleotid cu G. Reactii similare pentru nucleotidele cu A, T şi C vor furniza serii
corespunzătoare de fragmente (fiecare probă într-un anumit "canal" al gelului de poliacrilamidă). Ansamblul
celor patru reacţii poate fi atunci citit pe o “scară” poziţională direcţionată de la fragmentele cele mai mici la
cele mai mari; astfel se poate determina secvenţa de nucleotide a fragmentului analizat.

Metoda de sinteză enzimatică descrisă de Sanger este din ce în ce mai mult folosită fiind perfecţionată
continuu. Folosind ca vectori, pentru secvenţa de determinat, plasmide de generaţia III-a se pot secvenţia
molecule de ADN bicatenar.

Marcajul radioactiv a fost înlocuit cu marcajul prin fluorocromi specifici fiecărui nucleotid.
Informatizarea a deschis drumul automatizării şi sunt deja folosite primele secvenţiatoare automate.
Determinarea scevenţei unui acid nucleic nu mai pune probleme şi este extrem de rapidă. În aceste condiţii a
fost posibilă determinarea secvenţei cvasi- integrale a genomului uman (alcătuit din circa 3 miliarde pb).