UNIVERSITATEA BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE
MASTER BIOCHIMIE CLINICĂ APLICATĂ

Tehnici de secventiere masiv paralele in

criminalistica

Ianuarie 2022

1
 CUPRINS

Capitolul I -MPS –importanta utilizarii acesteti tehnici in criminalistica………………….3

Capitolul II - Tehnici de secventiere MPS si metode utilizate in

criminalistica……………………………………………………………………………………..4

2.1. Secventierea de prima generatie- Secventierea Sanger……………………………………..4

2.2 Secventierea de a doua generatie (Next Generation Sequencing)………………………….. .5
2.2.1. Tehnica 454/Roche…………………………………………………………………………5
2.2.2. Illumina/Solexa……………………………………………………………………………..5
2.2.3. Secventierea prin ligare- SOLiD(Sequencing by Oligo Ligation Detection)………….…..6
2.2.4. Ion Torrent……………………………………………………………………………….…6
2.3. Secvențierea a treia generație………………………………………………………………6

Capitolul III- Markeri utilizati in criminalistica……………………………………………...7

Capitolul IV- Concluzii………………………………………………………………………...10

Bibliografie……………………………………………………………………………………. .11

CAPITOLUL I

2
 Secventierea masiva paralela - Importanta utilizarii acestei tehnici in
criminalistica

Perspectiva analizei simultane a unui număr mare de markeri polimorfi face din
tehnologia de secvențiere masivă paralelă (MPS) un instrument foarte puternic și relativ ușor de
utilizat în laboratoarele criminalistice.
Utilizarea MPS în criminalistică va face posibilă analiza simultană a markerilor ADN
autozomal standard (STR și SNP), ADN-ului mitocondrial și markerilor de cromozomi sexuali
(X si Y).
În primul rând, tehnologiile MPS vor fi critice pentru analiza ADN-ului uman în cazuri
precum dezastrele în masă sau alte evenimente în care probele de ADN criminalistice sunt in
cantitate foarte mica și ADN-ul poate fi degradat.
Noi oportunități în domeniul cercetării studiilor criminalistice apar prin valorificarea
puterii tehnologiei NGS, care poate fi aplicată la analiza simultană a mai multor loci de interes
criminalistic în diferite contexte genetice, cum ar fi autozomi, cromozomi mitocondriali și
sexuali.
În plus, tehnologia NGS poate avea și aplicații potențiale în multe alte aspecte ale
cercetării. Acestea includ construirea bazei de date ADN, inferența ascendentă și fenotipică,
studii pe gemeni monozigoți, identificarea fluidelor corporale și a speciilor și analize medico-
legale pe animale, plante și microbiologice. Aici trecem în revistă aplicarea tehnologiei NGS în
domeniul științei criminalistice cu scopul de a oferi o referință pentru studiile și practicile
criminalistice viitoare.

Capitolul II

3
 Tehnici de secventiere si metode utilizate in criminalistica

2.1. Secventierea de prima generatie- Secventierea Sanger

Secvențierea Sanger a fost dezvoltată în 1977 de Frederick Sanger, care a primit Premiul
Nobel pentru Chimie în 1980 (Bruijins 2018). Este o metoda enzimatica. Se sintetizează o catenă
de ADN complementară fragmentului cu secvenţă necunoscută, utilizând ADN-polimerază şi o
amorsă radiomarcată (fixată la extremitatea 3' a fragmentului). Reacţia poate fi oprita în dreptul
unui anumit nucleotid, prin folosirea unor analogi nucleotidici de tipul dideoxinucleotidelor (care
au pierdut gruparea 3'-OH). ADN polimeraza poate adăuga un astfel de nucleotid, dar după ce
acesta a fost încorporat, reacţia se opreşte datorită absenţei grupării 3'-0H din dideoxinucleotid,
necesară polimerizării. Se realizează astfel fragmente cu o lungime egală distanţei dintre amorsă
şi locul unde s-a incorporat un anumit dideoxinucleotid.
Secventierea Sanger produce mai multe citiri si mai lungi decat majoritatea tehnicilor de
a doua generatie, care produce citiri scurte. Secvențierea Sanger este încă utilizată datorită
rezultatelor sale foarte precise. Această metodă, care este acum cunoscută drept secvențiere de
prima generație, este destul de similară cu PCR.
Secvențierea Sanger este o tehnică importantă care ajută în multe domenii ale biologiei
moleculare. Proiectul genomului uman a fost finalizat cu succes cu ajutorul metodelor bazate pe
secvențierea lui Sanger. Secvențierea lui Sanger este, de asemenea, utilă în secvențierea țintă a
ADN-ului, cercetarea cancerului și a bolilor genetice, analiza expresiei genice, identificarea
umană.

2.2 Secventierea de a doua generatie (Next Generation Sequencing)

Metoda mai rapida si mai ieftina. Are capacitatea de a studia simultan mai multe regiuni
de interes. Secventierea se poate realiza pornind de la o cantitate foarte mica de AND (-10µg).
Au fost dezvoltate noi metode de secventiere: pirosecventierea si secventierea cu
“terminator reversibil”.
 Pirosecventierea presupune sinteza AND pornind de la o matrita, adaugand o singura
nucleotide la un moment dat, fiecare generand un puls de lumina.
 Secventa cu “terminator reversibil” presupune ca nucleotidele terminale, marcate
fluorescent sunt adaugate la secventa si detectate. Nucleotidul terminal este inlaturat,

4
 secventa extinsa si urmatorul nucleotid este detectat.

2.2.1. Tehnica 454/Roche

Tehnologia pe care se bazează tehnica de secvențiere 454 a fost brevetată în 1989 de
Melamede si este prima tehnică NGS pe piață care se bazează pe pirosecvențiere.
Componentele reacției sunt fragmentele de ADN, tamponul de reacție și patru enzime:
ADN-polimeraza care încorporează nucleotidele, ATP-sulfurilaza care convertește PPi-
pirofosfatul în ATP în prezența adenozin-5-fosfosulfat, luciferaza care oxidează luciferina în
prezența ATP și generează lumină și apiraza care degradează nucleotidele neincorporate și
excesul de ATP. La final se generează cromatograme pentru fiecare secvență citită, ce arată
intensitatea semnalului luminos pentru fiecare adăugare de nucleotid. Un dezavantaj este că
pregătirea bibliotecii este necesară înainte ca secvențierea să poată avea loc.

2.2.2. Illumina/Solexa
Secvențializarea Illumina este o metodă de secvențiere de generație următoare, care este,
de asemenea, numită metoda „ secvențiere-prin-sinteză ”(SBS).
Secvențializarea este implicată în procesarea a milioane de fragmente în paralel.
Cele patru etape de bază implicate în fluxul de lucru de secvențiere Illumina sunt:
pregătirea bibliotecii, generarea clusterului, secvențiere și analiza datelor.
Aceasta metoda asigura precizie, e o tehnica care se face automat, are acuratete mare, da
secvente curate.
Dezavantajul este timpul lung de rulare.

2.2.3. Secventierea prin ligare- SOLiD(Sequencing by Oligo Ligation Detection)

Tehnica presupune ca o secvență sondă este legată de un fluorofor care hibridizează la
un fragment de ADN și este legat la o oligonucleotidă adiacentă pentru imagistică . Această
metodă foloseste em-PCR cu bile magnetice mici de 1 μm .Tehnica folosește oligonucleotide de
opt nucleotide prezente în toate variațiile posibile ale firului complementar de ADN, cu etichete
fluorescente specifice pe bazele a 4-a și a 5-a. Apoi, octamerul legat este scindat după baza a 5-a,
unde eticheta fluorescentă este îndepărtată și următoarul ciclu de ligare poate începe. Așadar, în
prima etapă, bazele sunt stabilite pe pozițiile 4–5, 9–10, 14–15 etc. În următoarea etapă, un

5
primer este folosit cu o bază mai puțin pentru a secvenționa pozițiile 3–4, 8–9, 13–14 etc.

2.2.4. Ion Torrent

Aceasta metoda utilizeaza diferenta de pH pentru detectarea nucleotidelor. Când noua
nucleotidă este legată, la scindarea pirofosfată, eliberează un proton care este detectat prin
monitorizarea potențialului . Placa puțului asigură că protonul eliberat poate fi localizat si retinut.
Semnalul este proporțional cu cantitatea de protoni eliberați, ceea ce face posibilă secvențierea
regiunilor homopolimerice din ADN-ul șablon.
Colectarea datelor este realizata de un semiconductor complementar din oxid de metal
(CMOS) cip matrice de senzori, cu suprafața senzorului prezentă la fundul plăcii puțului. Aceste
cipuri pot măsura milioane pana la miliarde de reacții de secvențiere simultane [Bruijins,2018].
Metoda este mai rapida decat Illumina si mai putin costisitoare.

2.3. Secvențierea a treia generație

Tehnologiile de secvențiere cu molecule singulare (SMS) pot fi grupate în trei categorii.
 Prima categorie este metoda SBS, prin care molecule singulare de ADN -polimeraza sunt
observate în momentul cand se sintetizează o singură moleculă de ADN(PacBio).
 Tehnicile de secvențiere a nanoporilor reprezinta a doua categorie (de ex., Oxford
Nanopori)
 a treia categorie constă în metode care utilizează imagistica directă a moleculelor
individuale de ADN prin intermediul microscopiei avansate (de ex., VisiGen).
Pacific Biosistem - Metoda se bazează pe etichetarea fluorescentă și SBS, iar secvența este citită
în timp real. Această tehnică este potrivită pentru secvențierea de citire lungă.
Oxford Nanopori- Această metodă se bazează pe citirea semnalelor electrice care apar la
nucleotidele care trec prin porii de alfa-hemolizină legați covalent cu ciclodextrină. ADN-ul care
trece prin nanopor își schimbă curentul ionic. Această modificare depinde de forma, dimensiunea
și lungimea secvenței ADN. Fiecare tip de nucleotidă blochează fluxul de ioni prin por pentru o
perioadă diferită de timp. Metoda are un potențial de dezvoltare deoarece nu necesită nucleotide
modificate, totuși rezoluția cu o singură nucleotidă nu este încă disponibilă.

6
Tabelul 1.
Caracteristicile diferitelor tehnici de secvențiere (prima, a doua și a treia generație). Intervalul citirii de lungime
acoperă citirea de lungime de la introducerea tehnicii, până la citirea de lungime care poate fi obținută în zilele
noastre. Debitul și timpul de rulare sunt pentru mașina care are în prezent cea mai mare capacitate. Debitul, citirile și
secvența datelor; AB, Applied BiosystemsTM; em-PCR; LT, Life Technologies; SBS, sequencing by synthesis
[1,3,5,7–9, 15–17]

Generatie Metoda Lansare Tehnica Lungime de citire (nt) Debit și timp de rulare Comentarii
________________________________________________________________________________________________________________________________
I Sanger 1977 Clonarea/terminarea lanțului 25–1200 96, 84 Kb, 2 ore Comercializat prima dată de AB (acum LT)
II 454 2005 em-PCR/SBS/pyrosequencing 100–1000 1 mil, 0,7 Gb, 24 ore Achiziționat de Roche în 2007
Solexa/HiSeq/MiSeq 2006 Bridge PCR/SBS/terminare inversă 36–300 6 mld., 1,8 Tb, câteva zile Solexa achiziționat de Illumina în 2007
SOLiD R 2007 em-PCR/ligare/sonde 35–75 6 mld., 320 Gb, 1–2 săp Achiziționat de AB în 2006 (acum LT)
Ion Torrent 2010 em-PCR/SBS sensibil la ioni/schimbare pH 200–400 60–80 mil., 50 Gb, 2 ore Achiziționat de LT în 2010
III PacBio 2010 SMRT/ZMW puțuri 8000–20000 350000,7Gb, 0,5–6 ore
(Oxford) nanopore 2014 Deplasarea curentului ionic 9545–200000 100000, 2–4 Tb până la 48 ore

CAPITOLUL III
Markeri utilizati in criminalistica

Markerii STR sunt extrem de variabili si distribuiti uniform in tot genomul, numarul de
unitati repetate variind foarte mult intre specii. Sunt folositi in medicina legala pentru stabilirea
paternitatii, a relatiilor de inrudire,in identificarea infractorilor.
Unul dintre primele seturi standardizate care a primit cerere internațională în domeniul
criminalisticii a fost setul de de bază STR (short tandem repets). Acest kit a fost dezvoltat la
ordinul FBI cu efortul Promega Corporation și Applied Biosystems de a crea standarde de
identificare ADN pentru Baza de date națională ADN din SUA, cu scopul de a crește eficienţa
identificării în primul rând a personalului militar, a criminalilor și, de asemenea, persoanelor
dispărute. Locii inclusi în aceste kit-uri au devenit standardul mondial și au fost recomandati
pentru utilizare în toate laboratoarele criminalistice din întreaga lume.
Metoda tradițională de analiză STR folosind electroforeza capilară (CE) se bazează pe
determinarea numărului de unități repetate a markerului STR în funcție de dimensiunea
ampliconului PCR.
Analiza, in schimb, cu NGS permite să fie determinată secvența completă a produsului
PCR, inclusiv regiunea de repetare STR și împrejurimile zonei de flancare. Numeroase studii au
demonstrat că analiza STR bazată pe secvență, spre deosebire de analiza bazată pe dimensiunea
ampliconului, are ca rezultat o creștere pronunțată a variabilității alelelor pentru multe STR-uri
relevante din punct de vedere criminalistic.

7
 Capacitatea de a detecta variații de secvențe suplimentare de ADN în analiza markerilor
STR folosind tehnica de secvențiere paralelă masivă are un număr de alte avantaje. În primul
rând, precizia predicției este crescuta cu utilizarea acestor markeri pentru potrivirea sau calculul
relaţiilor .
În al doilea rând, problema așa-numitelor „allelics-stutter” ,cel mai frecvent artefact
observat în analiza markerilor STR este rezolvată cu mai mult succes.
In al treilea rând, în analiza unui amestec de probe de ADN, identificarea alelelor
suplimentare care ar fi fost mascate anterior din cauza aceleiași lungimi a diferitelor STR reduce
probabilitatea de coincidență aleatorie a profilurilor ADN ale diferiților indivizi prezente în
proba mixtă.
Utilizarea variațiilor suplimentare a markerului STR la un locus a fost cu succes demonstrat
pentru analiza unui amestec de probe. În plus, s-a arătat că numărul de citiri de secvențiere face
posibilă determinarea cu precizie a proporțiilor în care probele au fost amestecate.
Un avantaj notabil al analizei prin MPS mai degrabă decât CE este că separarea prin
dimensiunea ampliconului nu mai este o cerință pentru proiectarea testului STR multiplex;
aceasta înseamnă că toate STR-urile pot să fie amplificate folosind cea mai mică lungime
posibilă a ampliconului, îmbunătățind amplificarea în cazurile de ADN degradat și că numărul de
markeri amplificați simultan nu mai este constrâns de capacitățile de detectare a compusilor
fluorescenți ale sistemelor electroforetice .
O utilizare a acestui lucru ar fi să permită co-amplificarea de mari dimensiuni paneluri
de Y și autozomale STR, oferind putere crescută pentru analiza petelor mixte bărbați/femei, de
exemplu, in caz de o agresiune sexuala.
Analiza criminalistică modernă a probelor de ADN nu este limitata la markerii STR.
SNP-urile sunt folosite în criminalistică pentru testarea paternității/ ascendenței (de exemplu, cu
Y-SNP) și pentru a determina caracteristicile fenotipice ale unui individ .
Au frecventa cea mai ridicata dintre toti markerii.
Polimorfisme cu o singură nucleotidă sau variante cu o singură nucleotidă (SNP sau
SNV) au o serie de avantaje în analiza probelor ADN criminalistice degradate comparativ cu
markeri STR, deoarece pot fi utilizate fragmente de ADN mai scurte pentru a le determina.
De exemplu, posibilitatea de obținere a profilului complet ADN a 20 de markeri cu un singur
nucleotid ,din pete de sânge dintr-o probă pastrata pe termen lung (243 zile) a fost demonstrată,

8
în timp ce doar 9% din markerii STR ar putea fi testați pe aceleași mostre. În plus, pe baza
analizei de probe medico-legale din diferite țesuturi, în diferite stadii de degradare, a fost
demonstrată posibilitatea obținerii unui profil calitativ pe baza panelurilor SNP, în timp ce
genotiparea markerilor microsateliți nu a dat aproape niciun rezultat pozitiv . Mai mult, au fost
generate profilurile SNP complete pentru 16 (45%) din 36 de probe criminalistice diferite, pentru
care profiluri STR nu au putut fi obținute sau au fost de proastă calitate .
Markeri SNP sunt foarte eficienți pentru identificarea umană, arata posibilitatea de
prezicere a culorii ochilor, părului și pielii, precum și originea etnică, pe baza analizei
combinațiilor de haplotipuri de markeri SNP.
Unul dintre primele kituri comerciale disponibile pentru aplicație criminalistică a fost
ForenSeq DNA Signature Prep Kit (Verogen, CA), folosind Ilumina MiSeq FGx platforma de
secvențiere paralelă la scară largă, care permite detectarea a până la 231 de markeri simultan.
Al doilea jucător de frunte care operează în prezent piata si producerea de echipamente
MPS pentru criminalistica laboratoare este Thermo Fisher Scientific.
Compania a proiectat și lansat pentru platforma Ion Torrent numeroase paneluri pentru
identificare .
Când este disponibilă o cantitate limitată de ADN, mtDNA poate fi folosit pentru a obține
informații relevante din punct de vedere criminalistic, deoarece descendenţa maternă poate fi
investigată cu acest tip de ADN.
Există mai multe strategii PCR diferite pentru amplificarea genomului mitocondrial, fie
că este în două segmente lungi pentru amplificarea întregului genom a ADN-ului, fie multiple
fragmente mai mici pentru amplificarea întregului genom în probe parțial compromise sau mulți
ampliconi mici suprapusi pentru amplificare, fie a controlului regiune sau întreg genomul în
probe degradate.
Pe lângă multiplele copii prezente in celulă, alte avantaje ale mtDNA sunt absența
recombinării de-a lungul multor generații și acumularea mutațiilor în timp.
Avantajele analizei mitocondriale cu MPS includ sensibilitatea ridicată, detectarea mai
bună a heteroplasmiei și introducerea unei metode fezabile de secvențiere a întregului genom
mitocondrial din probe de criminalistică.
Analiza detaliată a genomul mitocondrial complet crește semnificativ puterea
discriminatorie a datelor obținute în comparație doar cu analiza regiunii de control.

9
 În plus, pentru probele sever degradate, folosirea metodei de captare a sondei-NGS
s-a dovedit a oferi rezultate chiar și în fața ADN-ului mitocondrial foarte vechi sau deteriorat .
Cu utilizarea Ion Chef pentru pregătirea șablonului și a Ion S5 pentru secvențiere în
combinație cu Precision ID mtDNA Whole Genome Panel, a fost posibilă secvențierea completă
a genomului mitocondrial.

CAPITOLUL IV
Concluzii

Utilizarea MPS pentru analiza criminalistică ADN pare a fi foarte promițătoare.

Nu doar un profil ADN cu markeri STR poate fi obținut, dar și strămoșii și fenotipul pot
fi determinate prin folosirea SNP-urilor.
Pe lângă ADN-ul autozomal, si mtDNA sau starea de metilare a ADN-ului pot fi
analizate cu sistemele MPS. Mai ales din probele de cantitate și calitate redusa, semnificativ mai
multe informații pot fi obţinute cu MPS decât cu tehnicile convenţionale.
Utilizarea MPS poate oferi informatii valoroase organelor de ancheta, care pot identifica
autorul unei fapte (de exemplu I se poate determina profilul –STR, culoarea ochilor-SNP, etc) ,
pot identifica cadavre cu identitate necunoscuta (din fragmente osoase degradate-mtADN).
Dezavantajele utilizarii MPS sunt costurile mari ale kit-urilor si aparaturii, durata foarte
mare a analizei, lipsa personalului instruit sa foloseasca aceasta tehnologie, a bazelor de date,
interpretarea lor.
In laboratoarele de Medicina –Legala din Romania, nu este folosita aceasta tehnica, din
cauzele mentionate mai sus, sunt folositi markeri STR –PCR si electroforeza capilara.

BIBLIOGRAFIE:

10
1. Alvarez-Cubero Maria Jesus, Maria Saiz, Belén Martínez-García, Sara M. Sayalero,
Carmen Entrala, Jose Antonio Lorente & Luis Javier MartinezGonzalez- Next generation
sequencing: an application in forensic sciences?- Annals of human biology, 2017
2. Brigitte Bruijns, Roald Tiggelaar,Han Gardeniers- Massively parallel sequencing
techniques for forensics: A review-Electrophoresis, 2018 ; 39, 2642–2654;
3. Cristophe Van Neste, Filip Van Nieuwebugh, David Van Hooftat, Dieter Deforce-
Forensic STR analysis using massive parallel sequencing- Forensic Science
International:Genetics ,2012, Pages 810-818
4. David Ballard & Jakub Winkler-Galicki & Joanna Wesoły- Massive parallel sequencing
in forensics: advantages, issues, technicalities, and prospects- International Journal of
Legal Medicine (2020)
5. Sobiah R, Syeda RH, Zunaira E, Nageen Z, Maria K, Syeda AZ, Shahana SM, Akifa M,
Abdul J and Muhammad RK*- Implications of Targeted Next Generation Sequencing in
Forensic Science-Journal of Forensinc Research (2018);
6. T. V. Tyazhelovaa, *, I. L. Kuznetsovaa, T. V. Andreevaa, b , S. S. Kunizhevaa, b , and
E. I. Rogaeva- Application of Massive Parallel Sequencing Technology in Forensics:
Comparative Analysis of Sequencing Platforms- Russian Journal of Genetics, 2021 ,Vol.
57, No. 12, pp. 1430–1442;
7. WaltherParson, DavidBallard , BruceBudowle, John M.Butler, Katherine B.Gettings,
PeterGill, LeonorGusmão, Douglas R.Hares, Jonathan L.King, Peter deKnijff,
NielsMorling, MechthildPrinz, Peter M.Schneider, Christophe VanNeste,
SaschaWilluweit, ChristopherPhillips- Massively parallel sequencing of forensic
STRs:Consideration of the DNA commission of the International Society for Forensic
Genetics (ISFG) on minimal nomenclature requirements- Forensic Science
International:Genetics,2016, pag.54- 63;

11